楊雪 孫艷

摘 ?????要： 制備具有高選擇性和親和性的分子印跡聚合物（MIPs）是分子印跡技術(shù)發(fā)展的主要目標(biāo)。以蛋白質(zhì)等生物大分子為模板的分子印跡技術(shù)，面臨蛋白質(zhì)傳質(zhì)阻力大和蛋白質(zhì)分子印跡聚合物形成的印跡位點不精確的問題。可逆加成-斷裂鏈轉(zhuǎn)移（RAFT）聚合法作為活性可控自由基聚合的一種方法，單體選擇范圍廣且反應(yīng)條件溫和。通過RAFT法制備得到的MIPs具有結(jié)構(gòu)可控，形成位點均一等優(yōu)點，有利于形成高質(zhì)量的精確位點，增加選擇性和親和性。

關(guān) ?鍵 ?詞：分子印跡;蛋白質(zhì)印跡;可逆-加成斷裂鏈轉(zhuǎn)移;后功能化

中圖分類號：TQ 028; O658 ?????文獻標(biāo)識碼： A ??????文章編號： 1671-0460（2019）01-0077-04

Abstract： The preparation of molecularly imprinted polymers with high selectivity and affinity is the main objective in developing molecular imprinting technique. Molecular imprinting technique of proteins and other biomacromolecules is challenged by the difficulties in molecular diffusion and formation of high-quality imprints. As a kind of controlled radical polymerization， reversible-addition fragmentation chain transfer （RAFT） polymerization possesses properties of wide range of suitable monomers and mild reaction condition. The MIPs prepared by RAFT polymerization with controlled structures and homogeneity is beneficial to formation of high-quality accurate imprinting sites， which has advantages of improving selectivity and affinity.

Key words： Molecular imprinting; Protein imprinting; Reversible-addition fragmentation chain transfer （RAFT）; Post-functionalization

分子印跡技術(shù)是模擬抗原與抗體相互識別作用合成分子印跡聚合物（Molecularly imprinted polymers，MIPs），形成與模板分子的“形貌”互補的空穴，通過記憶效應(yīng)可對預(yù)定模板進行再吸附識別[1，2]。與昂貴且不易保存的天然抗體相比，MIPs具有成本低，制備過程簡單，穩(wěn)定性高，便于保存等特性[3]，雖然在有機溶劑中以小分子為模板的分子印跡技術(shù)取得了很大進展，但以蛋白質(zhì)等生物大分子為模板制備蛋白質(zhì)分子印跡聚合物面臨諸多困難[4-6]：首先，蛋白質(zhì)體積大，分子量高（大于10 KD），本身難以擴散，并且在交聯(lián)印跡層中傳質(zhì)阻力大，模板難以洗脫和再吸附;其次，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，構(gòu)型易變，對溫度、pH和溶液性質(zhì)敏感，不溶于有機溶劑，但用水做溶劑卻大大降低了模板與功能單體間作用力，不易形成高質(zhì)量的精確印跡位點。

通過抗原決定簇法[7，8]、表面印跡法[2，9，10]及納米尺度化[11]等方法可有效降低傳質(zhì)阻力，但如何提高MIPs的選擇性和親和性，制備具有高質(zhì)量印跡位點的MIPs仍是一個難題。目前采用的方法主要是先將模板蛋白質(zhì)通過共價作用或物理吸附至載體表面，因此其模板方向可控，合成印跡聚合物具有均一化的印跡位點。

制備蛋白質(zhì)MIPs的方法主要有溶膠-凝膠法[12，13]，多巴胺自聚法[14，15]，自由基聚合法[16]等。其中，活性可控自由基聚合法制得的聚合物結(jié)構(gòu)可控，有利于形成精確的印跡位點從而增強識別性能[17]。RAFT聚合法作為一種活性可控聚合的方法，通過加入二硫酯或三硫酯等鏈轉(zhuǎn)移試劑，使聚合反應(yīng)在活性增長自由基與休眠種（RAFT端基鏈）之間保持快速的動力學(xué)平衡，極大減少了自由基雙基終止的可能，RAFT聚合可調(diào)控聚合物的分子量和結(jié)構(gòu)，而且適用單體范圍廣，得到的分子量分布窄[18]。以上RAFT聚合法的特點為制備具有結(jié)構(gòu)可控，位點均一，有精確性印跡位點的MIPs提供了新思路。目前采用RAFT聚合法制備蛋白質(zhì)印跡聚合物主要有懸浮聚合，沉淀聚合和溶液聚合幾種方法。

1 ?懸浮聚合

采用懸浮聚合法制備MIPs簡單易行[19]，是指單體中溶解的交聯(lián)劑和引發(fā)劑以油相小液滴的形式懸浮在水介質(zhì)中，一個小液滴為本體聚合的一個單元，通過攪拌和分散性控制最終粒徑大小，由此可制備得到微米級的聚合物。

