石麗洪,孔 麗*,周國(guó)宏,王文娟

(1山西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室,太原 030001;2山西省眼科醫(yī)院淚道病科;*通訊作者,E-mail:183085520@qq.com)

視網(wǎng)膜新生血管形成(retinal neovascularization,RNV)是由多種病因引發(fā)的脈絡(luò)膜新生血管芽穿越Bruch膜并在視網(wǎng)膜色素上皮上、下增殖形成的纖維血管組織,常伴有視網(wǎng)膜下的漿液性滲出乃至出血,是多種眼底疾病,如糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜靜脈阻塞等,導(dǎo)致視功能損害的最主要原因[1]。高氧誘導(dǎo)小鼠是在體研究視網(wǎng)膜新生血管形成機(jī)制的主要模型之一[2]。據(jù)相關(guān)研究顯示,RNV形成過(guò)程中涉及多種信號(hào)分子表達(dá)水平改變,如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、組織蛋白酶B(cathepsin B,CTSB)、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)[3-5]、白細(xì)胞介素8(IL-8)、腫瘤壞死因子(TNF-α)以及單核細(xì)胞趨化因子(MCP-1)[6]等。本課題組前期研究表明,CTSB和VEGF在RNV形成過(guò)程中可能存在雙向調(diào)節(jié)關(guān)系[3]。本研究旨在探討CTSB和bFGF在高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜新生血管形成中的表達(dá)以及使用CA-074 Me抑制后二者表達(dá)水平的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處理

7日齡清潔級(jí)C57BL/6J小鼠56只,雌雄不限,與母鼠(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,SCXK(晉)2015-0001)共同飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)條件及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)委員會(huì)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。采用隨機(jī)數(shù)字表法將56只小鼠分為正常對(duì)照組、高氧誘導(dǎo)組、DMSO組和CA-074Me組,每組小鼠14只。正常對(duì)照組小鼠在普通環(huán)境下飼養(yǎng)5 d;高氧誘導(dǎo)組、DMSO組和CA-074Me組在高氧環(huán)境中飼養(yǎng)5 d建立氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變模型;而后DMSO組和CA-074Me組小鼠玻璃體腔分別注射1 μl DMSO和1 μl CA-074Me,各1次,此時(shí)各組小鼠均為12日齡,而后均轉(zhuǎn)于標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中培養(yǎng)5 d,為17日齡小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

CA-074 Me(美國(guó)Biomol公司);CA-074 Me溶于DMSO溶劑中,配制成濃度為100 mg/L的溶液;PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒和引物合成(日本Takara公司);RNA裂解酶(美國(guó)Sigma公司);兔抗鼠CTSB抗體、鼠抗鼠bFGF抗體;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG二抗;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG二抗(美國(guó)Santa Cruz公司)。氧體積分?jǐn)?shù)為(75±2)%的密閉氧箱(青島科凱電子研究所有限公司);PCR儀、離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);多功能數(shù)字凝膠成像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF mRNA表達(dá)水平

每組中隨機(jī)各取7只17日齡小鼠。經(jīng)頸椎脫臼法處死,摘取雙側(cè)眼球,剝離視網(wǎng)膜組織。采用RNA提取劑盒提取小鼠視膜總RNA,按RevertAidTMFirstStrand cDNA Synthesis Kit說(shuō)明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,配置PCR反應(yīng)液,以cDNA為模板分別對(duì)CTSB和bFGF進(jìn)行PCR擴(kuò)增。CTSB和bFGF基因引物序列(見表1)。反應(yīng)結(jié)束后提取實(shí)吋聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的擴(kuò)增曲線和熔解曲線數(shù)據(jù),以β-actin基因作為內(nèi)參照,用2-ΔΔCt顯示相對(duì)表達(dá)量。

表1 CTSB和bFGF的引物序列

Table 1 Primer sequences of CTSB and bFGF

基因引物序列 CTSB上游:5′-GGCTTTGACTGCAGGACTTC-3′下游:5′-GACAGGACCAAGGAGAGGTG-3′bFGF上游:5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′下游:3′-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-5′β-actin上游:5′-AAGTGTGACGTTGACATCCG-3′下游:5′-TCTGCATCCTGTCAGCAATG-3′

1.4 Western blot法檢測(cè)小鼠視網(wǎng)膜中VEGF和bFGF蛋白表達(dá)水平

每組中隨機(jī)各取17日齡小鼠7只。經(jīng)頸椎脫臼法處死，摘取雙側(cè)眼球,剝離視網(wǎng)膜組織。用裂解液裂解小鼠視網(wǎng)膜，置于1.5 ml Eppendorf管中，超聲勻漿，4 ℃ 10 000g離心10 min，取上清，蛋白定量，加入等體積2倍SDS緩沖液，95 ℃煮沸5 min，迅速冰浴，4 ℃ 10 000g離心10 min，收集上清。蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳法進(jìn)行分離(VEGF用質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的分離膠，bFGF用質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的分離膠)，電轉(zhuǎn)印法將電泳條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%BSA溶液，4 ℃封閉3 h；分別加入兔抗鼠CTSB抗體(1∶1 000稀釋)或鼠抗鼠bFGF抗體(1∶1 000稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST洗滌，再加入相應(yīng)二抗(1∶10 000稀釋)，孵育2 h，洗滌；ECL底物化學(xué)發(fā)光，顯影，定影，掃描。以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)Photoshop圖像軟件分析，以CTSB/β-actin，bFGF/β-actin的比值表示各組組織中CTSB和bFGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 小鼠視網(wǎng)膜中CTSB、bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平

