顏國華 高鵬 王世廣 王麗君

(1 鄭州工業(yè)應用技術學院，河南 新鄭 451100；2 河南中醫(yī)藥大學)

腎細胞癌(RCC)是腎臟中最常見的腫瘤。在西方國家，RCC的發(fā)病率在過去二十年中上升了約2%〔1〕。微小RNA(miRNA或miR)是一類保守的非編碼RNA，其通過與3′-非翻譯區(qū)中的序列結(jié)合而調(diào)節(jié)靶基因的表達水平〔2〕。研究表明，miRNA與各種癌癥的發(fā)生發(fā)展和預后有關〔3〕。幾種miRNA可能在RCC中失調(diào)，如與鄰近的正常組織相比，miR-15a在RCC組織中顯著下調(diào)〔4〕。此外，miR-15a的下調(diào)可通過在RCC進展期間直接靶向真核起始因子4E來抑制細胞增殖和侵襲〔5〕。miR-149-5p可能作為腫瘤抑制因子在RCC的細胞遷移，侵入和細胞凋亡中〔6〕。miR-210位于人類11號染色體上，miR-210在各種類型的癌癥中異常表達，包括胰腺癌，宮頸癌，乳腺癌和RCC〔7〕。然而，miR-210在RCC中的作用的分子機制仍有待闡明〔8〕。本研究擬探討RCC組織中miR-210的表達及其對RCC細胞的遷移、增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1材料 人腎小管上皮細胞HK2和RCC(ACHN，786-O，Caki-1和769P)細胞系由實驗室常規(guī)保存。ACHN細胞使用DMEM培養(yǎng)基。786-O和769P細胞在RPMI1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。Caki-1細胞在McCoy 5A培養(yǎng)基中培養(yǎng)。此外，細胞培養(yǎng)時補充10%胎牛血清，1%谷氨酰胺和1%抗生素(100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素)37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR) 使用TRIzol試劑(Invitrogen;Thermo Fisher Scientific)提取來自細胞的總RNA，并使用RNeasy Maxi試劑盒進行純化。在使用NanoDrop 2000c測量RNA濃度后，使用miScript Ⅱ RT試劑盒，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行qPCR。10 μl反應混合物由5 μl 2×QuantiTect SYBR Green PCR Master mix，3.7 μl無RNase水，1 μl cDNA模板，0.4 μl特異性miRNA引物和10×miScript Universal Primer組成。miR-210的引物是5′-CUGUGCGUGUGACAGCGGCUGAAGCCGCUGUCACACGCACAGUU-3′。U6(剪接體U6小核RNA)被選為內(nèi)參，U6引物序列為5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′。使用2-ΔΔCt法分析細胞中miR-210表達水平〔9〕。

1.3細胞轉(zhuǎn)染 miRNA mimics可以增強內(nèi)源miRNA的調(diào)節(jié)。轉(zhuǎn)染miR-210 mimics可以讓786-O和ACHN細胞的miR-210表達上調(diào)，使用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染，細胞使用Opti-MEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

1.4噻唑藍(MTT)法檢測細胞活力 分別將5 000個/孔786-O和ACHN細胞接種在96孔板中。轉(zhuǎn)染后總共3 d，在37℃下各孔加入20 μl MTT 4 h后除去上清液，向各孔中加入100 μl二甲基亞砜。然后使用振蕩器以0.16 g/min在室溫下，避光下震蕩10 min。使用酶標儀在595 nm的波長下評估細胞活力。實驗重復3次。

1.5細胞計數(shù)試劑盒(CCK)-8測定細胞增殖 將5 000個/孔786-O和ACHN細胞接種在96孔板中，然后用miR-210 mimic，miRNA(NC)mimic轉(zhuǎn)染。每孔加入10 μl CCK-8溶液，37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中溫育30 min。將細胞孵育0、24、48和72 h后，使用酶標儀測量450 nm處的吸光度來確定細胞增殖。實驗重復3次。

