戴 維,趙 燕,趙成進(jìn)*

(1陜西省人民醫(yī)院急診外科,西安 710068;2西安市中心醫(yī)院腎內(nèi)科;*通訊作者,E-mail:958714744@qq.com)

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,其嚴(yán)重威脅人類(lèi)生命健康,尋找安全、有效的治療方法,延長(zhǎng)結(jié)直腸癌患者的生存時(shí)間是目前急需解決的問(wèn)題[1]。藤黃酸是從中藥藤黃中分離出來(lái)的一種單體,也是藤黃中的主要活性成分[2]。最近的研究報(bào)道顯示,藤黃酸有抗結(jié)直腸癌功效,其可誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生自噬和凋亡[3],但其具體作用機(jī)制尚未完全闡明。Wnt/β-catenin是經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路,研究發(fā)現(xiàn),在結(jié)腸癌中抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可抑制腫瘤細(xì)胞增殖，抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲轉(zhuǎn)移,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[4-6];此外,有研究表明,藤黃酸通過(guò)調(diào)控腎癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)通路影響腎癌進(jìn)展[7]。但藤黃酸能否調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的自噬和凋亡尚未可知。因此,本研究以結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)對(duì)象,觀察藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響,初步探索其分子機(jī)制,以期為藤黃酸治療結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用提供理論資料。

1 材料與方法

1.1 藤黃酸

藤黃酸CAS號(hào)為2752-65-0,純度>95%,購(gòu)自上海純優(yōu)生物科技有限公司。

1.2 主要試劑

結(jié)直腸癌Caco2細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)；C-caspase-9抗體、β-catenin抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司；C-caspase-3抗體、LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體、Beclin 1抗體、C-caspase-9抗體、GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam；c-myc抗體購(gòu)自上海賽信通生物試劑有限公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)Caco2細(xì)胞。培養(yǎng)條件為37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的細(xì)胞培養(yǎng)箱。每隔1 d更換一次培養(yǎng)液,當(dāng)細(xì)胞匯合度約為80%時(shí)用胰酶消化傳代。

1.4 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Caco2細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)液中加藤黃酸,使藤黃酸終濃度為0,1.5,3.0,6.0 mg/L,依次標(biāo)記為0 mg/L組、1.5 mg/L組、3.0 mg/L組、6.0 mg/L組,培養(yǎng)48 h,用0.25%胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞,檢測(cè)細(xì)胞凋亡。檢測(cè)步驟如下:用冰預(yù)冷的PBS溶液將細(xì)胞重懸洗滌2次,加結(jié)合緩沖液500 μl將細(xì)胞配制成單細(xì)胞懸浮液,加入PI以及Annexin Ⅴ-FITC染色液,混合均勻,室溫避光條件下孵育15 min,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡水平。

1.5 β-catenin、c-myc、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin 1、C-caspase-3、C-caspase-9蛋白檢測(cè)

取對(duì)數(shù)期的結(jié)直腸癌細(xì)胞,在細(xì)胞培養(yǎng)液中添加藤黃酸,使藤黃酸終濃度為0,1.5,3.0,6.0 mg/L,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,在細(xì)胞中添加0.25%的胰蛋白酶消化,收集細(xì)胞,在細(xì)胞中添加蛋白提取試劑,將混合液放在冰上充分裂解5 min,以細(xì)胞刮刀將各組細(xì)胞收集,以超聲處理10次,每次1 s。4 ℃,10 000 r/min離心15 min,取上清分裝。按照BCA方法測(cè)定蛋白濃度。蛋白在進(jìn)行SDS-PAGE電泳前同等體積的上樣緩沖液混合,沸水浴5 min使細(xì)胞蛋白充分變性。SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)NC膜,5%牛血清白蛋白溶液中,室溫反應(yīng)2 h,加一抗,4 ℃過(guò)夜，加二抗，室溫孵育2 h。用ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光。內(nèi)參為GAPDH，分析蛋白表達(dá)變化。β-catenin、c-myc、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin 1、C-caspase-3、C-caspase-9抗體分別用5%牛血清白蛋白封閉液稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)依次為1∶600、1∶600、1∶800、1∶800、1∶1 000、1∶600、1∶600；二抗以5%牛血清白蛋白封閉液稀釋?zhuān)♂尡稊?shù)為1∶4 000。

