董偉 戴涵斌 朱沛楓 徐永強(qiáng)

[摘要] 目的 分析miR-320對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、侵襲的影響及其作用機(jī)制。 方法 將SW480細(xì)胞分為SW480組、mimic對(duì)照組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt +/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt -/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic組、pc-FoxM1組、miR-320 mimic+pc-FoxM1組;檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)凋亡、增殖、侵襲等相關(guān)指標(biāo)。 結(jié)果 miR-320 mimic細(xì)胞表達(dá)miR-320量顯著升高（P<0.05），F(xiàn)oxM1表達(dá)量顯著降低（P<0.05），熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與FoxM1 wt組比較，F(xiàn)oxM1 wt+miR-320組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05）;miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞細(xì)胞增殖數(shù)及PCNA蛋白表達(dá)水平均顯著高于miR-320 mimic組（P<0.05）;與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞cleaved Caspase-9表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與miR-320 mimic組相比， miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞遷移率顯著升高（P<0.05）;與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著升高（P<0.05）。 結(jié)論 miR-320通過(guò)靶向調(diào)控FoxM1實(shí)現(xiàn)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、侵襲能力。

[關(guān)鍵詞] miR-320;FoxM1;SW480細(xì)胞;增殖;侵襲

[中圖分類號(hào)] R735.35? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）26-0033-04

[Abstract] Objective To analyze the effect of miR-320 on proliferation and invasion of colon cancer SW480 cells and its mechanism. Methods SW480 cells were divided into SW480 group， mimic control group， miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-group， miR-320 mimic+/FoxM1 wt +/FoxM1 mut-group， miR-320 mimic-/FoxM1 wt -/FoxM1 mut+ group， miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+group， miR-320 mimic group， pc-FoxM1 group， miR-320 mimic+pc-FoxM1 group. The proliferation， invasion and other related indicators between groups were compared. Results The expression of miR-320 in miR-320 mimic cells was significantly increased（P<0.05）， and the expression of FoxM1 was significantly decreased（P<0.05）. The results of luciferase reporter assay showed that the luciferase activity of FoxM1 wt+miR-320 was significantly decreased compared with that of the FoxM1 wt group（P<0.05）. The cell proliferation and PCNA protein expression of miR-320 mimic+pc-FoxM1 group were significantly higher than that of miR-320 mimic group（P<0.05）. Compared with that of the miR-320 mimic group， cell migration rate of miR-320 mimic+pc-FoxM1 group was significantly increased（P<0.05）， and the expression level of cleaved Caspase-9 in the miR-320 mimic+pc-FoxM1 group was significantly lower（P<0.05）. Compared with that of the miR-320 mimic group， the number of cell invasion was significantly increased in the miR-320 mimic+pc-FoxM1 group（P<0.05）. Conclusion miR-320 can inhibit the proliferation and invasion of colon cancer SW480 cells by targeting FoxM1.

[Key words] miR-320; FoxM1; SW480 cells; Proliferation; Invasion

結(jié)腸癌是目前臨床中最為常見的惡性腫瘤，也是目前死亡率較高的惡性腫瘤之一[1]。有研究結(jié)果顯示，每年全球范圍內(nèi)約有100萬(wàn)人被確診為結(jié)腸癌，且約60萬(wàn)人死于本病[2]。近年來(lái)，隨著臨床治療和診斷水平的提高和改善，在西方國(guó)家中結(jié)腸癌的死亡率雖有一定程度降低，但包括我國(guó)在內(nèi)的多數(shù)發(fā)展中國(guó)家的發(fā)病率及病死率仍呈現(xiàn)逐年增高趨勢(shì)[3]。因而對(duì)結(jié)腸癌的臨床發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究，并尋找有效及時(shí)診斷結(jié)腸癌的方案具有十分重要的意義[4]。有研究結(jié)果顯示，在腫瘤基因表達(dá)及疾病發(fā)生過(guò)程中微小RNA（miRNA，micro RNA）起到十分重要的作用[5]。有學(xué)者研究指出，miRNA異常與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、增殖密切相關(guān)，并可能參與腫瘤細(xì)胞的凋亡調(diào)控，加速腫瘤進(jìn)展[6]。miR-320屬于經(jīng)典的抑癌基因，在多種腫瘤細(xì)胞中呈明顯異常低表達(dá)狀態(tài)[7]。但miR-320在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控作用機(jī)制仍未完全揭示，因而本課題通過(guò)調(diào)控SW480結(jié)腸癌細(xì)胞中miR-320表達(dá)，分析miR-320調(diào)控結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、侵襲作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑

SW480結(jié)腸癌細(xì)胞株購(gòu)買自ATCC、DMED培養(yǎng)基及FBS購(gòu)買自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)買自Invitrogen公司，TRIzol試劑、RIPA裂解液、CCK8試劑盒、PCR熒光定量試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡試劑盒及熒光素酶基因報(bào)告試劑盒購(gòu)買自福麥斯生物科技有限公司，抗FoxM1、PCNA、cleaved-Caspase-3、MMP-9及MMP-2抗體均購(gòu)買自密理博生物科技有限公司，過(guò)氧化物歧化酶標(biāo)記鼠抗及兔抗菌購(gòu)買自北京博奧生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞分組及轉(zhuǎn)染

