陳蔚，余鈴，陳敬騰，夏露，郭衛(wèi)春

骨肉瘤是來源于間葉組織的惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，生長(zhǎng)迅速且惡性程度高，預(yù)后極差［1］。20世紀(jì)70年代新輔助化療的引入使病人5年生存率提高到65%～70%，保肢手術(shù)的開展也使病人生存質(zhì)量得到顯著改善［2］。但是出現(xiàn)化療耐藥和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病人仍預(yù)后不良，5年生存率不足20%［1，3］。因而尋找更加有效的針對(duì)骨肉瘤的治療藥物具有十分重要的意義。

Hippo通路是一種進(jìn)化上高度保守的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過控制細(xì)胞增殖和凋亡起到調(diào)節(jié)器官大小和維持組織穩(wěn)態(tài)的作用。經(jīng)典Hippo信號(hào)通路核心成分有哺乳動(dòng)物STE20樣蛋白激酶1/2（mammalian STE20-like protein kinase 1/2，MST1/2）、接頭蛋白Salvador同源物1（Salvador homolog 1，SAV1）、大腫瘤抑制基因1/2（large tumour suppressor 1/2，LATS1/2）和 MOB 激酶活化劑 1（Mob kinase activator 1，MOB1），Yes-相關(guān)蛋白 1（Yes-associated protein 1，YAP1）。其中YAP1為Hippo信號(hào)通路下游的轉(zhuǎn)錄共激活因子，通過調(diào)節(jié)各種轉(zhuǎn)錄因子的活性參與細(xì)胞增殖、凋亡、化療耐藥和血管生成等過程［4-5］。目前越來越多研究證實(shí)YAP1在許多惡性腫瘤中高表達(dá)，并且參與腫瘤發(fā)生、發(fā)展以及復(fù)發(fā)。Wang等［6］發(fā)現(xiàn)YAP1可以調(diào)節(jié)骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力及其對(duì)化療藥物的敏感性，表明YAP1可能是治療骨肉瘤的潛在藥物靶點(diǎn)，尋找針對(duì)YAP1的抑制劑有望為治療骨肉瘤病人帶來新的曙光。

維替泊芬是一種苯并卟啉類衍生物光敏劑，臨床上用于治療新生血管性黃斑變性［7］。然而有研究表明維替泊芬可作為非光敏激活劑治療多種疾?。?］，如維替泊芬能抑制YAP1基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，在沒有光激活的情況下破壞YAP1與靶蛋白TEA轉(zhuǎn)錄因子（TEADs）相互作用，從而調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡，如乳腺癌和前列腺癌等［9-10］。但目前尚未見維替泊芬作用于骨肉瘤的報(bào)道。本研究于2018年6月至2019年3月觀察不同濃度維替泊芬對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、侵襲及轉(zhuǎn)移能力的影響，初步探究了維替泊芬抗骨肉瘤作用的相關(guān)分子機(jī)制，以期為維替泊芬治療骨肉瘤提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料人骨肉瘤MG63細(xì)胞購于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫上海保藏中心（批號(hào)TCHu124）。維替泊芬購于Selleck公司（批號(hào)S1786），DEME高糖培養(yǎng)基購于美國(guó)Hyclone公司（批號(hào)SH30022.01），新生胎牛血清購于Gibco澳洲公司（批號(hào)10099-141）；1%雙抗（青霉素 100 U/mL，鏈霉素 100 μg/mL）（批號(hào)G4003）、二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)D2650）和胰蛋白酶（批號(hào)G4004）購于武漢賽維爾生物科技有限公司；人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽（CCK-8）試劑盒購于南京碧云天公司（批號(hào)C0038）；膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒與細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒（批號(hào)KGA108-1，KGA511）購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；8.0 μm孔徑TranswellTM小室（批號(hào)PI8P01250）、聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜，批號(hào)ISEQ00010）均購于Millipore公司；兔抗人Yes相關(guān)蛋白1（YAP1，批號(hào)4912S）、TEA轉(zhuǎn)錄因子1（TEAD1，批號(hào)D9X2L）、磷酸化Yes相關(guān)蛋白1（pYAP1，批號(hào)D9W2I）、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin，批號(hào)13E5）抗體均購于美國(guó)CST公司；實(shí)驗(yàn)所用儀器包括自動(dòng)酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀和倒置顯微鏡。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 骨肉瘤MG63細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%新生胎牛血清，1%青霉素（100 U/mL）及鏈霉素（100 μg/mL）的DEME高糖培養(yǎng)液中，放置在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨肉瘤MG63細(xì)胞以5×104/mL濃度接種于96孔板上，每孔100 μL，孵育24 h待細(xì)胞貼壁后加入不同濃度的維替泊芬（0、2、4、6、8、10 μmol/L），分別培養(yǎng)24、48、72 h，然后每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)孵育2 h，用自動(dòng)酶標(biāo)儀測(cè)量每孔細(xì)胞在450 nm波長(zhǎng)的吸光度值。所有試驗(yàn)均進(jìn)行3次。

