嚴繼貴 (安徽醫(yī)學高等?？茖W校護理學部 藥學系，安徽 合肥 230601)

趙正梅，盛夕曼 (安徽醫(yī)學高等?？茖W校護理學部，安徽 合肥 230601)

楊宇清 (安徽醫(yī)學高等?？茖W校藥學系，安徽 合肥 230601)

神經(jīng)干細胞(neural stem cells，NSCs)具有無限增殖、分化及遷移的特性，既可直接用于干細胞移植，亦可作為基因治療的載體。目前，NSCs移植研究多集中于腦部疾病，移植的NSCs經(jīng)增殖與分化后，補充、替換和修復死亡及損傷的腦細胞[1]，以期治愈腦部疾患。隨著研究的深入，研究者發(fā)現(xiàn)NSCs不僅具有神經(jīng)再生、結構修補或替代、神經(jīng)重塑、神經(jīng)保護等作用[2～4]，其治療范圍亦不局限于腦損傷。有學者經(jīng)蛛網(wǎng)膜下腔移植NSCs修復大鼠脊髓損傷及治療坐骨神經(jīng)痛[5]，也就是說NSCs移植在治療神經(jīng)病理性疼痛方面有一定作用。白細胞介素-10(interleukin-10，IL-10)是一種抗炎因子，能有效減輕腦損傷的炎癥反應，既能為NSCs移植提供較好的微環(huán)境，又能減輕炎癥對神經(jīng)病理性疼痛的刺激作用[6]。故本實驗將IL-10與胎鼠中腦NSCs共培養(yǎng)，體外觀察其對NSCs增殖與分化的影響，并通過免疫熒光法檢測半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)、神經(jīng)膠質酸性蛋白(GFAP)和神經(jīng)元特異烯醇化酶(NSE)等相關指標，以探討其可能的作用機制，為后續(xù)應用IL-10-NSCs移植治療神經(jīng)病理性疼痛等奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

孕14d清潔級Sprague-Dawley大鼠，由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。重組人IL-10購自美國Promega公司，高糖DMEM/F12、特級胎牛血清(FBS)購自美國Hyclon公司，N2添加劑購自美國Gibco公司，堿性成纖維蛋白因子(basic-fibroblast growth factor，b-FGF)購自美國Sigma公司，兔抗caspase-3多克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司(PR-0284)，抗nestin多克隆抗體購自美國Abcam公司(ab6142)，兔抗NSE多克隆抗體(bs-1027R)、兔抗GFAP多克隆抗體(bs-0199R)購自北京博奧森有限公司， FITC標記的兔抗大鼠多克隆抗體(BA1108)、Cy3標記的大鼠抗兔多克隆抗體(BA1032)購自武漢博士德生物工程有限公司。

恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱購自德國WTCBinder公司，超凈工作臺購自蘇州凈化設備廠，GIS-2020凝膠圖像處理系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司，倒置顯微鏡及成像系統(tǒng)(ECLIPSE Ts2)購自日本Nikon公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組

實驗分4組：空白對照組；高劑量組：IL-10質量體積分數(shù)為100μg/L；中劑量組：IL-10質量體積分數(shù)為50μg /L；低劑量組：IL-10質量體積分數(shù)為10μg/L。

1.2.2 胎鼠中腦NSCs培養(yǎng)、傳代、分化

將孕14d的SD胎鼠中腦制成單細胞懸液，置于無血清培養(yǎng)基(含1%N2的DMEM/F12)中懸浮培養(yǎng)，種植密度為1×106/mL，隔天半量換液，每日按10ng/mL添加bFGF，余同中腦神經(jīng)元培養(yǎng)。5d后用1mL移液器輕輕吹打10～15次，將懸液按800rpm離心8min。半量去上清，再吹打10～15次，行傳代培養(yǎng)。另在24孔培養(yǎng)板中鋪滿已包被多聚賴氨酸(poly-l-lycine，PLL)的蓋玻片，將剩余NSCs懸液移入其中，半量加入DMEM/F12分化液(含10%FBS)，24h后加入全量分化液，培養(yǎng)1周后行免疫熒光化學實驗。實驗組在增殖、傳代及分化培養(yǎng)中IL-10質量體積分數(shù)保持不變。

在倒置顯微鏡下觀察神經(jīng)球的生長狀況，邊緣整齊否、有無光暈；臺盼藍染色觀察NSCs活力及傳代次數(shù)；誘導分化后神經(jīng)球貼壁時間、分化狀況。