使用含有105的FBS完全培養(yǎng)基5 mL重懸SW480細(xì)胞，后轉(zhuǎn)移至25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，并置于5%二氧化碳的37℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞長(zhǎng)至80%后進(jìn)行傳代培養(yǎng)或進(jìn)行干預(yù)處理。

收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度至105個(gè)/mL的濃度并將其接種于12孔板中，將其分為SW480組、mimic對(duì)照組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組、miR-320 mimic-/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic+/FoxM1 wt-/FoxM1 mut+組、miR-320 mimic組、pc-FoxM1組、miR-320 mimic+pc-FoxM1組。將細(xì)胞在培養(yǎng)板內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)24 h，后依照轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書操作步驟對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染干預(yù)，其中SW480組加入空白轉(zhuǎn)染試劑，mimic對(duì)照組加入空白載體，miR-320 mimic組轉(zhuǎn)染miR-320 mimic，pc-FoxM1轉(zhuǎn)染pc-FoxM1，miR-320 mimic+pc-FoxM1組共轉(zhuǎn)染miR-320 mimic和pc-FoxM1，4 h后進(jìn)行換液處理將轉(zhuǎn)染液換成正常細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 方法

使用qPCR法檢測(cè)SW480組、mimic對(duì)照組、miR-320 mimic組中細(xì)胞miR-320及FoxM1表達(dá)水平，并每組檢測(cè)3個(gè)復(fù)孔取均值。使用熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)觀察miR-320的FoxM1靶向關(guān)系，使用PCR擴(kuò)增miR-320與FoxM1結(jié)合片段，并將其插入熒光素酶載體中，構(gòu)建FoxM1野生質(zhì)粒，構(gòu)建集合片段中核苷酸突變的FoxM1突變質(zhì)粒，后將miR-320與FoxM1野生質(zhì)粒及突變質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染如SW480細(xì)胞中并利用報(bào)告基因試劑盒檢測(cè)熒光素酶活性。后使用CCK-8試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖活性，并采用Western Blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)FoxM1、PCNA、cleaved-Caspase-3、MMP-9及MMP-2蛋白水平，參照文獻(xiàn)[8]采用劃痕愈合實(shí)驗(yàn)及Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞遷移和侵襲能力。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS20.0行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間數(shù)據(jù)差異采用單因素方差法進(jìn)行檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-320靶向調(diào)控FoxM1表達(dá)

miR-320 mimic細(xì)胞表達(dá)miR-320量顯著升高（P<0.05），F(xiàn)oxM1表達(dá)量顯著降低（P<0.05），熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-320 mimic-/FoxM1wt+/FoxM1 mut-組相比，miR-320mimic+/FoxM1 wt+/FoxM1 mut-組熒光素酶活性顯著降低（P<0.05），且對(duì)結(jié)合位點(diǎn)突變后結(jié)果顯示其熒光素酶活性抑制作用消失，結(jié)果表明miR-320與FoxM1間存在靶向作用關(guān)系，見表1、2。

2.2 miR-320對(duì)SW480細(xì)胞增殖的影響

pc-FoxM1組細(xì)胞中FoxM1蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.05），細(xì)胞轉(zhuǎn)染4 d后miR-320 mimic組細(xì)胞增殖數(shù)及PCNA蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），pc-FoxM1組細(xì)胞增殖數(shù)及PCNA蛋白表達(dá)水平均顯著高于SW480組（P<0.05），miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞增殖數(shù)及PCNA蛋白表達(dá)水平均顯著高于miR-320 mimic組（P<0.05），結(jié)果提示，miR-320可通過(guò)負(fù)向調(diào)控細(xì)胞中FoxM1的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖，見表3、4。

2.3 miR-320誘導(dǎo)SW480細(xì)胞凋亡

miR-320 mimic組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），pc-FoxM1組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P<0.05），且miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞凋亡率顯著低于miR-320 mimic組（P<0.05）。蛋白水平檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-320 mimic組細(xì)胞cleaved Caspase-9表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），pc-FoxM1組顯著降低（P<0.05）;且與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞cleaved Caspase-9表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），結(jié)果提示，miR-320通過(guò)靶向調(diào)控FoxM1功能實(shí)現(xiàn)對(duì)SW480細(xì)胞凋亡的影響，見表5、6。

2.4 miR-320抑制SW480細(xì)胞遷移

miR-320 mimic組細(xì)胞遷移率顯著降低（P<0.05），pc-FoxM1組細(xì)胞遷移率顯著升高（P<0.05），且與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞遷移率顯著升高（P<0.05），結(jié)果提示，miR-320通過(guò)靶向FoxM1實(shí)現(xiàn)對(duì)SW480細(xì)胞遷移的調(diào)控，見表7。

