李丹丹，梁宗鎖，楊宗岐，韓蕊蓮

（西北農(nóng)林科技大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

紫花苜蓿(Medicago sativa)，多年生豆科牧草，原產(chǎn)于伊朗，其營養(yǎng)價(jià)值高，適口性好，素有“牧草之王”和“飼料皇后”的美稱[1-2]。紫花苜蓿主要分布在中國的西北、北部和東北部半干旱地區(qū)且在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有十分重要的價(jià)值和地位[3]。大量研究表明，干旱、低溫等逆境脅迫會(huì)嚴(yán)重影響紫花苜蓿的質(zhì)量和產(chǎn)量[4-5]。5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid，ALA)在植物代謝過程中發(fā)揮著重要的作用，是許多物質(zhì)合成的前提。有研究發(fā)現(xiàn)，噴施適度的ALA能夠提高番茄(Solanum lycopersicum)[6]、甘草(Glycyrrhiza uralensis)[7]、金蕎麥(Fagopyrum dibotrys)[8]、梔子(Gardenia jasminoides)[9]等幼苗的光合作用以及抗逆性。已有研究探究了干旱脅迫對(duì)3個(gè)苜蓿品種(農(nóng)牧806、雷達(dá)克、保定苜蓿)紫花苜蓿生理生化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)“農(nóng)牧806”相對(duì)于其他兩個(gè)紫花苜蓿品種而言抗旱性較弱。因此，本研究選取生長3個(gè)月的紫花苜?！稗r(nóng)牧806”為試驗(yàn)材料，通過噴施0、5、10、15、20、25 mg·L-1的ALA進(jìn)行處理，24 h后分別測定紫花苜蓿生理生化指標(biāo)，探討ALA對(duì)紫花苜蓿幼苗光合色素、抗氧化酶活性、活性氧系統(tǒng)以及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響，為紫花苜蓿栽培種植提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紫花苜?！稗r(nóng)牧806”種子購買自北京克勞沃草業(yè)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2018年9月4日至12月23日進(jìn)行，將紫花苜蓿“農(nóng)牧806”種子先用0.5%次氯酸鈉溶液消毒20 min，隨后用蒸餾水沖洗干凈，分別撒播在育苗盤上，表面覆土，定時(shí)澆水，當(dāng)幼苗培養(yǎng)至3葉期后，移苗至盛有混勻介質(zhì)(泥炭土∶珍珠巖∶蛭石 = 3∶1∶1)的營養(yǎng)盆(12 cm × 13 cm)中，定時(shí)澆水，每周灌溉一次1/2 Hogland營養(yǎng)液，室內(nèi)溫度控制在26 ℃，光照14 h·d-1，育苗3個(gè)月后，挑選生長一致的紫花苜蓿幼苗，開始試驗(yàn)處理。

噴施不同濃度(0、5、10、15、20、25 mg·L-1)ALA對(duì)紫花苜?！稗r(nóng)牧806”進(jìn)行處理，0為對(duì)照(CK)，噴至葉片不滴水為止(每株噴施10 mL)。整個(gè)試驗(yàn)過程保持不斷通氣。ALA處理24 h后，取各處理葉片進(jìn)行生理生化測定，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.3 試驗(yàn)方法

光合色素含量測定：采用Wellburn等[10]的方法在95%的乙醇中進(jìn)行提取，室溫下避光靜置樣品發(fā)白，然后在665、649和470 nm波長處測定吸光值。

可溶性蛋白含量(soluble protein，SP)測定：采用文獻(xiàn)[11]方法測定。

丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量測定：采用硫代巴比妥酸法測定[12]，并在532、600 nm處測定吸光值。

抗氧化酶活性測定：超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性采用Ries等[13]方法測定；過氧化物酶(peroxidase, POD)活性采用Nakano等[14]方法測定；過氧化氫酶(catalase, CAT)活性采用Chance等[15]方法測定；抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase, APX)活性采用維生素C氧化法[16]。

過氧化系統(tǒng)測定：-OH含量根據(jù)Liu等[17]的方法測定；H2O2含量根據(jù)Willekens等[18]的方法測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS18.0進(jìn)行方差分析，利用ANOVA中LSD和Duncan's多重比較測驗(yàn)，各處理間的顯著性差異檢驗(yàn)水平為P ＜ 0.05。采用GraphPad Prism6軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 噴施ALA對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片中光合色素含量的影響