1.6細胞劃痕實驗評估ACHN和786-O細胞的遷移能力 在6孔板的每個孔中接種總共1×106個細胞。在轉(zhuǎn)染前細胞饑餓處理24 h。然后，如上所述，用miR-210 mimics、NC mimics轉(zhuǎn)染細胞。轉(zhuǎn)染后，將細胞在無血清和抗生素的培養(yǎng)基中于37℃培養(yǎng)24 h。接下來，通過拖動無菌移液管尖端造成劃痕。使用相機系統(tǒng)在0、12和24 h，37℃下捕獲細胞劃痕圖像〔10〕。實驗重復 3 次。

1.7使用24孔Transwell小室評估ACHN和786-O細胞的遷移和侵入能力 轉(zhuǎn)染后24 h，將約3×104個細胞鋪在上室。Transwell的下室含有600 μl補充有10%胎牛血清和1%谷氨酰胺的培養(yǎng)基(DMEM或RPMI1640)。在48 h，使用0.1%多聚甲醛將細胞固定25 h，并使用4%結(jié)晶紫室溫下染色25 min〔11〕。使用相機拍攝圖像。實驗重復3次。在4個隨機選擇的視野中對細胞進行計數(shù)。

1.8流式細胞術評估ACHN和786-O細胞的凋亡率和細胞周期 將1×106個細胞接種在6孔板中。在24 h，如上所述用miR-210 mimics，NC mimics 轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染后48 h，收獲細胞并使用冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌。用5 μl膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯(FITC)和碘化丙啶(PI)染色細胞。使用流式細胞儀評估細胞凋亡情況。對于細胞周期分析，收獲1×106個細胞，用70%乙醇固定過夜。然后將細胞用含有Rnase Ⅰ(100 μg/ml)和PI(50 μg/ml)及含有0.1%Triton X-100的PBS，在37℃下染色30 min。通過流式細胞術進行細胞周期分析。軟件FlowJo7.6.1用于分析數(shù)據(jù)〔12〕。實驗重復 3 次。

1.9統(tǒng)計學處理 采用SPSS16.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1miR-210的表達水平在RCC細胞系中上調(diào) miR-210在RCC細胞系786-O(11.23±0.32)、ACHN(8.62±0.43)、Caki-1(4.62±0.35)、769P中的表達水平(2.53±0.22)均顯著高于正常腎小管上皮細胞HK2(1.24±0.23，P<0.05) 。轉(zhuǎn)染后24 h，786-O細胞、ACHN細胞中miR-210 組 miR-210的表達水平(108.25±7.21、102.46±5.24)均顯著高于NC組(2.52±0.41，2.07±0.51，P<0.05) 。

2.2miR-210上調(diào)促進ACHN和786-O細胞的活力 與NC mimic組(OD值：0.43±0.02)相比，用miR-210 mimic轉(zhuǎn)染的ACHN細胞相對存活率(OD值：0.86±0.05)明顯增加(P<0.05)。與NC mimic組(OD值：0.52±0.04)相比，轉(zhuǎn)染miR-210 mimic的786-O細胞相對存活率(OD值：0.78±0.06)明顯增加(P<0.05)。

2.3miR-210上調(diào)促進ACHN和786-O細胞增殖 在轉(zhuǎn)染后24、48和72 h，轉(zhuǎn)染miR-210 mimic的ACHN和786-O細胞存活率顯著上調(diào)(P<0.05)。見表1。

2.4miR-210調(diào)節(jié)ACHN和786-O細胞的侵襲 與NC mimic組〔(0.86±0.07)個〕相比，轉(zhuǎn)染miR-210 mimic的ACHN細胞侵襲能力顯著上調(diào)〔(1.56±0.08)個，P<0.05〕。與NC mimic組〔(0.74±0.06)個〕相比，轉(zhuǎn)染miR-210 mimic的786-O細胞侵襲能力顯著上調(diào)〔(1.82±0.01)個，P<0.05〕。見圖1。

表1 miR-210對ACHN和786-O細胞增殖能力的影響值)

與NC mimic組比較：1)P<0.05；下表同

圖1 miR-210對ACHN和786-O細胞侵襲能力的影響(結(jié)晶紫染色，×100)

2.5miR-210調(diào)節(jié)ACHN和786-O細胞的遷移 與NC mimic組〔(0.89±0.03)μm〕相比，miR-210 mimic組ACHN細胞的遷移能力〔(1.30±0.07)μm〕顯著上調(diào)(P<0.05)。與NC mimic組〔(0.91±0.04)μm〕相比，miR-210 mimic組786-O細胞的遷移能力〔(1.26±0.08)個〕顯著上調(diào)(P<0.05)。見圖2。

