董春曉，呂佳穎，牛驍麟，馬萬浩，李 飛，李發(fā)弟,2

（1. 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州 730020；2. 甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室，甘肅 民勤 733300）

來源廣泛、價(jià)格低廉的粗飼料是反芻家畜的主要基礎(chǔ)飼料，通常占日糧組成的60%～80%[1]。粗飼料中的纖維類物質(zhì)被瘤胃微生物利用后可發(fā)酵產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸(volatile fatty acids, VFA)，為動物機(jī)體活動提供能量，同時(shí)也能為機(jī)體的蛋白質(zhì)合成提供碳架和其他營養(yǎng)物質(zhì)[2]。研究粗飼料對瘤胃微生物的影響可為其在畜牧業(yè)中的進(jìn)一步開發(fā)利用提供重要依據(jù)。瘤胃微生物對飼料的發(fā)酵過程受日糧組成影響較大。高精料日糧中添加適量粗飼料能夠有效維持瘤胃功能，保持瘤胃正常pH，降低瘤胃酸中毒風(fēng)險(xiǎn)，促進(jìn)動物咀嚼和反芻[3]。有研究報(bào)道，隨著日糧精粗比的提高，肉牛瘤胃中乙酸含量顯著降低，丙酸和丁酸的含量顯著升高[4]；日糧粗飼料來源不同，則湖羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)也有差異，花生(Arachis hypogaea)藤處理組湖羊瘤胃中丙酸、丁酸及總VFA含量均顯著高于油菜(Brassica campestris)稈處理組[5]；日糧不同粗飼料組合可顯著影響瘤胃微生物多樣性[6]。對奶牛分別飼喂苜蓿(Medicago sativa) + 玉米(Zea mays)青貯和秸稈兩種不同粗飼料來源的日糧，苜蓿+玉米青貯處理組奶牛瘤胃中產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌和白色瘤胃球菌的數(shù)量顯著高于秸稈處理組[7]。李藝[8]將谷草和玉米黃貯以不同比例飼喂肉牛(10∶90、20∶80和30∶70)，谷草與玉米黃貯比例為20∶80的處理組肉牛瘤胃中擬桿菌門的相對豐度顯著高于另兩處理組。生產(chǎn)實(shí)踐中為有效對反芻動物進(jìn)行育肥，提高其肉用價(jià)值，常對其飼喂?fàn)I養(yǎng)價(jià)值高并易發(fā)酵的高淀粉日糧，導(dǎo)致動物瘤胃pH值降低，瘤胃酸中毒風(fēng)險(xiǎn)提高[9]。研究表明，日糧添加粗飼料不僅有利于反芻動物生產(chǎn)性能的提高，還能減少瘤胃食糜粘附，維持瘤胃健康[10]。

甘肅河西地區(qū)擁有豐富的農(nóng)副產(chǎn)品，其中，玉米秸稈、玉米芯、葵花籽殼和油菜秸稈來源廣泛、纖維含量較高。目前，關(guān)于此類農(nóng)副產(chǎn)品作為粗飼料時(shí)對育肥湖羊瘤胃健康的研究報(bào)道較少。本研究擬采用玉米秸稈、玉米芯、葵花籽殼和油菜秸稈分別作為湖羊日糧唯一粗飼料來源，探索其對育肥湖羊瘤胃發(fā)酵、瘤胃菌群結(jié)構(gòu)及肌肉脂肪酸組成的營養(yǎng)作用，為進(jìn)一步闡述其在反芻動物飼料應(yīng)用中的可行性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)羊購自甘肅三洋金源農(nóng)牧股份有限公司羊場，于2016年9月-12月在甘肅省民勤縣蘭州大學(xué)試驗(yàn)基地進(jìn)行飼養(yǎng)管理，各項(xiàng)常規(guī)指標(biāo)在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院反芻動物研究所進(jìn)行測定。

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選用120只2月齡左右、平均體重為22.9 ±1.2 kg的健康湖羊公羔為研究對象，根據(jù)體重相近原則隨機(jī)分成4組，每組5個(gè)欄位，每個(gè)欄位6只羊。4組試驗(yàn)羊分別飼喂以玉米秸稈(corn stalk,CS)、玉 米 芯(corn cob, CC)、葵 花 籽 殼(sunflower seed hull, SH)和 油 菜 秸 稈(rapeseed straw, RS)作 為粗飼料唯一來源的日糧，粗飼料配給比例均為20%，試驗(yàn)日糧配方及營養(yǎng)成分如表1所列。

表 1 日糧配方及營養(yǎng)水平(飼喂基礎(chǔ))Table 1 Formula and nutritional value of diets (per feed basis)

