談芳君,金 措，唐曉琳

(甘肅省第三人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

0 前言

以拉曼光譜為代表的光譜分析技術(shù)因具有無創(chuàng)、快捷、操作方便等特點，為生物體內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)提供了“指紋”信息，近年來受到越來越多國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[1].已有的多項研究表明，拉曼光譜技術(shù)的“指紋”特性可以反映生物體病變前后DNA、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂類等諸多生物大分子含量及精細結(jié)構(gòu)和振動結(jié)構(gòu)的變化，故有望在分子水平上對疾病進行診斷[2].卵巢癌是一類常見的婦科惡性腫瘤，死亡率高居女性生殖道腫瘤的首位.由于大部分患者早期缺乏特征性臨床表現(xiàn)，不易引起患者注意，故早期診斷有一定難度.患者發(fā)病時多已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，治療效果差、死亡率高，嚴(yán)重威脅著女性的生命健康及生活質(zhì)量[4].本文利用拉曼光譜技術(shù)對卵巢癌的光譜特征進行研究，為建立一種卵巢癌臨床篩查和預(yù)后監(jiān)測的方法提供理論依據(jù).

1 材料和方法

1.1 實驗材料

卵巢癌SKOV3細胞株購自中國科學(xué)院上海細胞庫.細胞培養(yǎng)所需的RPMI 1640、胎牛血清均購自美國Gibco公司.LRS-III 型拉曼光譜儀為天津市港東科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品.

1.2 血清標(biāo)本

選取2015年9月～2018年6月于甘肅省第三人民醫(yī)院住院且簽署了知情同意書的卵巢癌患者38例作為實驗組，年齡在35～61歲之間，平均年齡47±9歲.38例患者均有完整的病理診斷資料，經(jīng)病理活檢證實為卵巢癌，且所有患者術(shù)前均未行放療或化療.另選取來我院行健康體檢且簽署知情同意的健康成人25例作為對照組，年齡在33～65歲，平均年齡45±11歲，兩組資料之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義.

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng)

SKOV3細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640完全培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中分組培養(yǎng)及傳代.

2.2 實驗儀器參數(shù)設(shè)置

光源：半導(dǎo)體激光器；激光源波長：532 nm；功率：40 mW；入射、出射狹縫寬度：0.10 mm；掃描步長：0.1 nm；負高壓：8；積分時間：150 ms.實驗均在暗室中由同一人操作完成.

2.3 樣品采集及保存

所有卵巢癌患者入院后(實施手術(shù)前)取5 mL空腹外周血，常溫靜置4h后4 000 r/min離心10 min，取上層血清2.0 mL于EP管內(nèi)，-20℃凍存?zhèn)溆?手術(shù)后第3天再次取5mL空腹外周血，提取2 mL血清.同樣的方法提取健康對照組成人空腹外周血血清2 mL，-20℃保存待測.

SKOV3細胞融合度達到80%左右時用胰蛋白酶消化，RPMI 1640完全培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)調(diào)整細胞密度為5.0×105個/mL接種至6孔板，每組6孔，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中分別繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h、72h后取細胞上清液，以正常RPMI 1640完全培養(yǎng)基為對照.

2.4 樣品處理

將制備好的樣品從-20℃冰箱取出置于室溫下自然解凍，待完全溶解后用一次性注射器小心吸出并沿樣品管管壁緩慢注入，注意清除氣泡，隨后將樣品管固定于樣品架上.調(diào)節(jié)開關(guān)使自然光照射到樣本上，同時調(diào)整控制器移動樣本臺，使焦點聚集至樣品管，允許激光通過并屏蔽白光.完成上述步驟后按設(shè)置的參數(shù)獲得不同波數(shù)下的拉曼光譜，重復(fù)幾次并記錄數(shù)據(jù).

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料采用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

3 結(jié)果

3.1 卵巢癌患者與健康對照組血清拉曼光譜比較

實驗結(jié)果見圖1，在1 034 nm、1 238 nm、1 326 nm、1 466 nm、1 671 nm 5個波長上卵巢癌患者血清均檢測到重復(fù)性好的拉曼峰，健康對照組的1 238 nm處拉曼峰不明顯，但與健康對照組對比，卵巢癌患者血清在5個波長處的拉曼峰值均顯著增高(P<0.05)，將5個波長處拉曼峰進行Pearson相關(guān)分析，具體數(shù)值見表1.

圖1 健康成人與卵巢癌患者血清拉曼光譜

3.2 卵巢癌患者術(shù)前、術(shù)后血清拉曼光譜比較

圖2結(jié)果表明，將38例卵巢癌患者手術(shù)前后血清的拉曼光譜進行配對分析，發(fā)現(xiàn)在719 nm、 1140 nm、1238 nm和1479 nm 4個波長處手術(shù)后的拉曼峰明顯低于手術(shù)前(P<0.05).將4個波長處拉曼峰進行Pearson相關(guān)分析，結(jié)果見表2.