2.6miR-210的上調(diào)抑制ACHN和786-O細胞的凋亡 與NC mimic組〔(17.81±0.45)%〕相比，miR-210 mimic組ACHN細胞早期凋亡率〔(12.61±0.36)%〕顯著降低(P<0.05)。與NC mimic組〔(21.50±0.52)%〕相比，miR-210 mimic組786-O細胞早期凋亡率〔(14.60±0.48)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖2 轉(zhuǎn)染前和轉(zhuǎn)染后24 h miR-210對ACHN和786-O細胞的遷移能力的影響

圖3 miR-210對ACHN和786-O細胞凋亡的影響

2.7miR-210的上調(diào)對ACHN細胞周期的影響 與NC mimic組相比，miR-210 mimic組ACHN細胞在G1 期的百分比明顯降低(P<0.05)，在G2 期和S期的百分比明顯升高(P<0.05)。見表2，圖4。

表2 miR-210對ACHN細胞周期的影響

圖4 miR-210對ACHN細胞周期的影響

3 討 論

RCC是世界范圍內(nèi)最常見且致命的惡性腫瘤之一〔1〕。然而，RCC發(fā)生和進展中涉及的機制仍不清楚〔13〕。RCC通常對放療和化療法具有抗性，到目前為止診斷為轉(zhuǎn)移性的RCC患者不存在治愈性療法，并且在局部手術切除腫瘤仍然是治療的主要手段〔14〕。miRNAs在轉(zhuǎn)錄水平后負責調(diào)控基因表達，在腫瘤學中被廣泛研究。因為它們可以調(diào)控細胞的行為和腫瘤微環(huán)境。由于單個miRNA可能靶向數(shù)百個mRNAs〔15〕，異常的miRNA表達可能會影響大量的轉(zhuǎn)錄本，而且會影響癌癥相關的信號通路〔2,16,17〕。

miR-210在過去幾年中已被大量研究，已經(jīng)被鑒定了多種miR-210靶標，并指出其不僅在線粒體代謝中，而且在血管生成、DNA損傷應答、細胞增殖和細胞凋亡中的作用〔7〕。miR-210通常表現(xiàn)出致癌性，因為它經(jīng)常在幾種癌癥中升高，包括乳腺癌、肺癌、腎細胞癌、胰腺癌或膠質(zhì)母細胞瘤等等〔18〕。研究顯示，RCC患者尿液中miR-210的水平顯著高于正常組，被作為RCC中液體活檢的標志〔19〕；在臨床RCC組織中，miR-210-3p通常被上調(diào)〔20〕。靶向miR-210-3p并利用規(guī)律成簇間隔短回重復(CRISPR/Cas9)基因編輯技術敲除RCC細胞系中的miR-210-3p，miR-210-3p下調(diào)導致體外和體內(nèi)腫瘤發(fā)生增加〔21〕。下調(diào)miR-210-3p導致Twist相關蛋白(TWIST)1顯著上調(diào)，這是miR-210-3p的關鍵靶點，表明miR-210-3p介導的TWIST1促使腎細胞癌進展〔22〕。miR-210過表達在腎癌細胞中誘導中心體擴增，并影響與細胞周期調(diào)節(jié)相關的基因。miR-210控制G2/M轉(zhuǎn)換并參與有絲分裂過程，改變絲氨酶/蘇氨酸蛋白激酶酶(Plk)1，紡錘體檢測點蛋白(Bub1B)，細胞周期(cyclin)F，姐妹染色單體內(nèi)聚蛋白PDS5同源蛋白B和序列相似83家族D的表達〔23〕。此外，miR-210通過靶向E2F轉(zhuǎn)錄因子3的表達參與S期的中心體復制，事實上，miR-210過表達抑制E2F轉(zhuǎn)錄因子3的表達，并影響中心體復制周期的調(diào)控，可能導致中心體非整倍數(shù)擴增〔24〕。

本研究表明miR-210可能在RCC中起致癌基因的作用，但是具體在RCC中miR-210的相關靶點未能確定，具體詳細的機制有待進一步研究。