噴施低濃度(5～10 mg·L-1)的ALA可以促進(jìn)紫花苜?！稗r(nóng)牧806”幼苗葉片中光合色素的合成(圖1)。噴施10 mg·L-1ALA后，紫花苜蓿幼苗葉片光合色素Chl a、Chl b、Chl a + b、Car較對(duì)照(CK，0 mg·L-1)分別顯著提高12.29%、36.21%、18.69%和11.46%(P ＜ 0.05)。而隨著ALA濃度的增加，紫花苜蓿葉片中光合色素含量顯著降低(P ＜ 0.05)，25 mg·L-1ALA處理后，紫花苜蓿幼苗葉片Chl a、Chl b、Chl a + b、Car含量降至最低，分別降低了54.11%、13.64%、56.51%和58.66%。

圖 1 噴施5-氨基乙酰丙酸(ALA)對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片光合色素含量的影響Figure 1 Effect of exogenous ALA (5-aminolevulinic acid) on the contents of photosynthetic pigments in alfalfa seedling leaves

2.2 噴施ALA對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片中抗氧化酶活性的影響

與對(duì)照(CK)相比，紫花苜?！稗r(nóng)牧806”葉片中SOD、POD、CAT活性在噴施外源ALA后，隨ALA濃度的增加，SOD、POD、CAT活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(圖2)。噴施10 mg·L-1ALA后，紫花苜蓿幼苗葉片中APX、CAT和POD活性達(dá)到了最高，與對(duì)照相比，APX、CAT和POD活性分別顯著增高了11.46%、225%、38.21% (P ＜ 0.05)，SOD在ALA濃度為5 mg·L-1時(shí)活性最高，比對(duì)照顯著增高了83.69%。而隨著ALA濃度的增加，紫花苜蓿葉片中抗氧化酶活性逐漸降低，噴施25 mg·L-1ALA后，紫花苜蓿幼苗葉片中APX和SOD活性降至最低，比對(duì)照分別顯著降低了58.66%和78%。

2.3 噴施ALA對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片中H2O2和-OH含量的影響

與對(duì)照相比，噴施ALA后，紫花苜蓿幼苗葉片中H2O2和-OH含量隨著ALA濃度的增加表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，在10 mg·L-1時(shí)降至最低，H2O2和-OH含量與對(duì)照相比分別顯著降低了6.20%和7.83% (P ＜ 0.05) (圖3)。而隨著ALA濃度的增加，紫花苜蓿“農(nóng)牧806”葉片中H2O2和-OH含量逐漸升高，H2O2含量在ALA濃度為25 mg·L-1時(shí)達(dá)到最高，與對(duì)照相比增加了3.87%。-OH含量則在ALA濃度為20 mg·L-1時(shí)其含量最高，但仍低于對(duì)照。

2.4 噴施ALA對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片中MDA含量的影響

與對(duì)照相比，噴施ALA后，紫花苜蓿幼苗葉片中MDA含量隨著ALA濃度增加表現(xiàn)出先降低后升高的趨勢，并在10 mg·L-1ALA濃度下降至到最 低，比 對(duì) 照 顯 著 降 低12.01% (P ＜ 0.05) (圖4)。而隨著ALA濃度的增加，紫花苜蓿幼苗葉片中MDA含量逐漸升高，25 mg·L-1時(shí)，MDA含量達(dá)到最大值，與對(duì)照相比升高了9.19%。

圖 2 噴施5-氨基乙酰丙酸(ALA)對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片APX、SOD、POD、CAT活性的影響Figure 2 Effect of exogenous ALA (5-aminolevulinic acid) on the activities of APX, SOD, POD, and CAT in alfalfa seedling leaves

圖 3 噴施5-氨基乙酰丙酸(ALA)對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片H2O2和-OH含量的影響Figure 3 Effect of exogenous ALA (5-aminolevulinic acid) on the contents of H2O2 and -OH in alfalfa seedling leaves

2.5 噴施ALA對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片中可溶性蛋白含量的影響

噴施ALA后，紫花苜蓿“農(nóng)牧806”葉片中可溶性蛋白含量與對(duì)照相比升高，并在5 mg·L-1ALA濃度增加至最大，比對(duì)照增加了3.02% (圖5)。隨著ALA濃度增加“農(nóng)牧806”葉片中可溶性蛋白含量逐漸降低，ALA濃度為20 mg·L-1時(shí)其含量降至最低，與對(duì)照相比降低了8.97%。

3 討論

圖 4 噴施5-氨基乙酰丙酸(ALA)對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片丙二醛含量的影響Figure 4 Effect of exogenous ALA (5-aminolevulinic acid)on the MDA content of alfalfa seedling leaves

圖 5 噴施5-氨基乙酰丙酸(ALA)對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片可溶性蛋白含量的影響Figure 5 Effect of exogenous ALA (5-aminolevulinic acid)on the soluble protein content of alfalfa seedling leaves