1.6 激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響

結(jié)直腸癌細(xì)胞用含有3.0 mg/L的藤黃酸和10 μmol/L的Wnt/β-catenin激活劑LiCl細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞,記為藤黃酸+LiCl組,設(shè)置用含有3.0 mg/L的藤黃酸細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞為藤黃酸組,細(xì)胞培養(yǎng)48 h,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡,Western blot檢測(cè)β-catenin、c-myc、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin 1、C-caspase-3、C-caspase-9蛋白表達(dá),檢測(cè)步驟參考1.5。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡影響

不同濃度的藤黃酸處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率升高,細(xì)胞中C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平也升高,并且細(xì)胞凋亡率和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平隨著藤黃酸作用濃度的增加而升高(見(jiàn)圖1,2表1)。提示藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藤黃酸處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的變化

圖2 Western blot檢測(cè)藤黃酸處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞中C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平的變化

藤黃酸濃度(mg/L)凋亡率(%)C-caspase-3C-caspase-90 2.14±0.320.20±0.030.29±0.021.56.39±1.47?0.28±0.02?0.42±0.05?3.010.68±1.21?#0.41±0.04?#0.67±0.08?#6.019.54±1.84?#&0.65±0.05?#&0.86±0.06?#&F93.29186.00060.341P0.0000.0000.000

與0 mg/L比較,*P<0.05;與1.5 mg/L比較,#P<0.05;與3.0 mg/L比較,&P<0.05

2.2 藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬蛋白LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin 1表達(dá)影響

不同濃度的藤黃酸處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1水平升高，并且細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1水平隨著藤黃酸作用濃度的增加而升高(見(jiàn)圖3和表2)。提示藤黃酸誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬。

圖3 藤黃酸處理后結(jié)直腸癌細(xì)胞中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、Beclin 1蛋白表達(dá)

藤黃酸濃度(mg/L)Beclin 1 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ0 0.30±0.04 0.86±0.091.50.47±0.05?1.23±0.10?3.00.76±0.07?#1.67±0.11?#6.00.96±0.09?#&2.21±0.20?#&F60.836 57.850P0.0000.000

與0 mg/L比較,*P<0.05;與1.5 mg/L比較,#P<0.05;與3.0 mg/L比較,&P<0.05

2.3 藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)蛋白β-catenin、c-myc表達(dá)影響

不同濃度的藤黃酸處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin、c-myc水平降低,并且細(xì)胞β-catenin、c-myc水平隨著藤黃酸作用濃度的增加而降低(見(jiàn)圖4和表3)。藤黃酸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號(hào)激活。

圖4 Western blot檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)

藤黃酸濃度(mg/L)β-catenin c-myc 0 0.99±0.12 1.03±0.11 1.50.75±0.08?0.76±0.08?3.00.53±0.04?#0.57±0.08?#6.00.34±0.03?#&0.38±0.05?#&F40.528 33.708 P0.0000.000

與0 mg/L比較,*P<0.05;與1.5 mg/L比較,#P<0.05;與3.0 mg/L比較,&P<0.05

2.4 激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的影響

Wnt/β-catenin激活劑LiCl可以降低藤黃酸條件下結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率[(8.63±0.75)%vs(11.68±1.27)%]和C-caspase-3、C-caspase-9蛋白表達(dá)水平，降低LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin 1水平，提高細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白表達(dá)水平(見(jiàn)圖5,6和表4)。

圖5 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的影響

Wnt/β-catenin激活劑LiCl可逆轉(zhuǎn)藤黃酸調(diào)控結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬作用。

