徐春奎 李艷 侯莉莉 張冷思

摘要?[目的]建立一種蔬菜中52種農(nóng)藥殘留快速前處理的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。[方法]52種目標農(nóng)藥添加至經(jīng)過破壁處理的空白基質(zhì)小青菜中，靜置24 h后，使用乙腈超聲提取，高速離心并以乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、無水硫酸鎂按1∶1混合凈化后上機檢測。[結(jié)果]在低（25 μg/kg）、中（50 μg/kg）、高（100 μg/kg）3種添加濃度水平下，樣品經(jīng)破壁處理后再采用改進的QuEChERS法前處理平均回收率為60.45%～114.01%，相對標準偏差（RSD）為0.20%～12.18%。[結(jié)論]該方法更簡單快速、準確高效、相對省時省力，且均符合檢測要求，可用于日常蔬菜中農(nóng)藥殘留的測定。

關(guān)鍵詞?破壁處理;QuEChERS;農(nóng)藥殘留;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;前處理

中圖分類號?TS207.5+3文獻標識碼?A

文章編號?0517-6611（2019）22-0200-06

Abstract?[Objective] The research aimed to establish a liquid chromatographytandem mass spectrometry method for the rapid pretreatment of 52 pesticide residues in vegetables.[Method]52 kinds of target pesticides were added to the blank substrate，which was treated with wallbreaking.After standing for 24 h，it was ultrasonically extracted with acetonitrile，centrifuged at high speed，and purified by 1：1 mixing with ethylenedia mineNpropylsilane （PSA） and anhydrous magnesium sulfate.[Result]Under the three levels of low，medium and high concentration，the average recovery of the sample after treatment with wallbreaking and improved QuEChERS method was 60.45%～114.01%，and the relative standard deviation （RSD） was 0.20%12.18%.[Conclusion]The method is simpler，faster，more accurate and more efficient，relatively timesaving and laborsaving，and all meet the testing requirements.It can be used for the determination of pesticide residues in daily vegetables.

Key words?Wallbreaking treatment;QuEChERS; Pesticide residues;UPLCMS/MS; Pretreatment

農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全事關(guān)人民群眾的身體健康，一直是社會關(guān)注的焦點和熱點問題，做好農(nóng)殘檢測工作是保障消費者買到安全放心的農(nóng)產(chǎn)品的重要手段。在農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全日益受到重視的同時，尋求一種更加簡便快速的農(nóng)藥殘留前處理方法顯得尤為重要。我國蔬菜中農(nóng)藥多殘留檢測現(xiàn)行有效的標準主要有NY/T 448—2001、NY/T 761—2008、GB 23200.113—2018、GB 23200.8—2016、GB/T 20769—2008等，檢測方法主要有分光光度法[1]、液相色譜法[2-3]、氣相色譜法[4-5]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[6-9]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-13]。分光光度法主要是定性分析，不能準確定量;色譜法主要參考NY/T 761—2008，由于蔬菜基質(zhì)比較復(fù)雜，基質(zhì)效應(yīng)較強，采用色譜法容易產(chǎn)生假陽性，且由于不同目標物必須選擇合適的檢測器，很難完成多類不同結(jié)構(gòu)的農(nóng)藥同時檢測;氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法雖然能準確定性，但檢出限、靈敏度、穩(wěn)定性以及定量均不夠理想。因而，常見的農(nóng)藥殘留檢測大多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。筆者以普通白菜（小青菜）為基質(zhì)，樣品經(jīng)破壁處理后再采用改進的QuEChERS法前處理，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜，建立簡便快速、準確檢測蔬菜中52種常見農(nóng)藥殘留的定性定量分析方法，從而為檢測人員提供參考。

1?材料與方法

1.1?儀器

液相色譜儀（安捷倫，1290）;三重四極桿質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）（安捷倫，6460c）;超聲波清洗機（寧波東芝）;旋渦混合器（艾卡公司，MS3）;離心機（賽默飛，ST16R）;振蕩器（常州榮華，HY-2A）;天平（艾德姆，HCB602H）;瓶口分液器（德國普蘭德）;固相萃取裝置（天津恒奧，HHE-12B）;氮吹儀（北京同泰聯(lián)，TTL-DCII）;破壁料理機（蘇泊爾）;普通料理機（博朗）;高速勻漿機（艾卡公司，T25 D S25）。

