曾旋 陸堅 徐宇翔 葉濤生

非結(jié)核分枝桿菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)是一種機(jī)會性致病菌，根據(jù)最新的原核生物名稱術(shù)語數(shù)據(jù)庫(http://www.bacterio.net)，已知NTM數(shù)量達(dá)190余種。其中，約1/3的菌種對人類具有致病性，可導(dǎo)致肺臟、淋巴結(jié)、關(guān)節(jié)、皮膚和軟組織等重要組織器官感染并引起全身播散性疾病[1-2]。NTM的傳播途徑包括經(jīng)空氣、水、土壤等，同時，也有報道稱奇美拉分枝桿菌(Mycobacteriumchimaera)通過手術(shù)室中支持體外心肺循環(huán)的加熱器或冷卻器感染心臟介入手術(shù)的患者[3]。在贊比亞、中國等國家，NTM在疑似結(jié)核病患者中的分離率分別為15.1%、5.4%～10.5%[4-5]；日本的分離率甚至高達(dá)27.5%，患病率為24/10萬[6]。由于抗結(jié)核和抗NTM的藥物治療方案存在差異，使用抗結(jié)核藥物治療NTM病可完全無效，結(jié)果延誤疾病診治。因此，準(zhǔn)確鑒定分枝桿菌菌屬菌種是實現(xiàn)精準(zhǔn)治療的前提，具有重要的臨床意義。筆者將就NTM鑒定技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定法

傳統(tǒng)細(xì)菌學(xué)鑒定主要基于分枝桿菌的形態(tài)和生理生化特征，包括萋-尼抗酸染色法、熒光顯微鏡檢法、傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法，以及應(yīng)用半自動培養(yǎng)系統(tǒng)、培養(yǎng)管式培養(yǎng)系統(tǒng)、全自動培養(yǎng)系統(tǒng)的快速培養(yǎng)法[7]。研究顯示，應(yīng)用培養(yǎng)系統(tǒng)的快速培養(yǎng)法平均報告時間為13.3～16.9 d，較固體培養(yǎng)基法的21.7 d縮短，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)[7]。Azadi等[8]總結(jié)了65篇對分枝桿菌鑒定的論文，發(fā)現(xiàn)痰涂片的敏感度為20%～70%，特異度為95%～98%；培養(yǎng)的敏感度為95%，特異度為98%。目前，分枝桿菌的分離培養(yǎng)仍是診斷分枝桿菌病的“金標(biāo)準(zhǔn)”，且是不同方法學(xué)應(yīng)用評價的參照標(biāo)準(zhǔn)。然而上述方法特異度低，不能將親緣關(guān)系密切的分枝桿菌菌種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定。同時，緩慢生長的分枝桿菌形成菌落需8～12周的時間，不利于臨床快速診斷。

二、菌體組成成分鑒定

基于菌體組成成分的NTM菌種鑒定方法主要包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜法(MALDI-TOF-MS)、免疫層析技術(shù)和色譜技術(shù)。MALDI-TOF-MS主要是根據(jù)菌體蛋白，在磁場的作用下產(chǎn)生不同的軌跡光譜，并與數(shù)據(jù)庫中的光譜進(jìn)行比對而得出菌種鑒定結(jié)果，具有高效、可靠、廉價的特點。目前，德國布魯克·道爾頓平臺最近更新的分枝桿菌庫V5.0版本共含有853個光譜，可鑒定159種分枝桿菌。法國梅里埃公司的 v4.12 RUO數(shù)據(jù)庫包含了1286個光譜，可鑒定45種分枝桿菌[9]。MALDI-TOF-MS鑒定菌種的準(zhǔn)確性與物種的親緣關(guān)系和參考光譜的覆蓋程度相關(guān)。Rodriguez-Temporal等[10]對240株NTM臨床分離株進(jìn)行鑒定，比較了分別應(yīng)用3.0版和2.0版分枝桿菌庫(德國布魯克·道爾頓平臺)的MALDI-TOF-MS法和PCR反向雜交法鑒定的準(zhǔn)確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3.0版對192株(80%)分枝桿菌準(zhǔn)確鑒定至35個菌種，比2.0版多鑒定出15株NTM，并且差異有統(tǒng)計學(xué)意義；PCR反向雜交法對175株(72.9%)菌株準(zhǔn)確鑒定至20個菌種。從而得出了MALDI-TOF-MS比PCR反向雜交法更能準(zhǔn)確鑒定NTM菌種的結(jié)論。另一項研究分別使用MALDI-TOF-MS法、PCR法和DNA-DNA雜交法對75株NTM進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MALDI-TOF-MS法能準(zhǔn)確鑒定產(chǎn)黏液分枝桿菌(Mycobacterium mucogenicum)，而上述其他方法則不能[11]。此外，根據(jù)菌體成分設(shè)計的檢測技術(shù)還有基于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MPB64分泌蛋白的免疫層析技術(shù)和基于菌體脂肪酸、分枝桿菌酸成分的色譜技術(shù)。