1.2.3 細(xì)胞周期檢測(cè) 不同濃度維替泊芬（0、2、4、6、8 μmol/L）處理骨肉瘤MG63細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，用冷磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌2次，用70%乙醇固定1 h后再用PBS洗滌1次，然后用200 μL冷PBS重懸細(xì)胞，再加入1 mg/mL核糖核酸酶A（RNase A）和50 μg/mL PI，混勻后避光孵育30 min，隨即用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布。

1.2.4 細(xì)胞凋亡分析 不同濃度維替泊芬（0、2、4、6、8 μmol/L）處理骨肉瘤MG63細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，用冷PBS洗滌2次，1 000 r/min離心5 min后去上清，將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，混勻，避光孵育15 min，然后再加入400 μL結(jié)合緩沖液，隨即用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。

1.2.5 劃痕實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG63細(xì)胞，以每孔5×104個(gè)接種于12孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)到完全融合后，用無菌100 μL槍頭在每個(gè)孔底劃出1條直線，PBS洗滌2次，用倒置顯微鏡拍照后，分別加入無血清DMEM高糖培養(yǎng)基，并調(diào)整維替泊芬濃度為0、2、4、6、8 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后用倒置顯微鏡觀察劃痕-愈合度，拍照記錄，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，按下列公式計(jì)算細(xì)胞遷移率：

1.2.6 TranswellTM侵襲實(shí)驗(yàn) 將TranswellTM小室放入24孔板中，每孔上室加入50 μL稀釋后的基質(zhì)膠（無血清DMEM培養(yǎng)基稀釋），然后于37℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，吸出基質(zhì)膠表面的液體。收集維替泊芬處理過的骨肉瘤MG63細(xì)胞，重懸后加入上室，每孔細(xì)胞約4×104個(gè)，下室加入500 μL含150 mL/L胎牛血清的完全培養(yǎng)基。各組上室中分別加入DMSO、終濃度為2、4、6、8 μmol/L的維替泊芬后，于37℃恒溫?zé)o菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取出小室，應(yīng)用無菌棉簽擦去小室內(nèi)殘留的細(xì)胞，甲醛中固定20 min，然后用PBS清洗，后加入結(jié)晶紫染色10 min，晾干后于倒置顯微鏡下觀察濾膜底附著的細(xì)胞數(shù)，統(tǒng)計(jì)侵襲細(xì)胞數(shù)。每組隨機(jī)選取5個(gè)視野（×100），每組實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.7 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot） 不同濃度維替泊芬（0、2、4、6、8 μmol/L）處理MG63細(xì)胞48 h后用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，吸取40 μg蛋白行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉于室溫封閉1.5 h，加入相應(yīng)一抗孵育4℃條件下孵育過夜。濾膜經(jīng)TBS緩沖液漂洗3次后加入相應(yīng)二抗，室溫?fù)u床孵育2 h。在暗室中將PVDF膜用發(fā)光劑顯色曝光后分析結(jié)果，β-actin蛋白條帶作為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以xˉ±s表示，采用單因素方差分析進(jìn)行組間比較，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 維替泊芬抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖CCK-8結(jié)果顯示，隨著維替泊芬作用時(shí)間延長(zhǎng)和使用濃度增加，其細(xì)胞活力不斷下降，24、48、72 h的半抑制濃度（IC50）分別為（6.592±0.121）μmol/L、（4.668±0.075）μmol/L、（2.953±0.078）μmol/L。說明在0～10 μmol/L濃度區(qū)間內(nèi)，維替泊芬可以呈時(shí)間、濃度依賴性地抑制MG63細(xì)胞的增殖。其中24 h內(nèi)各濃度下（2、4、6、8、10 μmol/L）細(xì)胞存活率分別為：（81.43±1.70）%、（73.50±1.34）%、（56.10±1.56）%、（39.17±0.78）%、（33.27±8.1）%；48 h內(nèi)各濃度下（2、4、6、8、10 μmol/L）細(xì)胞存活率分別為：（75.63±1.30）%、（56.87±1.43）%、（44.67±1.83）%、（28.37±0.93）%、（22.97±1.30）%；72 h內(nèi)各濃度下（2、4、6、8、10 μmol/L）細(xì)胞存活率分別為：（63.2±0.90）%、（41.40±1.40）%、（24.00 ± 1.28）%、（17.30 ± 1.28）%、（8.40 ±1.47）%。見圖1。