ALA 是葉綠素等卟啉化合物生物合成的關(guān)鍵前體，植物遭受逆境脅迫時(shí)，ALA參與植物的細(xì)胞代謝及生理過程[19]。研究表明，ALA是植物葉綠素合成的一個(gè)部分,可以提高植物的光合速率[20-21]。張春平等[22]研究發(fā)現(xiàn)，噴施不同濃度的ALA處理后，NaCl脅迫下黃連(Coptis chinensis)幼苗葉片中光合色素的含量顯著提高。本研究表明，噴施低濃度(5～10 mg·L-1) ALA可以促進(jìn)紫花苜蓿幼苗葉片中Chl a、Chl b、Chl a + b、Car的合成，而噴施高濃度(15～25 mg·L-1) ALA會(huì)抑制紫花苜蓿葉片中光合色素合成。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能是由于外源ALA提高了紫花苜蓿葉片的凈光合速率和氣孔導(dǎo)度，促進(jìn)了紫花苜蓿葉片中光合色素的積累。這與盧克歡等[23]提出的ALA可以調(diào)節(jié)植物葉綠素合成的觀點(diǎn)相一致。

當(dāng)植物長期處于逆境中時(shí)，植物中的抗氧化系統(tǒng)發(fā)揮作用，使得植物細(xì)胞中活性氧產(chǎn)生與清除能夠保持平衡；而當(dāng)逆境脅迫加重、細(xì)胞失水達(dá)到一定程度時(shí)，細(xì)胞中產(chǎn)生的活性氧超出清除系統(tǒng)的能力，植物就會(huì)產(chǎn)生氧化損傷[24]。本研究結(jié)果表明，噴施低濃度的外源ALA (5～10 mg·L-1)后，紫花苜?！稗r(nóng)牧806”葉片中APX、CAT、POD和SOD的活性顯著升高，而H2O2、-OH含量則與抗氧化酶活性變化相反，其含量顯著降低。與對(duì)照相比，噴施10 mg·L-1ALA后，紫花苜?！稗r(nóng)牧806”葉片中APX、CAT、POD和SOD的活性達(dá)到最大值。而噴施高濃度ALA (15～25 mg·L-1)后，紫花苜蓿“農(nóng)牧806”葉片中APX、CAT、POD和SOD的活性與對(duì)照相比顯著降低，H2O2、-OH含量則顯著升高，這表明高濃度的ALA不利于紫花苜蓿的生長。這與偶春等[9]的研究結(jié)果相一致。

MDA是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，當(dāng)植物處于不利環(huán)境中時(shí)，MDA含量可作為組織中自由基形成的可靠指標(biāo)，通過植物體內(nèi)MDA含量的變化了解組織中膜脂過氧化程度，以間接測定植物的抗逆性程度[25]。本研究表明，噴施低濃度的ALA后，紫花苜蓿幼苗葉片中MDA含量降低，隨著ALA濃度的增加，MDA含量逐漸升高。說明適度的ALA處理能夠減輕紫花苜蓿幼苗葉片中膜脂過氧化的產(chǎn)生，從而可以緩解逆境對(duì)紫花苜蓿細(xì)胞膜造成的傷害。

可溶性蛋白是植物體內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)之一。有研究表明，當(dāng)植物受到非生物因子脅迫時(shí)，可溶性蛋白含量會(huì)增加來提高細(xì)胞液的滲透壓，保護(hù)和調(diào)節(jié)植物的正常生長[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的ALA處理誘導(dǎo)了紫花苜蓿滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成，導(dǎo)致紫花苜?！稗r(nóng)牧806”幼苗葉片中可溶性蛋白含量升高。這與孫陽等[26]、周賀芳等[27]研究發(fā)現(xiàn)，噴施ALA可顯著增加玉米(Zea mays)、甜瓜(Cucumis melo)等幼苗葉片內(nèi)可溶性糖和可溶性蛋白含量。本研究與他人的研究結(jié)果相似。

4 結(jié)論

不同濃度的外源ALA對(duì)紫花苜蓿幼苗葉片的光合色素、抗氧化酶活性、過氧化系統(tǒng)、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)影響不同。噴施適度的ALA(5～10 mg·L-1)可以提高紫花苜?！稗r(nóng)牧806”幼苗葉片中Chl a、Chl b、Chl a + b、Car、SP的含量以及APX、SOD、POD、CAT的活性而降低過氧化系統(tǒng)(H2O2、-OH)以及MDA的含量。噴施高濃度(15～25 mg·L-1)的ALA抑制紫花苜蓿幼苗葉片中光合色素的合成，不利于紫花苜蓿“農(nóng)牧806”的生長。