1.2 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)開始前，對所有羊只進(jìn)行體內(nèi)外驅(qū)蟲，并對羊舍進(jìn)行全面消毒。整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)77 d，預(yù)試期7 d，正試期70 d。每日于08:00和16:00飼喂各試驗(yàn)飼糧，精粗比為80∶20，所有羊只自由采食及飲水。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束后，每個(gè)欄位選擇體重接近該欄平均體重的3只羊進(jìn)行屠宰，共60只。禁食24 h，禁水2 h時(shí)，頸動脈放血屠宰。屠宰后將湖羊瘤胃分離出來，取出瘤胃內(nèi)容物2份，分裝在50 mL凍存管，-20 ℃冷凍保存，用于提取微生物DNA；將剩余內(nèi)容物用4層紗布過濾，收取瘤胃液置于20 mL凍存管，-20 ℃保存，用于VFA的提取測定。取湖羊右側(cè)倒數(shù)第1和2肋骨處背最長肌樣品200 g左右，真空包裝，-20 ℃保存，用于肌肉脂肪酸的提取。

1.4 測定指標(biāo)及方法

1.4.1 瘤胃液VFA的測定

參照Liang等[11]的方法提取瘤胃液VFA，利用氣相色譜(Thermo Scientific, TRACE 1300, Milan, Italy)測定其含量。測定條件：色譜分析柱為DB-FFAP毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為50∶1，進(jìn)樣口和檢測器溫度均為240 ℃，氫氣流率為35 mL·min-1，空氣流率為350 mL·min-1，載氣(N2)流率為20 mL·min-1，溫度設(shè)置為以25 ℃·min-1的速率將溫度從50 ℃升高到190 ℃保留2 min，再以10 ℃·min-1的升溫速率升高到200 ℃保留5 min，最后以10 ℃·min-1的升溫速率升高到220 ℃保留5 min。

1.4.2 微生物DNA的提取及分析

使用EZNA Stool DNA試劑盒(Omega Bio-tek,Norcross, GA, USA)提取微生物基因組DNA，方法參考說明書。每組選擇5只試驗(yàn)羊的微生物DNA樣品通過Illumina Hiseq 2500平臺進(jìn)行測序分析(百邁克生物科技有限公司，北京)。

1.4.3 肌肉脂肪酸的提取及分析

肌肉樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后利用冷凍干燥機(jī)(新芝生物，SCIENTZ-10ND，寧波)脫水，參考田華勤[12]的方法提取肌肉脂肪酸，利用氣相色譜(Thermo Scientific, TRACE 1300, Milan, Italy)測定含量。測定條件：色譜分析柱為HP-88毛細(xì)管色譜柱，進(jìn)樣量為1 μL，分流比為50∶1，進(jìn)樣口溫度為240 ℃，檢測器溫度為250 ℃，氫氣流率為40 mL·min-1，空氣流率為400 mL·min-1，載氣(N2)流率為20 mL·min-1，初始溫度為50 ℃，維持4 min，隨后以13 ℃·min-1的速度升至175 ℃維持27 min，再以3 ℃·min-1的速度升至215 ℃維持27 min。37種標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲基酯樣品均購于Sigma公司，用十九烷酸甲酯作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)方法

使用Excel 2013整理初始數(shù)據(jù)，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素方差分析(ANOVO)，檢測各組間差異的顯著性，利用Duncan法進(jìn)行多重比較。其中P ＜ 0.05表示結(jié)果差異顯著，P ＞0.05表示結(jié)果差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同粗飼料來源日糧處理中育肥湖羊瘤胃VFA的含量

不同粗飼料來源的日糧處理對育肥湖羊瘤胃中總揮發(fā)性脂肪酸(total volatile fatty acid, TVFA)濃度和單個(gè)VFA比例的影響如表2所列。CC組TVFA濃度顯著高于RS組(P ＜ 0.05)；CC組乙酸的比例顯著高于CS組和RS組(P ＜ 0.05)，后兩組間差異不顯著(P ＞ 0.05)，且此3組乙酸的比例均顯著高于SH組(P ＜ 0.05)；RS組丙酸的比例顯著低于其他3組(P ＜ 0.05)；RS組乙酸/丙酸顯著高于CS組和SH組(P ＜ 0.05)；RS組異丁酸的比例顯著高于CS組和SH組(P ＜ 0.05)，后兩組間差異不顯著(P ＞0.05)，且此3組異丁酸的比例均顯著高于CC組(P ＜0.05)；SH組丁酸的比例顯著高于CS組和CC組(P ＜0.05)，RS組丁酸比例顯著高于CC組(P ＜ 0.05)；RS組異戊酸的比例最高，CS組異戊酸的比例最低，各組間差異顯著(P ＜ 0.05)；SH組和RS組戊酸的比例顯著高于CS組和CC組(P ＜ 0.05)；其他組間差異不顯著(P ＞ 0.05)。