Yang等[20]首次將RAFT聚合應(yīng)用于蛋白質(zhì)分子印跡領(lǐng)域，首先利用小分子RAFT試劑，（4-氰基戊二酸）-4-二硫代苯甲酸酯（CAD）合成含多糖的大分子RAFT試劑。以甲基丙烯酸甲酯（MMA）為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯(lián)劑，再加入新合成的大分子RAFT試劑為油相;然后加入含有模板牛血清蛋白（BSA）的去離子水中，在40 ℃條件下通過機械攪拌制備得到粒徑為10～70 μm的BSA印跡微球粒子，將含糖聚合物鏈醇解為羥基后，親水性增加。通過與傳統(tǒng)自由基聚合得到的印跡粒子相比較，采用RAFT聚合制備的MIPs降低了非特異性吸附，并提高了選擇性。

2 ?沉淀聚合

沉淀聚合是指隨著聚合反應(yīng)的進行，聚合物的聚合度不斷增加，使其在有機溶劑中的溶解度逐漸降低，最終在溶劑中沉淀析出[21]。

Liu等[22]通過兩步聚合的方法合成了具有核-殼結(jié)構(gòu)的糖蛋白分子印跡納米粒子。首先以甲基丙烯酸（MAA）為單體，N，N-亞甲基雙丙烯酰胺（MBA）為交聯(lián)劑，用蒸餾沉淀法制備得到親水性納米核，并且表面可殘余大量雙鍵;然后加入2-（十二烷基硫代羰基硫基）-2-甲基丙酸（RAFT試劑），通過沉淀聚合在納米粒子表面制備了一層聚丙烯酰胺基苯硼酸殼層，通過RAFT聚合可控制聚合速率，增加丙烯酰胺基苯硼酸在親水核納米粒子表面的接枝率，最終得到具有核-殼結(jié)構(gòu)的納米粒子。由于具有苯硼酸基團，因此該納米粒子可對糖蛋白進行吸附。通過對糖蛋白辣根過氧化物酶（HRP）和非糖蛋白BSA吸附洗脫的測定結(jié)果表明，可對HRP進行特異性吸附，吸附量高，選擇性好，并且動力學(xué)快。

3 ?溶液聚合

溶液聚合法與沉淀聚合不同，從始至終單體和生成的聚合物均可以穩(wěn)定分散在溶劑中，是分子印跡領(lǐng)域中一種常用的方法，常用于在載體表面修飾蛋白質(zhì)印跡聚合物層。

3.1 ?“接枝到”（grafting to）法

“接枝到”（grafting to）法指的是RAFT試劑先在溶液中引發(fā)聚合，生成的聚合物通過SiO2納米粒子表面的羥基或者載體經(jīng)過預(yù)先修飾的功能基團與聚合物鏈具有特定相互作用，實現(xiàn)聚合物接枝到載體表面。

我國學(xué)者張玉奎課題組[23]將抗原決定簇法與RAFT聚合法相結(jié)合，以轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗原決定簇肽鏈為模板制備了可特異性識別轉(zhuǎn)鐵蛋白的印跡微球。首先將硅球用氨基硅烷修飾后，偶聯(lián)戊二醛，然后在硅球表面共價接枝轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗原決定基N端九肽鏈，固載模板后，在溶劑中加入功能單體、RAFT試劑和自由基引發(fā)劑引發(fā)聚合，洗脫模板肽鏈后得到了印跡微球。該微球?qū)δ０蹇乖瓫Q定基的印跡因子為1.89，對轉(zhuǎn)鐵蛋白的印跡因子為1.61;并且在轉(zhuǎn)鐵蛋白與細胞色素C的競爭吸附中對轉(zhuǎn)鐵蛋白的印跡因子遠高于細胞色素C，具有優(yōu)良的選擇性。

Zhao等[24]通過一步聚合的方法制備得到可以在活體細胞中選擇性吸附目標(biāo)蛋白的熒光磁性納米粒子。先將自由基引發(fā)劑固載至Fe3O4@SiO2納米粒子表面，然后在緩沖液中加入熒光單體和其它輔助功能單體，PEG化的親水性RAFT試劑，通過紫外引發(fā)，制備得到具有親水性的脫氧核糖核酸酶I印跡納米粒子。不僅可以用于活體細胞識別模板蛋白，而且可通過PEG的親水性及抗蛋白吸附性降低非特異性吸附，提高選擇性。

但由于該方法為溶液聚合，并不能保證后加入的RAFT試劑全部位于納米粒子外表面，導(dǎo)致聚合物殼層內(nèi)部具有一定量PEG，從而影響單體與目標(biāo)蛋白的相互作用，不利于形成高親和性印跡位點。除此之外，RAFT試劑被包埋也不利于對RAFT試劑端基再引發(fā)聚合或進行后功能化修飾。而grafting from法不具有這樣的缺點。