2.5 miR-320抑制SW480細(xì)胞侵襲

miR-320 mimic組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著降低（P<0.05），pc-FoxM1組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著升高（P<0.05），且與miR-320 mimic組相比，miR-320 mimic+pc-FoxM1組細(xì)胞侵襲數(shù)顯著升高（P<0.05），結(jié)果提示，miR-320通過(guò)靶向調(diào)控FoxM1實(shí)現(xiàn)對(duì)SW480細(xì)胞侵襲的影響，見表8。

3討論

結(jié)直腸癌是現(xiàn)階段我國(guó)臨床中較為常見的惡性腫瘤之一，其臨床發(fā)病率居高不下，有研究指出多數(shù)結(jié)腸癌患者在確診后多已發(fā)展至中晚期，但近年來(lái)隨著腸鏡在臨床中的普及，直腸癌的早期檢出率明顯提高，并有效降低患者的病死率。有學(xué)者指出，在結(jié)腸癌病灶組織中miR-320處于低表達(dá)狀態(tài)，且在癌旁的正常黏膜組織中也呈現(xiàn)一定程度低表達(dá)狀態(tài)[9]。結(jié)果均提示，miR-320的表達(dá)異常可能與結(jié)腸癌的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)，并可作為評(píng)估患者病情的重要生物標(biāo)志物之一。有研究指出，miR-320可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞中c-Myc的表達(dá)進(jìn)而有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活性[10]。本組研究結(jié)果顯示，miR-320 mimic轉(zhuǎn)染后SW480細(xì)胞的增殖速度明顯降低，結(jié)果提示miR-320可有效調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖活性。

在miRNA發(fā)揮其調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖及生存過(guò)程中通過(guò)調(diào)節(jié)下游蛋白表達(dá)及活性是其重要的作用機(jī)制。有研究指出，F(xiàn)oxM1為保守性較高的膜受體，并在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡等過(guò)程中起到十分重要的作用[11]。研究結(jié)果表明，miRNA可調(diào)節(jié)下游基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控，進(jìn)而對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展造成不良影響[12]。miR-320低表達(dá)狀態(tài)與多種骨髓瘤和實(shí)體瘤關(guān)系密切。但miR-320調(diào)控抑制腫瘤細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制尚未完全揭示。本組研究結(jié)果顯示，miR-320存在可與FoxM1結(jié)合序列，而在SW480細(xì)胞中存在明顯的異常高表達(dá)狀態(tài)，通過(guò)上調(diào)miR-320表達(dá)降低SW480細(xì)胞內(nèi)FoxM1表達(dá)，結(jié)果表明miR-320可通過(guò)靶向調(diào)控FoxM1實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行影響。且熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-320與FoxM1存在靶向調(diào)控關(guān)系。此外，有研究指出，miR-320的上調(diào)可有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，且減弱miR-320可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[13]，結(jié)果提示miR-320可通過(guò)下調(diào)FoxM1水平而有效抑制SW480細(xì)胞增殖。

在腫瘤發(fā)展過(guò)程中細(xì)胞凋亡在其中扮演十分重要角色，miR-320可有效抑制多種腫瘤細(xì)胞凋亡，如乳腺癌、胰腺癌及肺癌等。有研究結(jié)果顯示，miR-320可有效誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，與本組研究結(jié)果相似[14]。研究顯示，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中，癌細(xì)胞的侵襲和遷移在其中扮演十分重要的作用，降低癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力可抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[15-16]。

有學(xué)者研究指出，miR-320可顯著抑制骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌等細(xì)胞的遷移和侵襲，并可能影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲[17-18]。本研究顯示miR-320異常高表達(dá)可有效抑制SW480的侵襲和遷移，并可有效抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)。pc-FoxM1可有效降低SW480細(xì)胞凋亡率，且FoxM1上調(diào)表達(dá)可顯著減弱miR-320對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，結(jié)果提示miR-320可通過(guò)靶向調(diào)控FoxM1水平誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。miR-320可顯著抑制骨肉瘤、膠質(zhì)瘤、乳腺癌等細(xì)胞的遷移和侵襲，并可能影響結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲，與本研究結(jié)果相似[19-20]。本組研究結(jié)果顯示，上調(diào)FoxM1表達(dá)可有效減弱miR-320 mimic對(duì)SW480細(xì)胞的遷移、侵襲及相關(guān)蛋白表達(dá)抑制作用，結(jié)果表明miR-320調(diào)控FoxM1表達(dá)與結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的遷移和侵襲作用密切相關(guān)。結(jié)果表明，miR-320可有效抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移和侵襲，并可通過(guò)靶向抑制FoxM1實(shí)現(xiàn)對(duì)調(diào)控SW480的遷移和侵襲。

綜上所述，miR-320通過(guò)靶向調(diào)控FoxM1實(shí)現(xiàn)抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、侵襲能力。

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（收稿日期：2019-05-21）