表 2 不同粗飼料來源對育肥湖羊瘤胃VFA比例的影響Table 2 Effect of roughage sources on rumen VFA proportion of finishing Hu lamb

2.2 不同粗飼料來源日糧處理中育肥湖羊瘤胃微生物多樣性

在97%的相似度水平下，各處理組α多樣性指數(shù)各異(表3)。通過Illumina Hiseq高通量測序得出，RS組湖羊瘤胃微生物DNA序列的分類操作單元(operational taxonomic unit, OTU)數(shù)目、物種豐富度指數(shù)Chao1和Ace均顯著高于其他3組(P ＜ 0.05)；CS組物種多樣性指數(shù)Simpson顯著高于SH組(P ＜0.05)；SH組和RS組物種多樣性指數(shù)Shannon顯著高于CS組和CC組(P ＜ 0.05)；其他組間差異不顯著(P ＞ 0.05)。而β多樣性主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA)結(jié)果顯示(圖1)，各試驗(yàn)組湖羊瘤胃菌群多樣性的相似性較低。

表 3 不同粗飼料來源對育肥湖羊瘤胃微生物α多樣性的影響Table 3 Effect of roughage sources on alpha diversity of the rumen microbes in finishing Hu lamb

圖 1 不同粗飼料來源組湖羊瘤胃群落PCoA分析圖Figure 1 PCoA analysis of the rumen community in Hu lamb following disposition to different forms of roughage

將OTU的代表序列與微生物參考數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對可得到每個(gè)OTU對應(yīng)的物種分類信息，進(jìn)而統(tǒng)計(jì)各水平上的樣品群落組成。在門水平上統(tǒng)計(jì)比例占序列總數(shù)的1%以上的菌門，結(jié)果如表4所列，各組中厚壁菌門和擬桿菌門均為含量最豐富的菌門。RS組湖羊瘤胃厚壁菌門的相對豐度顯著高于CC組(P ＜ 0.05)；CS組和CC組螺旋菌門的相對豐度顯著高于RS組(P ＜ 0.05)，CC組螺旋菌門的相對豐度顯著高于SH組和RS組(P ＜0.05)；RS組湖羊瘤胃纖維桿菌門的相對豐度顯著低于其他3組(P ＜ 0.05)；其他組間差異不顯著(P ＞0.05)。

在屬水平上統(tǒng)計(jì)比例占序列總數(shù)1%以上的菌屬(表5)顯示，RS組湖羊瘤胃Prevotella_1的相對豐度顯著高于SH組(P ＜ 0.05)；CC組Treponema_2的相對豐度顯著高于SH組和RS組(P ＜ 0.05)，CS組顯著高于RS組(P ＜ 0.05)；CC組Ruminococcus_1的相對豐度顯著高于SH組和RS組(P ＜ 0.05)；RS組Christensenellaceae_R-7、Ruminococcaceae_NK4A214和Candidatus_Saccharimonas的相對豐度均顯著高于CC組(P ＜ 0.05)；RS組Fibrobacter的相對豐度顯著低于其他3組(P ＜ 0.05)；SH組Bacterium的相對豐度顯著高于RS組(P ＜ 0.05)；CC組Olsenella的相對豐度顯著高于RS組(P ＜ 0.05)；CS組和CC組Roseburia的相對豐度顯著高于RS組(P ＜ 0.05)；其他組間差異不顯著(P ＞ 0.05)。

表 4 粗飼料來源對育肥湖羊瘤胃中主要菌門(相對豐度 ＞ 1%)水平的影響Table 4 Effect of roughage sources on the main phyla (relative abundance of ＞ 1%) of rumen microbial in finishing Hu lamb%

表 5 粗飼料來源對育肥湖羊瘤胃中主要菌屬(相對豐度 ＞ 1%)水平的影響Table 5 Effect of roughage sources on the main genus (relative abundance of ＞ 1%) of rumen microbial in finishing Hu lamb%

2.3 不同粗飼料來源日糧處理中育肥湖羊肌肉脂肪酸的含量

不同粗飼料來源的日糧對育肥湖羊肌肉脂肪酸含量的影響(表6)顯示，SH組湖羊肌肉中C10:0和C22:1n-9的含量顯著高于CC組(P ＜ 0.05)；SH組C18:2n-6的含量和多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid, PUFA)的總量顯著高于CS組(P ＜ 0.05)；其他組間差異不顯著(P ＞ 0.05)。

