帕力達(dá)·阿不力孜 卡比努爾·克依木 祖力菲亞·阿吉木 周曉輝

(1新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院老年病科,新疆 烏魯木齊 830011；2新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院)

Reisberg等〔1〕1982年首次提出輕度認(rèn)知功能障礙(MCI)的概念。MCI的特征是記憶損壞，它介于正常老齡化與輕度癡呆之間，無法被其他精神系統(tǒng)類疾病解釋。目前關(guān)于MCI影響因素的研究受到國內(nèi)、外研究者的關(guān)注。其中維生素D的水平及維生素D受體(VDR)基因多態(tài)性在MCI發(fā)生發(fā)展中的作用已成為近期研究的熱點(diǎn)。研究顯示，維生素D缺乏伴隨認(rèn)知功能障礙是在老年人中普遍存在的現(xiàn)象〔2〕。也有研究者表明，VDR相關(guān)蛋白的基因多態(tài)性與MCI的發(fā)病存在關(guān)聯(lián)性，BsmI、ApaI等基因位點(diǎn)出現(xiàn)的頻率在AD組顯著高于對照組。因此本文對VDR相關(guān)蛋白基因ApaI、BsmI兩個位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率在漢族老年MCI患者中的分布及其與血清25(OH)D水平的相關(guān)性進(jìn)行研究。

1 資料與方法

1.1研究對象 在2010年7月至2014年7月對新疆維、漢兩民族老年人進(jìn)行了MCI流行病學(xué)調(diào)查的基礎(chǔ)上，采用美國精神病學(xué)會的精神障礙和統(tǒng)計手冊第四修訂版(DSM-Ⅳ)的MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)，共入選漢族MCI組100例(女57例，男43例)，平均年齡 (77.22±6.59)歲。選取對照組145例(女70例，男75例)，平均年齡(76.72±5.71)歲。所有研究對象經(jīng)受試者同意，并簽署知情同意書，本實驗已經(jīng)通過新疆醫(yī)科大學(xué)倫理委員會的審批同意。

1.2內(nèi)容與方法

1.2.1MCI組納入標(biāo)準(zhǔn) (1)年齡：大于60歲；(2)符合美國精神病學(xué)會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊的第四次修訂版(DSM-Ⅳ)的MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)。①主觀感覺有記憶減退；②客觀檢查有MCI的相關(guān)證據(jù)，如簡易精神狀態(tài)量表(MMSE)評分中學(xué)文化程度評分25～27分，小學(xué)文化程度評分21～24分，文盲評分18～21分，或總體衰退量表(GDS)評分為2～3級；③一般日常生活能力(ADL)及社會功能下降，ADL評分<26分；④Hachinski缺血量表評分≤4分，并且排除抑郁及其他特定原因引起的認(rèn)知功能損害；⑤病程大于3個月；⑥未達(dá)到癡呆的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔臨床癡呆量表(CDR)=0.5分〕，嚴(yán)格按照上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，共入選MCI患者100例。

1.2.2對照組入選標(biāo)準(zhǔn) 經(jīng)嚴(yán)格的量表測評后，不符合美國精神病學(xué)會的精神障礙診斷和統(tǒng)計手冊的第四次修訂版(DSM-Ⅳ)的MCI診斷標(biāo)準(zhǔn)。選取與上述MCI患者有著相同或相近的生活背景，年齡、性別相匹配的非MCI者145例為對照組。

1.2.3排除標(biāo)準(zhǔn) MCI組及非MCI組均應(yīng)排除以下情況：①患有嚴(yán)重精神疾病者或先天精神發(fā)育遲滯者，如精神分裂癥、抑郁癥等；②患有嚴(yán)重心、肺、肝、腎等器官功能障礙，重度內(nèi)分泌功能損害、重度感染性疾病、中毒性腦病的患者；③患有腦卒中、帕金森病、缺血性腦血管病、腦腫瘤等能夠引起腦功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的患者；④有重度頭部外傷史者，過去半年內(nèi)確定為酒精依賴或藥物依賴者；⑤因各種原因無法配合認(rèn)知功能檢查者，如低文化、高齡或其他因素。被調(diào)查者存在上述情況之一者，即被排除。