1.2?試劑?52種農(nóng)藥為3-羥基克百威、阿維菌素、啶蟲脒、涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、嘧菌酯、甲萘威、多菌靈、克百威、氯蟲苯甲酰胺、滅幼脲、氟啶脲、滅蠅胺、敵敵畏、苯醚甲環(huán)唑、除蟲脲、烯酰嗎啉、甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽（甲維鹽）、氯吡脲、吡蟲啉、滅多威、氧樂果、二甲戊樂靈、甲拌磷、甲拌磷砜、甲拌磷亞砜、辛硫磷、咪鮮胺、霜霉威、嘧霉胺、吡唑醚菌酯、蟲酰肼、噻蟲嗪、矮壯素、乙硫磷、仲丁威、氟硅唑、己唑醇、地蟲硫磷、撲滅威、異柳磷、甲基毒死蜱、異丙甲草胺、速滅威、久效磷、多效唑、抗蚜威、甲基嘧啶磷、吡蚜酮、喹硫磷、甲基硫菌靈，標準品溶液純度均不低于99%，均購買于農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津），用乙腈將52種農(nóng)藥配制成濃度為20 mg/kg的混合標準濃液（-20?℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

乙腈、甲醇為色譜純（天地），甲酸為優(yōu)級純，氯化鈉為分析純，無水硫酸鎂為分析純，石墨化碳黑和PSA （Aiglent），NH2柱（Aiglent）。

1.3?試驗設(shè)計

該試驗通過加標回收驗證檢驗檢測方法，思路為設(shè)3個濃度梯度，從低到高分別為25、50、100 μg/kg，每個濃度設(shè)3個平行樣。

1.4?樣品前處理過程

1.4.1?小青菜基質(zhì)制樣。同一批小青菜樣品均分為2組，一組通過破壁料理機處理，制成均質(zhì)試樣待用，另一組通過普通料理機處理，制成均質(zhì)試樣待用。

1.4.2?前處理。準確稱取10 g（精確到0.01 g）均勻試樣于50 mL離心管中，加入約2 g無水氯化鈉，準確加入10 mL的預(yù)冷乙腈（4?℃冷藏），渦旋混勻30 s，離心管平放，水平振蕩5 min，轉(zhuǎn)速330 r/min，冰浴超聲提取2 min（溫度控制在0～4 ℃），高速冷凍離心1 min（4?℃，8 000 r/min），上清液備用;將無水硫酸鎂和PSA按1∶1比例混合均勻適量灌注注射器，且連接0.22 μm有機系濾膜，取適量上清液（約1 mL）過濾裝樣品瓶備用。

1.5?色譜條件

色譜柱：Agilent C18 柱 （InfinityLab Poroshell 120 EC -C18 3.0?mm×150?mm，2.7-Micron）;流 動 相：A相為0.1% （V/V）甲酸水（含5 mmol/L的乙酸銨），B相為0.1%（V/V）甲酸甲醇（含5 mmol/L的乙酸銨）;梯度洗脫程序：0～1.0 min，從80%A變?yōu)?0%A，1.0～4.0 min，從40%A變?yōu)?5%A，4.0～10.0 min，從15%A變?yōu)?;10.0～14.0 min保持100%B，14.0～14.1 min，從0%A變?yōu)?0%A，14.1～15.0 min，保持80%A;流速0.4 mL/min;進樣量1.5 μL;時間15 min;柱溫30 ℃。

1.6?質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧正離子（ESI+）;毛細管電壓：40 kV;離子源溫度350 ℃;干燥氣流速10 L/min，霧化器壓力310.26 kPa;掃描方式：正離子;采集方式：動態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（Dynamic MRM）。質(zhì)譜采集參數(shù)見表1以及52種農(nóng)藥標準樣品的MRM總離子流色譜圖見圖1。

2?結(jié)果與分析

2.1?樣品經(jīng)破壁處理后再采用改進的QuEChERS法前處理效果評價

QuEChERS法自2003年由Anastassiades等[14]提出以來，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)獸藥殘留檢測分析[15-17]。因農(nóng)藥、蔬菜品種均較多，很難真正地尋找一種普適的農(nóng)藥殘留檢測的QuEChERS法。該試驗采用空白小青菜基質(zhì)經(jīng)過破壁處理和普通處理制樣進行對比，并通過加標回收試驗的方法，展開對改進的QuEChERS法前處理效果進行評價，回收率和RSD見表2。從表2可以看出，經(jīng)加標回收試驗，3個濃度梯度的加標回收率，對阿維菌素、啶蟲脒、涕滅威、涕滅威亞砜、多菌靈、克百威、氯蟲苯甲酰胺、氟啶脲、烯酰嗎啉、甲維鹽、吡蟲啉、氧樂果、甲拌磷亞砜、霜霉威、嘧霉胺、噻蟲嗪、乙硫磷、速滅威、抗蚜威、吡蚜酮20種農(nóng)藥來說，破壁處理和普通處理制樣效果差不多;對3-羥基克百威、涕滅威砜、甲萘威、苯醚甲環(huán)唑、氯吡脲、滅多威、二甲戊靈、甲拌磷砜、辛硫磷、吡唑嘧菌酯、矮壯素、氟硅唑、撲滅威、異柳磷、甲基毒死蜱、異丙甲草胺、久效磷、甲基嘧啶磷18種農(nóng)藥來說，破壁處理比普通處理組效果較好;對嘧菌酯、滅幼脲、滅蠅胺、敵敵畏、除蟲脲、甲拌磷、咪鮮胺、蟲酰肼、仲丁威、己唑醇、地蟲硫磷、多效唑、喹硫磷、甲基硫菌靈14種農(nóng)藥來說，破壁處理比普通處理組效果好。