表 6 粗飼料來源對育肥湖羊肌肉脂肪酸含量的影響Table 6 Effect of roughage sources on muscle fatty acids quantity in finishing Hu lamb mg·g-1

3 討論

3.1 不同粗飼料來源的日糧處理對育肥湖羊瘤胃VFA的影響

反芻動物瘤胃微生物發(fā)酵可產(chǎn)生大量VFA，能為機(jī)體活動提供能量并維持瘤胃功能[13]。本研究中，4組試驗(yàn)羊瘤胃中的TVFA濃度范圍為15.29 ～22.73 mmol·L-1；該結(jié)果與劉婷等[14]以茴香(Foeniculum vulgare)秸稈為粗飼料來源測得的58.99～62.69 mmol·L-1，以及與沈美英[15]探究含70%～80%粗飼料來源測得的50.77～59.85 mmol·L-1的綿羊瘤胃濃度范圍有所不同。這可能是由于采樣時(shí)間和方法的差異所致，研究發(fā)現(xiàn)，綿羊采食后瘤胃內(nèi)TVFA濃度呈先上升后下降的變化趨勢，這主要是因?yàn)殡S時(shí)間的延長，動物瘤胃內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)生的VFA被瘤胃微生物利用，以及被瘤胃上皮吸收，從而導(dǎo)致TVFA濃度的降低[16]。本研究中，羔羊經(jīng)過數(shù)小時(shí)禁食，瘤胃內(nèi)的VFA大都被瘤胃上皮吸收，因此濃度偏低。RS組的瘤胃TVFA濃度顯著低于其他組別，可能是由于該組羔羊采食量較低，不能夠?yàn)榱鑫赴l(fā)酵提供充足的營養(yǎng)底物。

前人研究表明，VFA很大程度上受日糧類型的影響，如Corley和Murphy[17]通過體外發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高精料日糧發(fā)酵產(chǎn)生的丙酸和丁酸顯著高于高粗料日糧，而高粗料日糧發(fā)酵產(chǎn)生的乙酸、異丁酸、異戊酸和戊酸顯著高于高精料組；華金玲等[18]研究發(fā)現(xiàn)，相比精粗比為4∶6和5∶5的日糧，精粗比為3∶7的日糧組黃淮白山羊瘤胃中乙酸比例更高(P ＜ 0.05)，而精粗比為5∶5的日糧組山羊瘤胃中丙酸比例顯著高于其他兩組。本研究中，CC組試驗(yàn)羊瘤胃中乙酸的比例顯著高于其他3組，且除RS組外其余組別的丙酸比例無差異，這與劉大程等[19]研究不同品質(zhì)粗飼料日糧對蒙古綿羊瘤胃發(fā)酵的結(jié)論一致，可能是由于玉米芯木質(zhì)化程度較低，湖羊?qū)υ撎幚斫M飼糧中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)的消化率較高，使瘤胃pH升高，有利于纖維分解菌產(chǎn)生乙酸。瘤胃內(nèi)的戊酸和異戊酸比例是亞急性瘤胃酸中毒(subacute ruminal acidosis, SARA)的 重 要 指 標(biāo)[20-21]。本 研 究中，SH組和RS組瘤胃戊酸和異戊酸比例顯著高于CS組和CC組，說明飼喂葵花籽殼和油菜秸稈時(shí)，湖羊發(fā)生SARA的風(fēng)險(xiǎn)更高。另有研究指出，瘤胃中纖維分解菌的數(shù)量和戊酸利用率之間呈正相關(guān)關(guān)系[22]，說明CS組和CC組試驗(yàn)羊瘤胃內(nèi)纖維分解菌的數(shù)量相對較高。