圖1 維替泊芬抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞增殖

2.2 維替泊芬導(dǎo)致骨肉瘤MG63細(xì)胞周期阻滯流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示。與對(duì)照組相比，不同濃度的維替泊芬處理24 h后，處于G0/G1的細(xì)胞比例顯著上升，G2/M期細(xì)胞比例變化不明顯，而S期細(xì)胞比例則明顯降低，且呈濃度相關(guān)性。這一結(jié)果提示維替泊芬可以導(dǎo)致骨肉瘤MG63細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。其中24 h內(nèi)各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）G0/G1期比率分別為：（43.33±0.89）%、（57.33±0.89）、（66.67 ± 0.88）%、（72.67 ± 0.88）%、（86.00 ±1.53）%（F＝236.61，P＜0.05）；各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）S期比率分別為：（36.33±1.21）%、（23.67±0.88）%、（14.67± 0.88）%、（8.33±0.88）%、（4，33±1.53）%（F＝194.82，P＜0.05）；各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）G2/M期比率分別為：（19.00±0.58）%、（16.67±0.88）%、（20.00±1.73）%、（19.33±0.88）%、（18.33±0.81）%（F＝1.42，P＝0.30）。見圖2。

圖2 不同濃度維替泊芬影響MG63細(xì)胞周期分布

2.3 維替泊芬誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理MG63細(xì)胞24 h后，采用Annexin V/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理24 h均可誘導(dǎo)MG63細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01），且凋亡率隨著維替泊芬濃度的增加而逐漸增高。各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）細(xì)胞凋亡率分別為：（6.19±0.52）%、（8.02±0.43）%、（10.95±0.95）%、（25.44±0.40）%、（32.19±0.82）%（F＝302.68，P＜0.05）。見圖3。

圖3 維替泊芬處理MG63 24 h后對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡率的影響

2.4 維替泊芬抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞遷移和侵襲細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理MG63細(xì)胞后遷移率均降低，6 μmol/L和8 μmol/L維替泊芬處理組開口區(qū)域明顯增寬，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（見圖4A）。同樣，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示維替泊芬處理后MG63細(xì)胞侵襲性下降，其中6 μmol/L和8 μmol/L處理組較對(duì)照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）（見圖4B）。其中各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）劃痕閉合率分別為：（48.33 ±0.88）%、（42.33 ± 2.60）%、（40.00 ± 2.87）%、（36.67 ±3.18）%、（28.00±3.79）%（F＝6.99，P＝0.006）。各濃度下（0、2、4、6、8 μmol/L）細(xì)胞侵襲數(shù)分別為：（137.00±5.29）個(gè)、（124.67±6.77）個(gè)、（115.67±6.17）個(gè)、（110±5.13）個(gè)、（87.33±3.71）個(gè)（F＝11.25，P＝0.001）。

2.5 維替泊芬抑制YAP1及其相關(guān)靶基因的表達(dá)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)YAP1及TEAD1表達(dá)的變化。結(jié)果顯示，不同濃度（0、2、4、6、8 μmol/L）維替泊芬處理MG63細(xì)胞24 h后，YAP1及其轉(zhuǎn)錄因子TEAD1的表達(dá)水平均降低（P＜0.05），而磷酸化YAP1表達(dá)水平不變（見圖5），提示維替泊芬能抑制MG63細(xì)胞的YAP1及其下游靶基因TEAD1表達(dá)。