圖6 Western blot檢測(cè)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬的影響

組別β-cateninc-mycBeclin 1LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ凋亡率(%)C-caspase-3C-caspase-9藤黃酸0.54±0.050.56±0.060.74±0.061.60±0.1411.68±1.270.43±0.050.68±0.07藤黃酸+LiCl0.94±0.110.96±0.120.51±0.040.75±0.098.63±0.750.26±0.030.37±0.04 t5.7345.1645.5248.8463.5825.0506.660 P0.0050.0070.0050.0010.0230.0070.003

3 討論

藤黃是藤黃樹(shù)分泌形成的干燥樹(shù)脂,具有止血、解毒、殺蟲(chóng)等作用,藤黃酸是提取自藤黃中的有效活性成分,具有抗腫瘤作用[8]。研究表明,藤黃酸處理后的卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,凋亡增加,其抗腫瘤作用隨后在乳腺癌、胃癌等多種腫瘤中得到證實(shí)[9-11]。之前的研究表明,藤黃酸可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、侵襲能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,藤黃酸處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡率升高,結(jié)直腸癌細(xì)胞中C-caspase-3、C-caspase-9蛋白水平升高。C-caspase-3、C-caspase-9分別為caspase-3、caspase-9蛋白的活化形式,在caspase凋亡反應(yīng)中分別位于上游和下游[12]。當(dāng)受到凋亡信號(hào)刺激以后,caspase蛋白成員通過(guò)活化和自我活化的方式誘導(dǎo)凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng),caspase-3活化是細(xì)胞凋亡發(fā)生的標(biāo)志[13,14]。提示,藤黃酸通過(guò)caspase-3途徑誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡,這與張海元[3]藤黃酸引發(fā)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡的結(jié)論相吻合。

細(xì)胞自噬是一個(gè)溶酶體依賴的降解途徑,在真核細(xì)胞體內(nèi)廣泛存在。自噬能夠清除病原微生物、降解衰老或受損的細(xì)胞器、調(diào)節(jié)免疫功能[15]。正常生理?xiàng)l件下,幾乎所有的細(xì)胞自噬維持在一個(gè)較低的水平,這有助于細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的維持[16]。研究顯示,自噬在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮雙重作用,在腫瘤形成早期,細(xì)胞過(guò)度自噬可以抑制腫瘤形成,而在多數(shù)情況下,細(xì)胞自噬可以促進(jìn)癌細(xì)胞適應(yīng)代謝應(yīng)激而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的存活[17]?？鼓[瘤藥物能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞自噬[18]。Beclin 1是細(xì)胞自噬標(biāo)志蛋白,其水平升高后標(biāo)志細(xì)胞自噬水平的增加[19]。LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ是自噬蛋白LC3在細(xì)胞中存在的兩種形式,LC3-Ⅱ被認(rèn)為是形成自噬體的標(biāo)志物[20]。本次實(shí)驗(yàn)表明,藤黃酸處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中Beclin 1水平升高,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高,提示藤黃酸可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬。

Wnt/β-catenin是經(jīng)典的Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路,目前認(rèn)為,Wnt/β-catenin的異常激活是結(jié)腸癌形成的重要因素之一[21]。阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)可抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[22]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)的關(guān)鍵標(biāo)志蛋白,c-myc是Wnt/β-catenin信號(hào)的下游靶基因,二者水平升高是Wnt/β-catenin信號(hào)激活的標(biāo)志。本次結(jié)果顯示,藤黃酸處理后的結(jié)直腸癌細(xì)胞中β-catenin、c-myc蛋白水平下降,Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路可以逆轉(zhuǎn)藤黃酸對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬的誘導(dǎo)作用,提示藤黃酸通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路進(jìn)而誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞凋亡和自噬。

以上表明,藤黃酸可以體外誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞自噬和凋亡,其作用機(jī)制與調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)激活有關(guān),這為研究藤黃酸抗腫瘤作用機(jī)制提供了參考,為藤黃酸治療結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用提供了理論參考。