1.2.4相關(guān)定義 ①高血壓：因在流行病學(xué)調(diào)查中只能測一次血壓，所以所有受試者未使用降壓藥物的情況下，收縮壓≥140 mmHg和(或)舒張壓>90 mmHg；或既往確診高血壓病史目前正在服用降壓藥物者。②糖代謝紊亂：在流行病學(xué)調(diào)查中，因只能查空腹血糖(FPG)，因此FPG≥7.0 mmol/L；或既往確診糖尿病病史目前正在服用降糖藥物者。

1.2.5實驗方法

1.2.5.1一般資料采集 采用現(xiàn)場問卷調(diào)查與入戶調(diào)查相結(jié)合的方式，首先初步完成調(diào)查問卷，MMSE測定，對于主訴及家屬訴其近期有明顯記憶障礙及MMSE量表低于界值者，進(jìn)一步進(jìn)行臨床體格檢查，總體衰退量表(GDS)、漢密爾頓抑郁量表(HAMD)、Hachinski缺血指數(shù)量表(HIS)、CDR等檢測，同時釆集患者基本資料，包括：身高、體重、血壓、年齡、性別、文化程度、既往病史等一般資料。

1.2.5.2血標(biāo)本采集 所有受試者晨間空腹、早上10∶00～12∶00采集靜脈血5 ml，1 h內(nèi)完成分離血清并轉(zhuǎn)盛在EP管中-80℃科研冰箱中保存待檢。

1.2.5.3DNA提取 所有受試對象采用外周血EDTA抗凝血5 ml，按外周血基因組DNA提取試劑盒(北京天根)說明書提取基因組DNA。應(yīng)用SNaPshot法分別檢測rs7975232和rs1544410的基因型。PCR反應(yīng)體系20 μl 1×GC緩沖液Ⅰ，3.0 mmol Mg2+，0.3 mmol dNTP 1U Hotstar Taq多聚酶(德國Qiagen公司)，1 μl樣本DNA和2 μl多重PCR引物(1～2 μmol)。引物的選擇：rs 7975232正義鏈：5′-GAGAAGAAGGCACAGGAGCTCTCA-3′，rs7985232反義鏈：5′-TGGTATCACCGGT CAGCAGTCA-3′，rs1544410正義鏈：5′-TCACTGCACATTGCCTCCAAAA-3′，rs1544410反義鏈：5′-TTCGTAGGGGGG ATTCTGAGGA-3′。

1.2.5.425(OH)D 測定 應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測血清25(OH)D水平，儀器來自新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，具體操作按上海朗頓生物技術(shù)有限公司所提供的25(OH)D試劑盒說明。

1.3統(tǒng)計分析 使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行t及χ2檢驗。用Hardy-Weinberg對MCI組和對照組中兩個位點(diǎn)的3個基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行檢測。

2 結(jié) 果

2.1MCI組和對照組一般資料比較 MCI組和對照組在性別，是否患有糖尿病、高血壓、年齡、體重、收縮壓(SBP)、舒張壓(DBP)、三酰甘油(TG)、FPG、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 MCI組和對照組一般資料比較

2.2VDR基因型分析結(jié)果 運(yùn)用GeneMapper 4.1(Applied Biosystems Co.Ltd.USA)進(jìn)行VDR基因SNP分型。圖1為多重PCR焦電泳峰圖，圖中標(biāo)注VDR基因BsmI(rs1544410)，ApaI(rs7975232)兩個位點(diǎn)的三種基因型圖，峰上標(biāo)定的等位基因(如采用的延伸引物是正方向，則它跟延伸加入的堿基相同，如采用的延伸引物是反方向，則跟延伸加入的堿基是互補(bǔ)的)。SE，SR依次代表正方向或反方向的延伸引物，BsmI位點(diǎn)，延伸引物為rs1544410SE，為正向延伸引物，電泳峰圖上用CT表示，Pos.C：43.31；T：45.11。ApaI位點(diǎn)，延伸引物為rs7975232SR，延伸引物是反向的，用GT表示，Pos.G：63.33；T：64.66。圖1為ApaI，BsmI位點(diǎn)雜合突變的，基因型標(biāo)在相應(yīng)的峰頂。

圖1 VDR基因型分析結(jié)果ApaI(rs7975232)與BsmI(rs1544410)雜合突變型

2.3Hardy-Weinberg 平衡檢驗 MCI組和對照組兩個位點(diǎn)三種基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡，符合遺傳平衡定律。