正常對(duì)照組、高氧誘導(dǎo)組、DMSO組和CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.67±0.23,21.4±3.07,17.22±2.63和0.96±0.35,各組bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=226.89,P=0.000)。正常對(duì)照組、高氧誘導(dǎo)組、DMSO組和CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為0.26±0.11,9.92±3.30,6.36±4.15和0.48±0.29,各組CTSB mRNA相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.23,P<0.05)。與對(duì)照組比較,高氧誘導(dǎo)組和DMSO組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯低于高氧誘導(dǎo)組(P<0.05)。正常對(duì)照組和CA-074Me組比較,高氧誘導(dǎo)組和DMSO組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖1)。

與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與高氧誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

2.2 小鼠視網(wǎng)膜內(nèi)bFGF和CTSB蛋白相對(duì)表達(dá)水平

正常對(duì)照組、高氧誘導(dǎo)組、DMSO組和CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.38±0.02,0.91±0.07,0.95±0.05和0.59±0.08,各組bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=121.84,P<0.05)。CTSB蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.42±0.07,0.97±0.13,0.97±0.13和0.71±0.12,各組CTSB蛋白相對(duì)表達(dá)量的總體比較,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.69,P=0.000)。與對(duì)照組比較,高氧誘導(dǎo)組和DMSO組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF蛋白的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。CA-074Me組小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF蛋白相對(duì)表達(dá)水平明顯低于高氧誘導(dǎo)組和DMSO組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常對(duì)照組和CA-074Me組比較,高氧誘導(dǎo)組和DMSO組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,見圖2)。

與正常對(duì)照組比較,*P<0.05;與高氧誘導(dǎo)組比較,#P<0.05

3 討論

RNV形成是缺血、缺氧性視網(wǎng)膜疾病發(fā)展到終末階段的特征性表現(xiàn),如增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變和早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變[7]。新生血管管壁發(fā)育不成熟、基底膜不完整,導(dǎo)致血管內(nèi)大分子滲漏至組織間隙,進(jìn)而出現(xiàn)玻璃體和視網(wǎng)膜前、后出血。若反復(fù)積血且不能完全吸收,玻璃體腔的血性物質(zhì)就會(huì)發(fā)生濃縮、機(jī)化、增殖、牽拉,從而引起黃斑水腫,發(fā)生部分或完全牽拉性視網(wǎng)膜脫離,進(jìn)而殃及其鄰近組織,繼發(fā)睫狀體、脈絡(luò)膜脫離等嚴(yán)重并發(fā)癥[8]。正常眼組織能夠維持血管生成的穩(wěn)定性是基于血管生成刺激因子(如VEGF、bFGF等)和血管生成抑制因子(如色素上皮衍生因子PEDF)共同作用的結(jié)果。兩者之間關(guān)系失衡是促使RNV形成的最主要原因[9]。另外,細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)固有成分中的膠原蛋白、彈性蛋白等經(jīng)酶解后可促進(jìn)RNV形成[10]。

bFGF也稱FGF2,具有促分化、促增殖、營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)及抑制凋亡等作用。動(dòng)物試驗(yàn)中,已有研究表明bFGF與VEGF同時(shí)注入玻璃體腔視網(wǎng)膜血管病變最重[11]。給青紫藍(lán)兔視網(wǎng)膜下注射bFGF能誘導(dǎo)其視網(wǎng)膜下新生血管形成[12]。bFGF可通過(guò)旁分泌和自分泌途徑作用于視網(wǎng)膜各層細(xì)胞,并促進(jìn)其他生長(zhǎng)因子分泌。在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)病過(guò)程中,局部組織缺血、缺氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞bFGF分泌,從而刺激視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞增殖,導(dǎo)致血管腔狹窄、閉塞,加重視網(wǎng)膜血循環(huán)障礙[13]。同時(shí),bFGF能夠顯著激活炎性反應(yīng)的一個(gè)重要轉(zhuǎn)錄因子NF-κB及增加其下游與炎癥有關(guān)的細(xì)胞因子白介素-8(IL-8)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)的基因表達(dá),增加血管通透性,利于內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖[14]。

CTSB是一種半胱氨酸組織蛋白酶,以酶原形式儲(chǔ)存于溶酶體中,參與體內(nèi)多種蛋白的水解。正常情況下,大約10%的酶原被生理性分泌至胞漿。病理狀態(tài)下,各種原因所致的細(xì)胞損傷導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低、通透性增高甚至破裂,大量CTSB釋放到胞漿或組織間隙并被激活,介導(dǎo)細(xì)胞炎性壞死及凋亡[15]。高氧誘導(dǎo)小鼠模型中CTSB表達(dá)水平增加,活性增強(qiáng),加速ECM降解,使ECM結(jié)構(gòu)改變,還可促進(jìn)ECM釋放bFGF[15]。

CA-074 Me是CTSB的特異性抑制劑,能抑制視網(wǎng)膜新生血管中CTSB的表達(dá)[16]。本實(shí)驗(yàn)中,高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜中CTSB和bFGF表達(dá)上調(diào)。給小鼠玻璃體腔注射CA-074 Me抑制高氧誘導(dǎo)小鼠視網(wǎng)膜組織中CTSB的表達(dá),此時(shí)發(fā)現(xiàn)bFGF表達(dá)下調(diào)。這一機(jī)制可能是,CA-074 Me通過(guò)抑制CTSB來(lái)抑制bFGF的表達(dá);也可能是CA-074 Me直接作用于bFGF,其具體機(jī)制需要我們?cè)诤笃诘膶?shí)驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證。