張麗華 韓浩章 王曉立 李素華 王芳 董蓉 劉宇

摘 要：以香樟嫩葉為試驗(yàn)材料，采用SRAP-PCR分子標(biāo)記體系對(duì)420對(duì)引物組合進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明：共選出19對(duì)引物組合，擴(kuò)增出367條帶，平均19.3條，范圍在15～25條。其中，多態(tài)性帶230條，平均12.11條，范圍在6～17條;多態(tài)性的比例62.16%，范圍在40%～81%。SRAP-PCR分子標(biāo)記體系穩(wěn)定，篩選出的引物組合可用于不同種源香樟遺傳多樣性及品種鑒定的研究。

關(guān)鍵詞：香樟;SRAP分子標(biāo)記;引物篩選

中圖分類(lèi)號(hào) S79文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 1007-7731（2019）20-0025-04

Abstract：Using camphor leaves as material，420 primer combinations were screened by SRAP-PCR molecular marker system. The results showed that：a total of 19 pairs of primers were selected，and 367 bands were expanded，with an average of 19.3 and a range of 15～25，of which 230 polymorphic belts，an average of 12.11，a range of 6～17，a polymorphic ratio of 62.16 %，and a range of 40～81 %. The SRAP-PCR molecular marker system is stable，and the selected primer combination can be used for genetic diversity and variety identification of different species of camphor.

Key words：Camphor;SRAP molecular marker;Primer screening

香樟[Cinnamomum camphora（L.） Presl]，又名小葉樟、樟、芳樟，為樟科樟屬常綠喬木，主要分布于中國(guó)長(zhǎng)江以南地區(qū)，適宜深厚、肥沃的酸性土壤環(huán)境和溫暖、濕潤(rùn)氣候，不耐干旱、貧瘠和鹽堿土壤環(huán)境，是我國(guó)重要的園林綠化樹(shù)種、林用樹(shù)種和經(jīng)濟(jì)樹(shù)種。近年來(lái)，香樟在我國(guó)長(zhǎng)江以北地區(qū)的栽培面積越來(lái)越廣，但由于引種地與種源生產(chǎn)地之間的氣候和土壤條件差異較大，冬季低溫和土壤鹽堿環(huán)境已成為了限制香樟在我國(guó)北方地區(qū)引種栽培成功的關(guān)鍵因素，選育抗寒、耐鹽堿品種成為了當(dāng)務(wù)之急[1]。目前，關(guān)于香樟優(yōu)良品種選育的研究主要集中在種質(zhì)資源、田間子代生長(zhǎng)特性分析以及優(yōu)良家系早期篩選等方面[2]，而關(guān)于香樟耐鹽堿、耐寒品種選育研究則相對(duì)較少。香樟的生長(zhǎng)發(fā)育受環(huán)境的影響很大，地理類(lèi)型較多，實(shí)生后代變異程度大[3-4]，形態(tài)標(biāo)記、同功酶和染色體核型分析等傳統(tǒng)標(biāo)記方法很難區(qū)分辨別香樟種間或種內(nèi)關(guān)系，而DNA分子標(biāo)記技術(shù)能在基因組水平上探究植物種間及無(wú)性系間的遺傳變異，不受氣候和土壤環(huán)境因素的干擾，所得的信息內(nèi)容豐富，更能體現(xiàn)出植物種內(nèi)和種間的遺傳變異。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（Sequence-related amplifiedpolymorphism，SRAP）是Li和Quiros[5]開(kāi)發(fā)的分子標(biāo)記技術(shù)。在觀賞南瓜（Cucurbita moschata）[6]、野牛草（Buchloe dactyloides）[7]等植物上的研究表明，SRAP比ISSR（Inter-simple Sequence Repeat）、SSR（Simple Sequence Repeat）、RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA）等幾種分子標(biāo)記表現(xiàn)出更豐富的遺傳多樣性，具有操作簡(jiǎn)單、多態(tài)性豐富、引物利用率高、重復(fù)性好、費(fèi)用低等優(yōu)點(diǎn)[8]。SRAP標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于品種鑒定、遺傳多樣性分析、遺傳變異和親緣關(guān)系分析和指紋圖譜構(gòu)建等的研究中[9]。關(guān)于香樟植物分子標(biāo)記方面，宋愛(ài)云等[4]于2003年將RAPD分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用于鑒定香樟優(yōu)選株和普通株，呂昕謠等[10]也建立了普陀樟的SRAP反應(yīng)體系，而關(guān)于香樟SRAP分子標(biāo)記方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究采用課題組成熟的SRAP-PCR反應(yīng)體系，對(duì)420對(duì)引物進(jìn)行了篩選，以期為進(jìn)一步開(kāi)展香樟的遺傳多樣性及相關(guān)遺傳研究提供技術(shù)支撐，也可為香樟基因組分析、分子標(biāo)記輔助育種等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料 本試驗(yàn)所選香樟試材共14個(gè)樣品（表1），包括浙江、江蘇、江西、安徽等地香樟分布地區(qū)，于2018年2—4月份采集并移栽于宿遷學(xué)院樟屬植物種苗基地，2019年4月進(jìn)行基因組DNA提取。所用SRAP正反向引物參照前人研究公布的引物序列[5-10]，由深圳華大基質(zhì)科技有限公司合成，PCR反應(yīng)相關(guān)試劑10X Buffer、Mg2+、Taq DNA聚合酶、dNTPs和DNA marker均購(gòu)自天根生化科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測(cè) 采用試劑盒法（購(gòu)自原平皓生物技術(shù)有限公司）提取香樟基因組DNA，采用1% 瓊脂糖凝膠電泳測(cè)基因組DNA的質(zhì)量（電泳儀電源為美國(guó)BIO-RAD Powerpac Basic型，電泳儀為北京君意JY-SPCT型），電泳結(jié)束后，在自動(dòng)凝膠圖像分析儀（上海培清JS-780R全自動(dòng)凝膠成像分析儀）上觀測(cè)，確定DNA純度并拍照。用核酸蛋白測(cè)定儀（BioPhotometer D30）確定其濃度以及A260/A280的比值，最后將樣品DNA質(zhì)量濃度稀釋到50ng/μL，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系 SRAP-PCR反應(yīng)體系為：2.0mmol/L的Mg2+，0.2mmol/L的dNTPs，DNA模板60ng，Taq DNA聚合酶1.5U，正反引物0.5μmol/L，10X loading Buffer 2μL，加ddH2O至20μL。