2.4VDR基因ApaI位點(diǎn)多態(tài)性在MCI組和對照組間分布比較 ApaI位點(diǎn)基因型頻率分布，MCI組與對照組CC基因型、CA基因型、AA基因型比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。攜帶AA基因型較CC基因型發(fā)生MCI的風(fēng)險升高9.121倍(OR=9.121，95%CI：3.712～22.412，P=0.001)。A等位基因分布MCI組明顯高于對照組(等位基因分布MCI組明顯低于對照組)，等位基因頻率在MCI組與對照組之間分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，攜帶A等位基因較C等位基因發(fā)生MCI的風(fēng)險升高1.872倍(OR=1.872，95%CI：1.272～2.755，P=0.001)。見表2。

表2 MCI組與對照組VDR ApaI位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的比較〔n(%)〕

2.5VDR基因BsmI位點(diǎn)多態(tài)性在MCI組和對照組間分布比較 BsmI位點(diǎn)多態(tài)性在兩組間的分布，三種基因型、CT、TT，在MCI組與對照組中的頻率分布比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，MCI組和對照組間均以CC基因型最高，TT基因型最少，且CT基因型在MCI組中較對照組高，攜帶CT基因型較CC基因型發(fā)生MCI的風(fēng)險升高2.857倍(OR=2.857，95%CI：1.208～6.758，P=0.014)。等位基因頻率在兩組間的分布，可見等位基因T在MCI組較對照組明顯增高(P<0.05)，攜帶T等位基因較C等位基因發(fā)生MCI的風(fēng)險升高2.206倍(OR=2.206，95%CI：1.001～4.859，P=0.045)。見表3。

表3 MCI組與對照組VDR BsmI位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布的比較〔n(%)〕

2.6MCI組及對照組血清25(OH)D水平比較 MCI組血清25(OH)D水平為(60.19±31.73)ng/ml，明顯低于對照組〔(70.50±37.50)ng/ml〕，兩組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.24，P=0.015)。

2.7MCI組VDR基因ApaI、BsmI位點(diǎn)多態(tài)性不同基因型與維生素D水平的比較 MCI患者VDR基因ApaI位點(diǎn)CC基因型血清25(OD)D水平為(80.82±34.37)ng/ml，CA+AA基因型血清25(OH)D水平為(73.58±31.95)ng/ml；BsmI位點(diǎn)CC基因型血清25(OD)D水平為(59.36±33.06)ng/ml，CT+TT基因型血清25(OH)D水平為(64.58±23.96)ng/ml。MCI組中，VDR基因ApaI(t=-1.039,P=0.301)、BsmI(t=-0.60,P=0.54)位點(diǎn)不同基因型比較血清25(OH)D水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

3 討 論

最新研究提示〔3〕，國內(nèi)MCI患病率達(dá)20.8%，主要以遺忘型MCI最多見，與健康老年人相比，MCI患者罹患癡呆的風(fēng)險高2.8～4倍。周曉輝等〔4〕對新疆南疆、東疆及烏魯木齊等地區(qū)60歲以上維吾爾族、漢族兩民族行MCI患病率調(diào)查結(jié)果顯示：新疆漢族老年人MCI標(biāo)化患病率為10.86%。流行病學(xué)調(diào)查顯示〔3〕：有10%～15%的MCI患者會進(jìn)展為癡呆。癡呆為患者、家庭及社會帶來沉重的健康問題和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，隨著我國老齡化加劇，癡呆的早期診斷及干預(yù)已成為癡呆防治的主要問題和難點(diǎn)，而對MCI的識別和干預(yù)就是其中的研究重點(diǎn)之一。

目前國內(nèi)關(guān)于維生素D與認(rèn)知功能障礙關(guān)系的報道較少，有研究顯示，維生素D缺乏的老年人整體認(rèn)知功能衰退的風(fēng)險更高，維生素D缺乏可能是阿爾茨海默病(AD)的重要發(fā)病機(jī)制之一〔5〕。Annweiler等〔6〕系統(tǒng)綜述和Meta分析結(jié)果：與認(rèn)知健康對照組相比，AD組血清25(OH)D濃度降低1.4倍標(biāo)準(zhǔn)差單位(P=0.016)。Annweiler等〔7〕對婦女膳食維生素D攝入量7年內(nèi)AD發(fā)生研究發(fā)現(xiàn)攝入較高劑量維生素D的老年婦女，發(fā)生的AD的風(fēng)險較低。本研究對100名新疆老年漢族MCI患者以及145名對照組進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果顯示老年MCI組維生素D水平低于對照組，與上述研究結(jié)果結(jié)論一致。維生素D水平的下降可能在MCI患者中扮演著重要的角色，初步揭示維生素D缺乏老年人更易患MCI。