三、分子生物學(xué)技術(shù)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，目前對NTM進(jìn)行菌種鑒定開展的分子生物學(xué)技術(shù)項目主要包括PCR-測序、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)、實時熒光定量PCR、分子線性探針雜交技術(shù)(molecular line probe assay，LPA)、PCR-反向斑點雜交法、基因芯片技術(shù)、全基因組測序等。下文將對不同方法的實驗原理及其菌種鑒定報道進(jìn)行簡述。

1.PCR-測序：該技術(shù)主要依賴生物遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性，對特定的靶基因通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行測序，并與GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，最終得出菌種鑒定結(jié)果。目前常選用的靶基因包括rrs、ITS、hsp65、groES、recA、rpoB、dnaJ、oxyR、pncA、rnpB、sodA、gyrB、secA1。上述基因編碼產(chǎn)物分別為16S rRNA、轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域、熱休克蛋白-65、10-kDa伴侶蛋白、重組蛋白、DNA-定向RNA聚合酶β鏈、伴侶蛋白、過氧化氫誘導(dǎo)基因激活物、吡嗪酰胺酶/煙酰胺酶、核糖核酸酶P催化亞基、過氧化物歧化酶、DNA旋轉(zhuǎn)酶B亞基、前蛋白轉(zhuǎn)位酶[12]。韓國的Kim和Shin[13]選取16srRNA、hsp65、rpoB等3個基因片段，設(shè)計引物后分別對臨床分離的109株菌株提取DNA，進(jìn)行PCR、測序和序列比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)上述3個基因分別將71.30%、86.79%和81.55%的臨床分離株鑒定至菌種水平，3個基因聯(lián)合分析時鑒定率為97.50%。由于某些基因片段在不同NTM中同源性高，不能準(zhǔn)確鑒定至菌種，因此，同時分析多個基因片段進(jìn)行菌種鑒定是有必要的。

2. PCR-RFLP：該方法結(jié)合了PCR擴(kuò)增和限制性分析，常選取hsp65、rpoB、16SrRNA、ITS基因進(jìn)行擴(kuò)增，并通過限制性內(nèi)切酶酶切，進(jìn)行凝膠電泳后得到不同限制性片段譜帶，可結(jié)合軟件分析電泳圖譜，進(jìn)行菌種鑒定和同源性分析，具有簡便、快速、準(zhǔn)確、廉價的特點[14-15]。Nour-Neamatollahie等[14]以hsp65基因為靶基因，用限制性內(nèi)切酶Cfr13Ⅰ(Sau96Ⅰ)和 BstHHⅠ(CfoⅠ)對294 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行酶切，發(fā)現(xiàn)該方法對結(jié)核分枝桿菌和鳥分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacterium avium complex，MAC)進(jìn)行鑒定的特異度和敏感度均為100%。黃明翔等[16]選取rpoB為靶基因進(jìn)行擴(kuò)增后，單一應(yīng)用限制性內(nèi)切酶HaeⅢ可鑒定18種NTM，單一應(yīng)用限制性內(nèi)切酶MspⅠ可初步鑒定54種NTM，兩者聯(lián)合可將77種NTM鑒定至具體菌種。由此可見，聯(lián)合應(yīng)用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行菌種鑒定也有利于提高準(zhǔn)確性。

3.實時熒光定量PCR：基于核酸檢測的實時熒光定量PCR可應(yīng)用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針、分子信標(biāo)或TaqMan探針技術(shù)來對封閉系統(tǒng)中的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行連續(xù)檢測，具有低污染風(fēng)險和同時識別多個目標(biāo)的優(yōu)點[17]。此外，還有應(yīng)用肽核酸(PNA)探針的實時熒光定量PCR檢測。PNA是用不帶電的肽骨架人工合成的DNA類似物，具有良好的雜交性能和穩(wěn)定的化學(xué)、熱、生物性能。Choi等[18]為了評估PNA 探針實時PCR在檢測分枝桿菌復(fù)合體(MTBC)和NTM時的應(yīng)用，以培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)該方法對MTBC檢測的敏感度和特異度分別為96.7%(58/60)和99.6%(469/471)，對NTM的敏感度和特異度分別為69.0%(29/42)和100.0%(489/489)。