1.2.3 PCR反應(yīng)程序 PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸1min反應(yīng)5個(gè)循環(huán)，94℃變性1min，51℃復(fù)性1min，72℃延伸1min反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延伸5min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法染色后，在可見(jiàn)光燈箱上照相記錄。

1.2.4 引物篩選 從供試材料中選取外觀形態(tài)差異較大的3個(gè)香樟材料DNA模板對(duì)420對(duì)SRAP引物進(jìn)行篩選，最終篩選出清晰度高、穩(wěn)定性好、多態(tài)性豐富的SRAP引物用于所有DNA樣品擴(kuò)增（表2）。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析 對(duì)凝膠電泳結(jié)果中清晰、易于辨認(rèn)的條帶根據(jù)其有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，同一位點(diǎn)有帶記為“1”，無(wú)帶記為“0”，建立二元原始數(shù)字矩陣，并計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)性百分率。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟DNA的提取檢測(cè) 通過(guò)測(cè)定，14份香樟的DNA樣品的A260/A280的值均數(shù)在1.7～2.0，經(jīng)過(guò)0.8%瓊脂糖電泳檢測(cè)，其條帶清晰，符合擴(kuò)增的基本要求（圖1）。

2.2 SRAP分子標(biāo)記引物組合的篩選及多態(tài)性分析 以14份香樟種源DNA為材料，利用SRAP分子標(biāo)記體系對(duì)420對(duì)引物進(jìn)行篩選，淘汰那些模糊的、條帶較少的引物，選擇出清晰且明亮、條帶數(shù)目多的引物。最終從420對(duì)引物組合中選出19對(duì)特異性強(qiáng)的引物組合，共獲得367條帶，平均19.3條，范圍在15～25條。其中，多態(tài)性帶230條，平均12.11條，范圍在6～17條;多態(tài)性比例為62.16%，范圍在40%～81%（表3）。

3 討論與結(jié)論

SRAP-PCR反應(yīng)的引物序列和擴(kuò)增程序都是特定的，所反映的遺傳多態(tài)性能直接揭示不同植物基因組DNA間的差異[11]。研究認(rèn)為，SRAP-PCR試驗(yàn)的結(jié)果與溫度以及Mg2+、dNTPS、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA這5個(gè)因素的濃度有關(guān)[12]，不同物種的SRAP-PCR研究影響因素的差別也很大，這可能與不同植物本身的遺傳差異有關(guān)，也可能與研究者在設(shè)定正交設(shè)計(jì)時(shí)不同因素的濃度設(shè)定不同有關(guān)。此外，不同研究者采用的儀器設(shè)備、凝膠的質(zhì)量和濃度均有差異，可能也是造成SRAP-PCR試驗(yàn)結(jié)果存在差異的原因。因此，適宜的SRAP-PCR反應(yīng)體系必須針對(duì)不同植物種類(lèi)、不同試驗(yàn)條件、不同試驗(yàn)儀器及試劑對(duì)主要的影響因素進(jìn)行優(yōu)化，以保證試驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性和可靠性。