首先，維生素D可能通過自身免疫系統(tǒng)來激活患者體內(nèi)吞噬細(xì)胞的清除及吞噬作用，達(dá)到對淀粉樣蛋白的清除和吞噬效果，從而延緩神經(jīng)細(xì)胞凋亡的過程〔8〕，并改善認(rèn)知功能。其次，維生素D在神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等中的存在很廣泛，它通過增加谷胱甘肽的含量來影響抗氧化機(jī)制、神經(jīng)元內(nèi)鈣的平衡等作用于這些細(xì)胞來調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子的產(chǎn)生，當(dāng)神經(jīng)營養(yǎng)因子合成減少時，人的學(xué)習(xí)記憶能力受累。維生素D能夠提高神經(jīng)營養(yǎng)因子的含量，降低神經(jīng)細(xì)胞的毒性，對神經(jīng)起保護(hù)作用。再次，維生素D既可以通過刺激神經(jīng)形成和再生來調(diào)節(jié)神經(jīng)營養(yǎng)因子的合成，也可以提高神經(jīng)遞質(zhì)合成酶的活性。同時，維生素D是一種免疫抑制劑，可以通過抑制自身免疫反應(yīng)來減少對神經(jīng)系統(tǒng)的損傷。

Gezen-Ak等〔9〕對AD患者進(jìn)行VDR基因多態(tài)性研究，結(jié)果提示Aa雜合子在病例組中較高，但病例組不符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則。Donald等〔10〕也對AD患者進(jìn)行VDR基因多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)ApaⅠ位點(diǎn)T等位基因增加AD的患病風(fēng)險?？梢缘贸鯲DR基因Apal位點(diǎn)中等位基因A可以早期階段影響認(rèn)知功能，即與MCI的患病有關(guān)。此次調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)：VDR基因ApaI位點(diǎn)AA基因型為MCI的風(fēng)險因素，A等位基因亦與MCI患病有關(guān)。這也初步證實了本實驗結(jié)果與上述研究結(jié)論保持一致。

前期本研究課題組〔11〕對新疆南疆維吾爾族老年人進(jìn)行的流行病學(xué)調(diào)查研究得到，VDR基因BsmI位點(diǎn)T基因型可能與MCI的患病有關(guān)，病例組及對照組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。本次實驗結(jié)果看出VDR基因BsmI位點(diǎn)CT基因型患病風(fēng)險較CC基因型及TT基因型高，CC基因型認(rèn)知功能較好，T等位基因是MCI的風(fēng)險因素，與上述研究結(jié)果一致。

Uitterlinden等〔12〕在一項研究中提到VDR會在維生素D與VDR的結(jié)合過程中引起中間通路的改變，從而影響維生素D的作用。在此基因2號外顯子上的FokI位點(diǎn)通過形成額外的三個氨基酸的細(xì)長結(jié)構(gòu)，從而改變VDR的蛋白結(jié)果。VDR基因8號內(nèi)含子的ApaI、BsmI位點(diǎn)內(nèi)含子不同基因型在轉(zhuǎn)錄時有一系列連鎖不平衡，與之基因表達(dá)的調(diào)控有關(guān)。如果交界處有突變發(fā)生，則正常的剪切方式也會隨之發(fā)生變化，從而引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化。故考慮通過影響基因表達(dá)的調(diào)控，調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的效率，影響認(rèn)知功能。

本研究顯示VDR基因ApaI、BsmI兩個位點(diǎn)多態(tài)性與漢族老年MCI發(fā)病相關(guān)；血清25(OH)D水平的下降可能影響MCI的發(fā)生發(fā)展。血清25(OH)D水平與維生素D受體在MCI的發(fā)病過程中起著重要作用。但本研究主要針對漢族人群，且樣本量較少，如能進(jìn)一步擴(kuò)大MCI人群，用更加科學(xué)的實驗技術(shù)和方法以及更新穎的實驗設(shè)計方案證明VDR基因多態(tài)性與血清25(OH)D水平在MCI中的作用可能更科學(xué)。