4.LPA：該方法又稱PCR-單鏈探針反向雜交試驗，目前該檢測方法包括比利時Innoge-netics公司分子線性探針法(INNO-LPA)、德國Hain Lifescience公司GenoType MTBDRplus法、自身免疫性診斷結(jié)核分枝桿菌耐藥分子線性探針法和反向雜交結(jié)核分枝桿菌耐藥分子線性探針法[19-20]。其中，GenoType MTBDRplus法又稱Hain test，目前臨床應(yīng)用廣泛。該方法采用商業(yè)試劑盒(CM/AS)，CM試劑盒可以識別15種分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌，而AS試劑盒則鑒別另16種不太常見的NTM。上述試劑盒的原理為針對23S rRNA基因區(qū)域的DNA擴(kuò)增，然后與固定在膜條帶上的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行反向雜交，以鑒定菌種[21]。Singh等[21]采用Hain test并使用CM/AS試劑盒對60株NTM進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)58株(96.7%)NTM被正確鑒定。

5.PCR-反向斑點雜交法：該方法是利用生物素等標(biāo)記的探針和特異性擴(kuò)增PCR產(chǎn)物(靶DNA序列)雜交快速檢測某基因的測試，并通過顯色鑒定菌種。Wu等[22]對27株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和340株臨床分離的分枝桿菌作為研究菌株，比較了PCR-反向斑點雜交法、傳統(tǒng)鑒定方法和測序鑒定菌種的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)PCR-反向斑點雜交法與測序鑒定菌種相比較，其準(zhǔn)確率達(dá)99.1%。

6.基因芯片技術(shù)：該技術(shù)是在一塊基片表面固定序列已知的靶核苷酸的探針，利用核酸探針雜交的原理，與提取的菌種核酸擴(kuò)增產(chǎn)物且被擴(kuò)增為帶有熒光分子的 DNA片段進(jìn)行雜交，通過熒光顯色而進(jìn)行菌種鑒定，具有快速、靈敏、特異的特點。唐曙明等[23]選取ITS建立的基因芯片技術(shù)對23種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和9種非分枝桿菌菌株鑒定，特異度為100%。Srilohasin等[24]則基于51個單核苷酸多態(tài)性基因位點(SNPs)開發(fā)的基因芯片，擁有99.85%的基因分型檢出率，100.00%轉(zhuǎn)化率，99.75%的再現(xiàn)率，99.85%的準(zhǔn)確率，能夠在6 h內(nèi)檢出MTBC，顯示出該技術(shù)的簡單、靈活、快速。此外，還有基于gyrB、16SrRNA等基因的核苷酸序列開發(fā)的基因芯片技術(shù)[25]。

7.全基因組測序：自從1977年第一代DNA測序技術(shù)(Sanger法)發(fā)展至今，已出現(xiàn)第四代測序技術(shù)[26]。目前用于菌種鑒定的全基因組測序技術(shù)為二代測序技術(shù)，作為菌種鑒定的“金標(biāo)準(zhǔn)”，該技術(shù)存在花費高、耗時長的缺點，主要用于科學(xué)研究，不利于臨床應(yīng)用[27]。

四、展望

目前，傳統(tǒng)鑒定技術(shù)存在敏感度低、耗時長的缺點，然而，由于其花費低，仍被廣泛應(yīng)用于臨床。與傳統(tǒng)鑒定方法相比，MALDI-TOF-MS和分子生物學(xué)技術(shù)已大大提高NTM鑒定的準(zhǔn)確率，其中MALDI-TOF-MS、實時熒光定量PCR、LPA、基因芯片等方法已在大型醫(yī)院或結(jié)核病?？漆t(yī)院應(yīng)用，但仍存在儀器設(shè)備價格昂貴或技術(shù)要求高等缺點，不利于充分推廣。未來，建立一種快速可靠、成本低廉、操作簡便的標(biāo)準(zhǔn)化體系是鑒定NTM的趨勢。