1.2.3 免疫熒光染色及圖像分析

每個指標，每組對應任取6孔細胞吸去培養(yǎng)基，PBS洗5min，連續(xù)洗3次。加入4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3次(5min/次)后，用0.4%TritonX-100透膜10min，加入封閉液封閉15min，分別滴加一抗nestin(1∶400)、Caspase-3(1∶50)、NSE(1∶75)、 GFAP(1∶200)，4℃過夜。PBS洗3次，每次5min；滴加FITC標記的兔抗大鼠多克隆抗體和Cy3標記的大鼠抗兔多克隆抗體，避光孵育1h，PBS洗3次(5min/次)，再用蒸餾水洗10min，甘油封片。每組取6張玻片，熒光顯微鏡下隨機取4個視野進行拍照，使用Image-Pro Plus專業(yè)圖像分析軟件分析神經(jīng)球和陽性細胞的累積光密度值(IOD)值。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 NSCs培養(yǎng)、傳代及誘導分化

培養(yǎng)24h即見神經(jīng)球，3d后其邊緣整齊晶瑩透亮，活力好(圖1(a))。傳代培養(yǎng)結果顯示，高、中劑量組NSCs可傳5代，高劑量組細胞活力(p5=67%)高于中劑量組(p5=51%)，另2組可傳3代。加入血清24h神經(jīng)球貼壁，48h有分化細胞長出(圖1(b))，1周后高、中劑量組NSCs分化程度最高(圖1(c))，低劑量組次之，對照組最差。

2.2 加入IL-10促進NSCs增殖及向神經(jīng)膠質細胞分化

免疫熒光結果顯示，神經(jīng)球呈nestin陽性染色(圖1(d))，即表達NSCs特異性標記物nestin蛋白；IL-10質量體積分數(shù)為100μg/L的高劑量組神經(jīng)球nestin表達量最大(1943574.61±324851.45)，與中、低劑量組及對照組相比，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；IL-10質量體積分數(shù)為50μg/L的中劑量組(1122378.63±553472.08)和IL-10質量體積分數(shù)為10μg/L低劑量組(1087813.92±534776.30)神經(jīng)球nestin表達量無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，但2組分別與對照組(490071.02±181824.56)相比，均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(見表1)。加入IL-10后，體外培養(yǎng)的胎鼠大鼠中腦NSCs增殖顯著。凋亡基因蛋白Caspase-3的表達以對照組(2351253.00±101321.54，與其他3組相比作用最強(圖2(d))，高劑量組與中劑量組相比，無統(tǒng)計學差異(P>0.05)(見圖2(a)、(b))，低劑量組Caspase-3的表達(1325947.90±181482.68)與其余3組相比，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(見表1、圖2(c))。高、中、低劑量組NSCs增多可能與抑制凋亡基因Caspase-3表達有關，其機制可能是加入IL-10后，通過某種特定路徑抑制了Caspase-3的表達。

注： (a)原代培養(yǎng)3d的神經(jīng)球；(b)貼壁培養(yǎng)48h的神經(jīng)球；(c)貼壁培養(yǎng)1周后高、中劑量組NSCs分化程度最高；(d)呈nestin染色陽性的神經(jīng)球。Bars=50μm in (a～d)。圖1 各組NSCS體外培養(yǎng)和分化

組別Nestin/1 Caspase-3 /1對照組490071.02±181824.562351253.00±101321.54高劑量組1943574.61±324851.45a848715.63±64934.77a中劑量組1122378.63±553472.08ab935672.52±403184.70a低劑量組1087813.92±534776.30ab1325947.90±181482.68abc

注：與對照組比較，aP<0.05；與高劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

注： (a)高劑量組Caspase-3表達很弱；(b) 中劑量組Caspase-3表達亦很弱；(c) 低劑量組Caspase-3表達較強；(d)對照組Caspase-3表達最強。Bars=50μm in (a～d)。圖2 各組凋亡基因蛋白Caspase-3的表達

GFAP染色顯示，高劑量組表達最強(103343478.30±11652062.31)(見圖3(a))，中劑量組次之(79390065.33±12071396.27)(見圖3(b))，低劑量組較弱(49261482.33±17002176.95)(見圖3(c))，對照組最弱(21470592.54±10412377.04)(見圖3(d))，各組比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)(見表2)。加入IL-10后，可促進體外培養(yǎng)的胎鼠大鼠NSCs向神經(jīng)膠質細胞分化，并呈濃度依賴性。由表2及圖4可以看出，各組NSE染色并無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。加入IL-10后，對體外培養(yǎng)的胎鼠大鼠NSCs向神經(jīng)元方向分化無明顯影響。