圖2 卵巢癌患者手術(shù)前后血清拉曼光譜

3.3 卵巢癌細胞培養(yǎng)基拉曼光譜比較

不同培養(yǎng)時間卵巢癌細胞培養(yǎng)基與正常RPMI 1640培養(yǎng)基的拉曼光譜結(jié)果見圖3.由此可見，正常對照組僅在843 nm、1 000 nm、1 477 nm處檢測到拉曼峰，而培養(yǎng)24 h、48 h和72 h的卵巢癌細胞培養(yǎng)基在735 nm、843 nm、1 000 nm、1 190 nm、1 246 nm、1 477 nm 6個拉曼頻移處均可觀察到重復(fù)性較好的拉曼峰，與正常RPMI 1640培養(yǎng)基相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01).對24 h、 48 h和72 h卵巢癌細胞培養(yǎng)基的6個波長處拉曼峰進行Pearson相關(guān)分析，其相關(guān)系數(shù)分別為0.961、0.969、0.958、0.961、0.947和0.955(見表3)，表明卵巢癌細胞培養(yǎng)基的拉曼峰值與培養(yǎng)時間呈正相關(guān)(P<0.05).

4 討論

拉曼散射是1928年由印度科學(xué)家Raman在研究液態(tài)苯和四氯化碳時發(fā)現(xiàn)的一種散射現(xiàn)象，即分子對入射光會產(chǎn)生大幅度的頻率變化[5].隨后，以拉曼效應(yīng)為基礎(chǔ)建立了拉曼光譜分析法，尤其是20世紀(jì)60年代激光器的出現(xiàn)，為拉曼散射提供了理想光源，從而使拉曼光譜的研究應(yīng)用得到了長足發(fā)展.由于基于激光的拉曼光譜原理是物質(zhì)分子的拉曼頻移入射光與散射光之間的頻率差，反應(yīng)物質(zhì)內(nèi)部分子的振動和轉(zhuǎn)動能級特性，故通過拉曼光譜可以從分子結(jié)構(gòu)上了解物質(zhì)的構(gòu)成、特性及其變化規(guī)律[6].近年來，激光拉曼光譜已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，多項研究表明在胃癌[7]、腸癌[8]、肺癌[9]、鼻咽癌[10]、乳腺癌[11]、宮頸癌[12]、皮膚癌[13]等多種腫瘤中，癌組織與正常組織存在拉曼光譜差異.研究還發(fā)現(xiàn)癌組織在某些特定波長處的譜線較正常組織顯著增高，形成明顯的拉曼波，這種差異對于疾病的早期診斷具有重要價值，其診斷靈敏度和特異度甚至超過90%[14].

圖3 不同培養(yǎng)時間卵巢癌細胞培養(yǎng)基與正常RPMI 1640培養(yǎng)基的拉曼光譜

通過研究發(fā)現(xiàn)，在1 034 nm、1 238 nm、1 326 nm、1 466 nm、1 671 nm 5個波長上卵巢癌患者血清均檢測到重復(fù)性好的拉曼峰，健康對照組患者1 238 nm處拉曼峰不明顯，且與健康對照組對比，卵巢癌患者血清在5個波長處的拉曼峰值均顯著增高，提示拉曼光譜技術(shù)可以檢測出卵巢癌患者與健康成人血清中某些代謝產(chǎn)物分子結(jié)構(gòu)或含量的變化，體現(xiàn)出兩者之間的差異，有潛力成為卵巢癌早期篩查的新方法.同時，對于卵巢癌術(shù)前、術(shù)后拉曼光譜改變的對比分析還發(fā)現(xiàn)，在719 nm、1 140 nm、1 238 nm、1 479 nm 4個波長處手術(shù)后的拉曼峰明顯低于手術(shù)前，提示拉曼峰的高低可能與腫瘤本身的存在具有一定相關(guān)性，基于這個推測，拉曼光譜也許可作為監(jiān)測卵巢癌療效判斷及預(yù)后的參考指標(biāo)之一，即以卵巢癌患者手術(shù)前的拉曼峰作為自身基礎(chǔ)對照，對術(shù)后的拉曼峰值進行動態(tài)觀察，拉曼峰如有顯著增高，即使患者無明顯自覺癥狀也考慮可能存在隱匿病灶或復(fù)發(fā)可能性.具體臨床應(yīng)用價值還有待進一步研究及大宗樣本的長期隨訪觀察.除此之外，針對卵巢癌SKOV3細胞培養(yǎng)基拉曼波的研究表明，卵巢癌細胞培養(yǎng)基在735nm、843 nm、1 000 nm、1 190 nm、1 246 nm、1 477 nm 6個拉曼頻移處可觀察到重復(fù)性較好的拉曼峰，均高于正常RPMI 1640培養(yǎng)基，且拉曼峰值與培養(yǎng)時間呈正相關(guān).推測是由于癌細胞本身代謝異常，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象、核酸結(jié)構(gòu)或含量發(fā)生改變進而引起分子振動形成疊加所致.提示拉曼光譜對卵巢癌體外研究的可能.

綜上所述，拉曼光譜是一種無創(chuàng)、快捷、操作方便的分析技術(shù)，有望成為包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤性疾病早期篩查、療效判斷、預(yù)后評估的檢測手段，具有重要的臨床實用價值.