3.2 不同粗飼料來源的日糧處理對育肥湖羊瘤胃微生物區(qū)系的影響

瘤胃微生物群落的多樣性受反芻動物品種、年齡和攝入日糧組成等多方面影響。其中，日糧成分越復(fù)雜，瘤胃微生物多樣性越高[23]。本研究中，RS組的OTU數(shù)目、微生物群落豐度和多樣性指數(shù)Chao1和Ace均顯著高于其他3組，說明油菜秸稈成分的復(fù)雜性可能更高。此外，PCoA圖分析結(jié)果顯示CC和CS組瘤胃群落與RS組瘤胃菌群有著較為明顯的差別，這表明試驗(yàn)羊喂以油菜秸稈時(shí)，對其瘤胃微生物組成有較大影響。對于優(yōu)勢菌群觀測發(fā)現(xiàn)，4組試驗(yàn)羊瘤胃中相對豐度最高的菌群均為厚壁菌門，其次為擬桿菌門。這與Kim等[24]利用16S rRNA基因測序技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)反芻動物瘤胃菌群中厚壁菌門(57.8%)和擬桿菌門(26.7%)在數(shù)量上占主導(dǎo)地位的結(jié)論相一致。由于油菜秸稈組飼糧NDF水平更低，可能導(dǎo)致了油菜秸稈組厚壁菌門的相對豐度顯著高于玉米芯組。厚壁菌門主要分解纖維，該菌門下梭菌綱占比最大，其中丁酸弧菌屬、醋酸弧菌屬和瘤胃球菌屬占有很大比例[25]。雖然本研究CC組瘤胃球菌屬的相對豐度顯著高于SH組和RS組，但可能因?yàn)楹癖诰T中其他菌屬如淀粉分解菌等的影響使CC組該菌門的相對豐度顯著降低。擬桿菌門是瘤胃中非纖維植物多糖和蛋白質(zhì)的主要分解者，其相對豐度與飼糧NDF水平呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[26]，該菌門中的普雷沃氏菌屬在反芻動物瘤胃中含量最高[27]，本研究結(jié)果與該結(jié)論一致。油菜秸稈組的普雷沃氏菌屬1的相對豐度顯著高于葵花籽殼組，但是普雷沃氏菌屬7的豐度較低，且該菌屬在不同組別的綿羊瘤胃中并未呈現(xiàn)規(guī)律性變化。該現(xiàn)象可能是由于不同種類的普雷沃氏菌在綿羊瘤胃中分別作用于飼料中的多糖、半纖維素及淀粉等成分，從而導(dǎo)致各組綿羊瘤胃中不同普雷沃氏菌屬的豐度有所差異。本研究CC組螺旋菌門相對豐度顯著高于SH和RS組，且與該菌門下密螺旋菌屬相對豐度的結(jié)果一致。研究指出密螺旋菌屬與果膠降解密切相關(guān)，相比淀粉，以果膠為唯一發(fā)酵底物時(shí)該菌屬的相對豐度增加了5倍[28]，且能夠與纖維分解菌互作而參與纖維素的降解[29]。因此，CC組飼糧可能為湖羊瘤胃中的密螺旋菌提供了較適宜的瘤胃環(huán)境，使其豐度增加。纖維桿菌屬是纖維桿菌門下的唯一菌屬[30]，RS組纖維桿菌的豐度顯著低于其余3組，表明在油菜秸稈日糧飼喂條件下，羔羊的瘤胃環(huán)境不利于纖維桿菌的生長。

3.3 不同粗飼料來源的日糧處理對育肥湖羊肌肉脂肪酸的影響

羊肉風(fēng)味、嫩度和多汁性等主要受肌肉脂肪酸的組成和含量的影響。研究表明，隨著綿羊體脂中C10:0含量的增加，其羊肉的膻味會隨之加重[31]。本研究中SH組試驗(yàn)羊的肌肉內(nèi)C10:0含量顯著高于CS和CC組，表明以葵花籽殼為粗飼料來源的日糧可能會導(dǎo)致羊肉膻味的增強(qiáng)。各組試驗(yàn)羊中，SH組試驗(yàn)羊肌肉中C18:2n-6含量最高，是由于該組日糧中C18:2n-6的含量最高，其被動物采食后沉積在肌肉中。PUFA可降低人類血樣脂蛋白中的膽固醇含量，以提高心腦血管疾病的抵抗能力[32]。本研究中，SH組試驗(yàn)羊肉中PUFA的含量顯著高于CS組，可能與瘤胃微生物的生物氫化作用有關(guān)。瘤胃中發(fā)揮生物氫化作用的微生物主要是纖維分解菌，研究表明，PUFA對纖維分解菌的增殖有抑制作用[33]，CS組羔羊肌肉中PUFA含量較低，說明該組羔羊瘤胃中纖維分解菌的數(shù)量可能相對較高。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，相比玉米秸稈日糧，玉米芯日糧顯著提高湖羊瘤胃中乙酸的比例，改善瘤胃環(huán)境，有利于纖維分解菌的增殖；葵花籽殼日糧顯著提高湖羊瘤胃中丙酸和戊酸的比例，湖羊發(fā)生SARA的風(fēng)險(xiǎn)更高，且該飼糧提高湖羊肌肉中C10:0的含量，會導(dǎo)致羊肉膻味的增強(qiáng)；油菜秸稈日糧顯著提高湖羊瘤胃微生物的物種豐富度和多樣性。