3.2 ?“接枝于”（grafting from）法

采用RAFT聚合制備MIPs可先將RAFT試劑通過不同方法固載至載體表面，使反應(yīng)在載體表面開始引發(fā)，聚合反應(yīng)結(jié)束后RAFT試劑仍處于聚合物外表面，有利于通過對RAFT試劑胺解或還原等反應(yīng)對MIPs進行后功能化修飾及應(yīng)用[25]。

由于離子液體可影響蛋白質(zhì)的水化環(huán)境，進而可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，因此在印跡蛋白質(zhì)時可以加入離子液體為功能單體。Qian等[26]用兩步聚合的方法以離子液體作為熱穩(wěn)定劑制備了溶菌酶印跡的微球。先用RAFT沉淀聚合的方法制備得到聚甲基丙烯酸微球，使得表面有一定量的RAFT試劑;然后用微球為載體，在緩沖溶液中以溶菌酶為模板蛋白，離子液體（chol dhp），丙烯酸羥乙酯（HEA）為功能單體，在75 ℃的條件下用過硫酸銨（APS）為熱引發(fā)劑引發(fā)聚合，在其表面成功修飾聚合物層，最終制備得到可特異性識別溶菌酶的印跡微球。與不加離子液體合成的印跡微球相比，該印跡微球印跡效果好，選擇性高。Gong等[27]采用與Qian等類似的方法制備可識別ADP-核糖化蛋白的印跡微球。同樣先通過RAFT沉淀聚合制備表面含有RAFT試劑的微球粒子;其創(chuàng)新點在于腺苷是ADP-核糖化蛋白最外表面的組成部分，可以在第二步聚合時以腺苷為模板，合成的印跡微球可對ADP-核糖化蛋白特異性選擇識別。該方法雖與抗原決定簇法類似，同樣可以降低傳質(zhì)阻力，但該方法有效避免了抗原決定簇在溶劑中有一定鏈柔性，造成構(gòu)象改變的不足。

Zhang課題組[28]以硅球（5 μm）為載體，先通過縮合反應(yīng)在表面固載RAFT試劑。然后以修飾成功的微球粒子為載體，以溶菌酶（Lyz）為模板蛋白，在水相中用氧化還原引發(fā)劑在40 ℃引發(fā)聚合，洗脫模板后，得到具有核-殼結(jié)構(gòu)的Lyz-MIPs微球。結(jié)果表明選擇性好，吸附動力學(xué)快;但載體為微米球，比表面積不高，形成印跡位點數(shù)有限，因此特異性吸附容量低（5 mg/g），而且使用的RAFT試劑帶有疏水性苯環(huán)，不利于在水體系中穩(wěn)定分散，也是導(dǎo)致吸附量不高的原因。

以上“接枝于”（grafting from）法得到的MIPs均為微米粒子，其比表面較低，吸附容量小。若以納米粒子為載體，通過提高比表面積可在很大程度上增加印跡位點數(shù)及吸附量。最近Boitard等[29]采用RAFT聚合在納米材料表面接枝一層較薄的聚合物層，合成具有核-殼結(jié)構(gòu)的印跡納米材料。以磁性Fe3O4納米粒子為載體，利用RAFT試劑的羧基基團與Fe3O4納米粒子的鐵離子形成配位作用使其固載至納米粒子表面。然后通過BSA與丙烯酰胺（AAm）單體在水中預(yù)聚合形成氫鍵后，將上述功能化的納米粒子分散在其中，加入交聯(lián)劑MBA，最后引發(fā)聚合，合成了BSA印跡的磁性納米粒子。通過不同聚合時間的各種表征數(shù)據(jù)表明RAFT聚合對殼層厚度及吸附性能具有可控性。在聚合時間為18 h時印跡效果最佳，對BSA的吸附量達到294 mg/g，并且通過測定與BSA相似性質(zhì)的兩種蛋白質(zhì)吸附表明該納米粒子對BSA具有特異吸附選擇性。

4 ?結(jié)束語

通過RAFT法制備得到的MIPs結(jié)構(gòu)可控，位點均質(zhì)化，有利于解決印跡位點不精確的問題，從而提高選擇性和親和性。用RAFT聚合法制備核-殼結(jié)構(gòu)的MIPs可降低傳質(zhì)阻力，在此基礎(chǔ)上將其納米尺度化增加印跡位點更有利于提高印跡效果。

雖然RAFT鏈轉(zhuǎn)移劑固載至載體表面較困難，但在聚合反應(yīng)結(jié)束后RAFT端基仍位于外表面，通過對RAFT試劑的氧化、還原、胺解或水解等反應(yīng)，為MIPs后功能化修飾及固載至傳感器表面進行蛋白質(zhì)分子的識別與定量檢測奠定了基礎(chǔ)。

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