在普通處理制樣后采用該試驗改進的QuEChERS前處理，滅蠅胺和矮壯素在低、中、高3種濃度水平的回收率均低于60%，分別為35%、50%左右，敵敵畏在低濃度水平以及甲拌磷、甲基毒死蜱、甲基硫菌靈在高濃度水平時回收率均低于60%。從整體上來說，2種處理組相比，破壁處理組加標回收率水平較好。主要原因可能是農(nóng)藥殘留于蔬菜，不僅存在于蔬菜表面，更有可能滲入組織細胞內(nèi)，提取時不容易釋放

出來，經(jīng)破壁處理后，破壞了蔬菜樣品的細胞壁結(jié)構(gòu)，有助于細胞內(nèi)容物溶出，這樣更有利于后續(xù)乙腈以及超聲提取出農(nóng)藥殘留，提高了農(nóng)藥殘留提取效率。同時制樣時樣品經(jīng)過破壁處理，后續(xù)提取步驟則無需再經(jīng)過勻漿操作，減少了檢測人員接觸有機溶劑的機會;提取過程中有機溶劑經(jīng)過預(yù)冷處理，超聲溫度控制在0～4 ℃，這樣有利于熱不穩(wěn)定農(nóng)藥殘留的提?。ㄖ饕怯袡C磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥）。

2.2?樣品凈化劑的選擇

樣品前處理過程中基質(zhì)干擾物去除情況，直接影響檢測效果以及儀器污染情況。因此，樣品前處理過程中對基質(zhì)的凈化選擇顯得尤為重要。該試驗選擇乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、無水硫酸鎂、石墨碳黑（GCB）三者按不同比例混合凈化基質(zhì)，但GCB對多菌靈、氯蟲苯甲酰胺、滅幼脲、氟啶脲、除蟲脲、甲維鹽、氯吡脲、吡蚜酮、吡唑醚菌酯有吸附，導(dǎo)致這9種農(nóng)藥回收率很低，最終以PSA∶無水硫酸鎂混合比例為1∶1凈化效果較好，無水硫酸鎂主要作為除水劑來除去樣品基質(zhì)中的水分，PSA是去除碳水化合物、脂肪酸、有機酸、酚類和色素等雜質(zhì)干擾。

2.3?流動相的選擇/凈化方式的選擇

試驗選擇水和甲醇作為流動相，并比較添加5 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水和甲醇均添加含5 mmol/L乙酸銨、0.1%甲酸時52種農(nóng)藥峰形更好、響應(yīng)信號更強，離子化效果更好（圖1）。

2.4?線性關(guān)系和定量限

52種農(nóng)藥標準曲線在6.25～200.00 μg/kg線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.99（表2），試驗分別以3倍信噪比和10倍信噪比考察了改進QuEChERS法的檢出限（LOD）和定量限（LOQ），52種農(nóng)藥的LOQ為3.0～6.0 μg/kg?（表2），結(jié)果表明該方法滿足農(nóng)藥殘留實際檢測的要求。

2.5?回收率和精確度試驗?該試驗采用普通白菜（小青菜）作為樣品基質(zhì)，每個樣品進行3個水平的加標回收試驗，加標水平分別為25、50、100 μg/kg，每個濃度梯度設(shè)3個平行試驗，按上述改進的QuEChERS法進行前處理，上液質(zhì)檢測分析，采用外標法進行定量分析。小青菜基質(zhì)在上述3種水平的回收率為60.45%～114.01%，RSD為0.20%～12.18%（表3），說明該方法的回收率和精密度均符合農(nóng)藥殘留相關(guān)檢測技術(shù)的要求。