目前，關(guān)于SRAP分子標(biāo)記引物篩選的研究較多。郭大龍等[8]從100對(duì)SRAP引物組合中，篩選出19對(duì)能在葡萄中擴(kuò)增出條帶清晰且多態(tài)性好的引物組合。安佰義等[12]從176對(duì)SRAP引物組合中，篩選出25對(duì)適用于白檀的引物組合。李芳芳等[13]從96對(duì)SRAP引物組合中，篩選得到18對(duì)條帶清晰、穩(wěn)定且多態(tài)性豐富的引物作為楓香樹(shù)基因組的擴(kuò)增引物組合。本研究中，將20條正向引物和21條反向引物隨機(jī)組合得到420對(duì)引物組合，其中19個(gè)組合能在香樟DNA中擴(kuò)增出清晰明亮的條帶。由此可見(jiàn)，SRAP引物組合在不同植物的基因組上具有不同的結(jié)合位點(diǎn)及數(shù)量，這導(dǎo)致擴(kuò)增效果及適用引物存在差異。引物序列是SRAP-PCR擴(kuò)增過(guò)程成功的關(guān)鍵，即使建立了最優(yōu)PCR擴(kuò)增體系，倘若引物的選擇沒(méi)有特異性，往往實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想[11]。

在獲得最優(yōu)PCR擴(kuò)增體系的基礎(chǔ)上，本研究對(duì)420對(duì)引物進(jìn)行了大量的篩選工作，從中初步篩選出19對(duì)引物。通過(guò)對(duì)這些引物進(jìn)行SRAP-PCR的多態(tài)性數(shù)據(jù)分析，得出總條帶數(shù)為367條。其中，多態(tài)性條帶數(shù)達(dá)230條，其擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小均在2000bp以內(nèi)且分布較均勻，多態(tài)率為62.16%。這為香樟的遺傳多樣性研究、品種鑒定、親緣關(guān)系分析、遺傳圖譜構(gòu)建等研究奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)

[1]韓浩章，王曉立，劉宇，等.香樟黃化病現(xiàn)狀分析及其治理研究[J].北方園藝，2010（13）：232-235.

[2]張謙，曾令海，蔡燕靈，等.樟樹(shù)自由授粉家系生長(zhǎng)與形質(zhì)性狀的遺傳分析[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，34（1）：1-6.

[3]姚小華，任華東，吳柯久，等.樟樹(shù)苗期遺傳變異研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，21（3）：320-328.

[4]宋愛(ài)云，陳輝，董林水.RAPD分子標(biāo)記在鑒定香樟優(yōu)選株和普通株中的應(yīng)用[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2003，9（3）：263-265.

[5]Li G，Quiros C F. Sequence-related amplified polymorphism（SRAP），A new marker system based on a simple PCR reaction：its application to mapping and gene tagging in Brassica[J]. Theor Appl Genet.，2001（103）：455-461.

[6]Ferriol M，Pic B，Nuez F. Genetic diversity of a germplasm collection of Cucurbita pepousing SRAP and AFLP markers[J]. Theor Appl Genet.，2003（107）：271-282.

[7]Budak H，Shearman R C，Parmaksiz I，et al. Molecular characterization of Buffalo grass germplasm using sequence-related amplified polymorphism markers[J]. Theor Appl Genet.，2004（108）：328-334.

[8]郭大龍，張君玉，李猛，等.葡萄SRAP反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（2）：379-384.

[9]郭麗琴，李友麗，饒國(guó)棟，等.利用SRAP分子標(biāo)記分析楊屬遺傳變異和親緣關(guān)系[J].林業(yè)科學(xué)研究，2019，32（3）：88-96.

[10]呂昕謠，趙穎，趙國(guó)淼，等.普陀樟SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立[J].浙江林業(yè)科技，2014，34（3）：23-27.

[11]Zhu S.，Liu T.，Tang Q.，et al. Evaluation of bamboo genetic diversity using morphological and SRAP analyses[J].Genetika，2014，50（3）：306-313.

[12]安佰義，于慧穎，吳雙，等.白檀SRAP-PCR體系優(yōu)化及引物篩選[J].北方園藝，2018，24：15-20.

[13]李芳芳，楊少宗，柳新紅，等.楓香樹(shù)DNA提取及SRAP-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，49（1）：46-52.

（責(zé)編：張宏民）