注： (a) 高劑量組GFAP表達最強；(b) 中劑量組GFAP表達較強；(c) 低劑量組GFAP表達較弱(d)對照組GFAP表達最弱。Bars=50μm in (a～d)。圖3 各組GFAP表達情況

表2 各組神經(jīng)球分化后GFAP、NSE陽性細胞IOD值比較

注：與對照組比較，aP<0.05；與高劑量組比較，bP<0.05；與中劑量組比較，cP<0.05。

注： (a) 高劑量組、(b) 中劑量組、(c) 低劑量組、(d)對照組NSE陽性染色細胞無統(tǒng)計學差異。Bars=50μm in (a～d)。圖4 各組NSE陽性染色細胞

3 討論

神經(jīng)干細胞是神經(jīng)系統(tǒng)的始祖細胞，具有無限增殖、分化、遷移、趨化和低免疫原的生物特性[7]。干細胞的多潛能和自我更新特性賦予其在缺血、變性條件下以及創(chuàng)傷中再生丟失組織的能力，以幫助減輕腦損傷及改善腦損傷后的功能[8, 9]。研究表明，移植誘導分化的神經(jīng)干細胞的治療效果優(yōu)于直接移植未經(jīng)分化的神經(jīng)干細胞，經(jīng)誘導分化為不同階段的神經(jīng)細胞再用于移植時，可顯著降低成瘤風險[10～13]。目前，NSCs的應用不僅僅局限于移植治療腦損傷疾患，Sacco等[14]認為通過移植NSCs有可能治愈神經(jīng)精神類疾病，并推測神經(jīng)發(fā)育障礙的原因是NSCs增殖與分化的失衡所致。Ebrahim等[15]將體細胞重新編程轉化，誘導出所需NSCs，利用直接轉化/轉分化過程，繞過多能狀態(tài)，從而減少腫瘤發(fā)生和遺傳不穩(wěn)定的風險。盡管如此，NSCs的臨床應用仍面臨諸多難題，如何調(diào)控NSCs增殖，如何誘導NSCs定向分化成目標細胞，如何減輕腦損傷導致的炎癥反應對移植NSCs造成的影響等。

IL-10是Ⅱ型輔助T細胞分泌的細胞因子，不僅在免疫調(diào)節(jié)中起重要作用，還是調(diào)節(jié)巨噬細胞分泌的主要因子[16]。當中樞神經(jīng)損傷時，IL-10能降低過度而有害的免疫應答，并能激活浸潤的巨噬細胞，削弱膠質瘢痕生長，促進受損的神經(jīng)細胞修復[17]。而IL-10基因敲除的大鼠在永久性大腦中動脈梗死后死亡率明顯增加[18]。因此，眾多學者在研究NSCs移植時想方設法提高IL-10的分泌水平，以減輕腦損傷的炎癥反應，從而創(chuàng)造出利于移植NSCs增殖分化的微環(huán)境。Zhang等[19]將NSCs與IL-10制成混懸液進行移植，以降低促炎細胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的水平。Xu等[20]將NSCs誘導分化成神經(jīng)元，并加入白細胞抑制因子(LIF)，通過激活PI3K/Akt信號途徑，促進IL-10分泌，從而改善神經(jīng)元的存活?？梢姡贜SCs移植應用研究中IL-10愈來愈受到重視。筆者將IL-10與NSCs共培養(yǎng)，通過檢測NSCs、神經(jīng)元和神經(jīng)膠質細胞的特異性標記物nestin、NSE和GFAP來觀察其增殖及分化情況。另外凋亡基因Caspase-3表達量的比較可以判斷凋亡對NSCs存活率的影響[21]。結果表明，IL-10能顯著促進NSCs增殖，一方面與其內(nèi)在的分子機制相關，另一方面可能與抑制Caspase-3表達相關，減少了NSCs凋亡的發(fā)生。同時，IL-10能促進NSCs向神經(jīng)膠質細胞分化，但對其向神經(jīng)元方向分化作用不顯。

綜上所述，IL-10不僅能減輕腦損傷的炎癥反應，為移植NSCs創(chuàng)造有利的微環(huán)境，還能促進NSCs增殖，并影響NSCs的分化。下一步將構建表達IL-10的NSCs，進行體內(nèi)移植，并進一步研究IL-10 影響NSCs增殖分化的具體分子機制，為后續(xù)應用IL-10-NSCs移植治療神經(jīng)病理性疼痛提供實驗依據(jù)。