2.6?實際樣品檢測?用該研究改進的QuEChERS方法對抽取的60份蔬菜樣品進行檢測，樣品品種覆蓋黃瓜、土豆、長豇豆、蘿卜、番茄、辣椒、西葫蘆、普通白菜、芹菜、茼蒿、莖用萵苣、藕、花椰菜、茄子14個品種，同時樣品經(jīng)破壁處理并采用GB/T 20769—2008方法[18]進行檢測對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表4），2種檢測方法結(jié)果相似，均檢出農(nóng)藥10種，超標農(nóng)藥1個（啶蟲脒），且數(shù)值接近（檢測數(shù)值超過線性范圍時，采用稀釋相同倍數(shù)后再檢測），說明該方法符合相關(guān)檢測技術(shù)的要求。

3?結(jié)論

該方法與GB/T 20769—2008相比，對QuEChERS前處理方法進行改進，樣品經(jīng)破壁處理取代常規(guī)普通料理機制樣，用超聲提取代替高速勻漿，并結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了常見52種農(nóng)藥的定性定量檢測方法。該方法操作更簡便快速，節(jié)省提取溶液、時間和人力，更適合批量處理，有助于檢測機構(gòu)準確檢測農(nóng)藥定性定量分析，并為日常監(jiān)控提供依據(jù)。

參考文獻

[1] 湯彤.速測卡法與酶抑制率法快速檢測蔬菜中農(nóng)藥殘留的對比研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2017，45（1）：102-104.

[2] 王敏，李廣益，宋豐江，等.高效液相色譜法測定蔬菜中氨基甲酸酯類農(nóng)藥[J].食品研究與開發(fā)，2018，39（1）：122-125.

[3] 李永新，孫成均，趙劍虹，等.高效液相色譜法同時測定蔬菜水果中的12種農(nóng)藥殘留[J].色譜，2006，24（3）：251-255.

[4] 林澤鵬，許少美，林晨，等.氣相色譜法對果蔬中氧樂果測定及結(jié)果分析[J].食品工業(yè)，2018，39（10）：310-312.

[5] 范力欣，李紅艷，錢訓.氣相色譜法快速測定農(nóng)藥產(chǎn)品中7種高毒有機磷類農(nóng)藥[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2017，16（3）：21-23，26.

[6] 劉苗，甘平勝，朱惠揚，等.全自動固相萃取-氣相色譜-三重四級桿質(zhì)譜法檢測蔬菜中23種農(nóng)藥殘留[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2016，28（4）：471-476.

[7] 李蓉，盧俊文，楊芳，等.基質(zhì)固相分散萃取-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定蔬菜中195種農(nóng)藥殘留[J].食品科學，2014，35（24）：301-307.

[8] 馬智玲，趙文，李凌云，等.氣相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定蔬菜水果中129種農(nóng)藥的殘留量[J].色譜，2013，31（3）：228-239.

[9] 范玉蘭，王星梅，薛珺，等.氣相色譜-負化學離子化-質(zhì)譜法同時分析果蔬中9種有機磷農(nóng)藥殘留[J].食品科學，2012，33（18）：198-201.

[10] 劉建國，孫慧，程昕，等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中多效唑等5種農(nóng)藥的分析方法[J].農(nóng)藥，2012，51（5）：358-359.

[11] 李娟，孫程鵬，侯穎，等.超高效液相色譜–電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜水果中27種常見農(nóng)藥殘留[J].現(xiàn)代農(nóng)藥，2011，10（3）：31-35，38.

[12] 張維一，張井，高晴盈，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定蔬菜中23種植物生長調(diào)節(jié)劑殘留[J].西北農(nóng)業(yè)學報，2019，28（2）：260-266.

[13] 花錦，陳勇，王靜慧，等.分散固相萃取-液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測蔬菜及水果中14種不易氣化的農(nóng)藥殘留[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2013（6）：75-77.

[14] ANASTASSIADES M，LEHOTAY S J，STAJNBAHER D，et al.Fast and easy multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and“dispersive solidphase extraction” for the determination of pesticide residues in produce[J].J AOAC Int，2003，86（2）：412-431.

[15] 林濤，邵金良，劉興勇，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蔬菜中41種農(nóng)藥殘留[J].色譜，2015，33（3）：235-241.

[16] 王連珠，周昱，陳泳，等.QuEChERS樣品前處理-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測 定蔬菜中66種有機磷農(nóng)藥殘留量方法評估[J].色譜，2012，30（2）：146-153.

[17] 方從容，高潔，王雨昕，等.QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定雞蛋中125種獸藥殘留[J].色譜，2018，36（11）：1119-1131.

[18] 龐國芳，李巖，范春林，等水果和蔬菜中450種農(nóng)藥及相關(guān)化學品殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法：GB/T 20769—2008[S].北京：中國標準出版社，2009.