3 討論

越來越多研究表明細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路介導(dǎo)骨肉瘤耐藥，如磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）、Notch、Wnt/β-catenin 及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn) 蛋 白（GLUT1）等［11-14］。有文獻(xiàn)報(bào)道Hippo信號(hào)通路參與骨肉瘤耐藥過程，且其關(guān)鍵分子YAP1可能成為骨肉瘤治療的藥物靶點(diǎn)［6］，尋找Hippo信號(hào)通路上游藥物作用靶點(diǎn)抑制劑有望為骨肉瘤治療帶來新的希望。

圖4 維替泊芬處理MG63 24 h后對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞遷移（A）與侵襲（B）的影響

圖5 維替泊芬對(duì)骨肉瘤MG63細(xì)胞Yes-相關(guān)蛋白1（YAP1）、磷酸化Yes-相關(guān)蛋白1（pYAP1）、TEA轉(zhuǎn)錄因子1（TEAD1）蛋白表達(dá)的影響：A為蛋白電泳圖；B為量化圖

目前維替泊芬作為非光敏劑治療多種腫瘤的研究引起許多學(xué)者的注意［8］，蔣玉林等［9］研究證實(shí)維替泊芬可抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，而Al-Moujahed等［15］證實(shí)維替泊芬可抑制膠質(zhì)瘤LN229和SNB19細(xì)胞體外生長(zhǎng)。然而關(guān)于維替泊芬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的影響還尚未有報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探究了維替泊芬對(duì)骨肉瘤細(xì)胞株MG63細(xì)胞增殖和凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)維替泊芬能夠抑制MG63細(xì)胞的增殖，使MG63細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期，并促進(jìn)其凋亡，且均呈濃度依賴性，這與Zhang等［11］在胰腺導(dǎo)管腺癌中的研究結(jié)果相一致。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬對(duì)MG63細(xì)胞的遷移及侵襲能力具有抑制作用，且呈濃度依賴性。

近年來，越來越多研究表明維替泊芬作為YAP1抑制劑在治療各種腫瘤中發(fā)揮著重要作用［16］。YAP1作為Hippo通路的核心效應(yīng)蛋白，可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)通過與TEAD1蛋白以及其他轉(zhuǎn)錄因子形成復(fù)合物，觸發(fā)下游靶基因如Areg的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤形成［4］。研究表明維替泊芬能夠作用于YAP1-TEAD1復(fù)合物，破壞其結(jié)構(gòu)后預(yù)防致癌性生長(zhǎng)達(dá)到抑制腫瘤的作用［16］。Liu等［17］研究證實(shí)，體內(nèi)高表達(dá)YAP1或者失活神經(jīng)纖維瘤?、蛐停∟F2）會(huì)引起肝臟組織過度生長(zhǎng)，而采用維替泊芬治療后肝臟的生長(zhǎng)速度受到抑制。Brodowska等［18］研究視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存能力機(jī)制時(shí)，發(fā)現(xiàn)維替泊芬能夠干擾YAP1-TEAD1復(fù)合物的形成，從而延長(zhǎng)癌細(xì)胞的倍增時(shí)間。李美嬌等［19］研究發(fā)現(xiàn)維替泊芬通過下調(diào)YAP1、TEAD1表達(dá)抑制鼻息肉細(xì)胞生長(zhǎng)；Wei等［10］也發(fā)現(xiàn)維替泊芬通過摧毀YAP1-TEAD1復(fù)合物可以抑制胰腺導(dǎo)管腺癌存活、血管生成及仿血管發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)了維替泊芬處理后YAP1、pYAP1、TEAD1的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示YAP1、TEAD1表達(dá)下調(diào)，而pYAP1表達(dá)不變，與上述研究結(jié)果相符，表明維替泊芬可能通過下調(diào)YAP1、TEAD1，阻止YAP1與TEAD1相結(jié)合，抑制MG63細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力，而促進(jìn)其凋亡。

但是本研究也存在一些缺陷。首先，本研究?jī)H采用了一種骨肉瘤細(xì)胞系進(jìn)行研究，是否適用于其他骨肉瘤細(xì)胞系及原代骨肉瘤細(xì)胞尚需進(jìn)一步研究；其次，本研究沒有進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，是否在體內(nèi)同樣具有良好的效果值得進(jìn)一步探討；另外，本研究設(shè)置的觀察時(shí)間和濃度范圍較窄，雖然發(fā)現(xiàn)了時(shí)間、濃度依賴性，但不能排除可能存在平臺(tái)期和峰值濃度，尚需深入研究。