史靈燕 張云龍 劉保衛(wèi) 鄭素月

（河北工程大學(xué)園林與生態(tài)工程學(xué)院，河北邯鄲056021）

黑木耳（Auriculariaauricular）又名木耳、光木耳、云耳、黑耳子等，是我國著名的食用菌，食藥用價值高，在我國栽培歷史悠久。隨著食用菌市場的發(fā)展，現(xiàn)存市場相互引種頻繁，私自命名菌種繁多，種源不清，名稱混亂，菌種混亂問題日益嚴(yán)重，菌種糾紛頻發(fā)，而食用菌產(chǎn)業(yè)在菌種知識產(chǎn)權(quán)保護方面意識較弱，菌種保護管理制度也不夠健全。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，利用分子標(biāo)記鑒定不同地區(qū)、不同黑木耳菌株的研究報道越來越多[1-5]，而利用SRAP（sequence-relatedamplifiedpolymorphism）分子標(biāo)記鑒定生產(chǎn)中不同黑木耳菌株親緣關(guān)系的研究較少[1，6]。

SRAP分子標(biāo)記是一種基于PCR的新型分子標(biāo)記系統(tǒng)，目前廣泛地應(yīng)用于植物的物種遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析。相對于其他分子標(biāo)記方法，SRAP分子標(biāo)記在植物物種的遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析中能獲得更多的信息[7]。該標(biāo)記具有簡便、穩(wěn)定、高重復(fù)率、便于克隆目標(biāo)片段的特點，并已被應(yīng)用于圖譜構(gòu)建性狀的標(biāo)記和遺傳多樣性分析[8]。SRAP標(biāo)記技術(shù)已在木耳、平菇、香菇、靈芝、金針菇、雞腿菇、雙孢蘑菇、大球蓋菇等食用菌遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系分析上得到應(yīng)用[7，9-15]。筆者采用SRAP分子標(biāo)記，對收集到的北方地區(qū)24株栽培中常用的黑木耳菌株進行遺傳多樣性分析，明確其菌株間的親緣關(guān)系，以期為生產(chǎn)上黑木耳菌株的選擇、菌種管理及其栽培育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

黑木耳菌株主要來源于東北黑龍江、吉林、遼寧地區(qū)及河北平泉地區(qū)，詳見表1。

表1 供試黑木耳菌株及來源

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取、擴增和電泳檢測

將菌種活化后接種于平板上，25℃條件下進行隔膜培養(yǎng)。7d后取120mg新鮮菌絲體，液氮研磨成粉末，用植物基因組DNA提取試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）提取DNA，1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，紫外分光光度計測定DNA濃度和質(zhì)量，稀釋成50ng/μL，置于-20℃冰箱中備用。

1.2.2 SRAP擴增反應(yīng)體系

20μL反應(yīng)體系中，2×TapPCRMasterMix 10μL，上、下游引物各1μL，模板DNA1μL，用ddH2O補足體積。

SRAP擴增程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1min，35℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，5個循環(huán)；94℃變性1min，50℃復(fù)性1min，72℃延伸1min，35個循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃保存。

PCR擴增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，80V恒壓電泳45min，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察并拍照。

1.2.3 SRAP標(biāo)記引物序列

SRAP引物序列見表2，由上海生工生物工程股份有限公司合成，設(shè)計上游引物6條，下游引物8條，隨機組成48對引物組合。

表2 SRAP分子標(biāo)記引物序列表

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，將在瓊脂糖凝膠上出現(xiàn)DNA片段的記為1，不出現(xiàn)的記為0，統(tǒng)計后輸入電腦，用聚類分析軟件NTsys進行聚類分析，并計算遺傳相似度。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA檢測

DNA電泳檢測結(jié)果見圖1。電泳條帶清晰且亮度高，說明所提取的DNA純度高，可以進行后續(xù)的研究工作。

圖1 部分黑木耳菌株基因組DNA圖譜

2.2 引物篩選結(jié)果

選擇較廣泛栽培的黑木耳黑豐菌株DNA對48對引物組合進行初步篩選，圖2為48對SRAP引物組合對黑木耳菌株擴增的指紋圖譜。結(jié)果表明，有25對SRAP引物都能清晰地擴增出條帶，且條帶較多。每對引物組合樣本的擴增帶數(shù)目在2～9條不等，平均每對引物擴增條帶6條，說明本體系擴增效率較高。用篩選出的背景和條帶都比較清晰的25對引物組合分別對供試的24個黑木耳菌株DNA進行擴增。25對引物分別為：Me1-Em2，Me1-Em3，Me1-Em4，Me1-Em7，Me1-Em，8；Me2-Em1，Me2-Em1，Me2-Em3，Me2-Em4，Me2-Em7；Me3-Em2，Me3-Em3，Me3-Em4；Me4-Em1，Me4-Em3，Me4-Em5，Me4-Em7；Me5-Em2，Me5-Em2，Me5-Em4，Me5-Em5，Me5-Em6，Me5-Em7；Me6-Em6，Me6-Em7。

2.3 黑木耳菌株的SRAP指紋圖譜分析

25對引物對24個黑木耳菌株共擴增出133個位點，片段大小在0.1～1.5kb，平均每條引物的擴增位點為6個，其中多態(tài)性位點59個，平均多態(tài)性比率為40.5%（表3），部分引物對的SRAP-PCR的擴增圖譜見圖3和圖4。24個菌株的聚類分析結(jié)果見圖5所示，結(jié)果表明，供試的24個黑木耳菌株遺傳相似系數(shù)在0.56～1.0，當(dāng)遺傳相似系數(shù)在0.56時，24個黑木耳菌株分為2大類；第一類包括黑豐、黑29、黑威15號、大筋王、黑耳厚、厚筋6個菌株，其余黑威單片、黑威伴金、瑞寶、海元、黑三角等18個菌株為第二類菌株，說明每一類中這些菌株的遺傳背景相似，親緣關(guān)系比較近。其中，黑威15號、黑29和厚筋、黑耳厚、大筋王、黑豐之間的相似水平達98%；UR38、UR87、黑山與黑威單片、黑威伴金、瑞寶等15株菌株之間的相似水平也高達99%，表明其遺傳背景相近，也可能是由于市場混亂，屬于互相引種的同一個品種。

圖2 SRAP標(biāo)記引物篩選擴增圖譜

圖3 Me4-Em3引物對擴增黑木耳菌株DNA圖譜

圖4 Me4-Em7引物對擴增黑木耳菌株DNA圖譜

表3 SRAP-PCR擴增條帶統(tǒng)計

圖5 24個黑木耳菌株的SRAP聚類分析圖

3 小結(jié)與討論

SRAP標(biāo)記是一種基于PCR的新型標(biāo)記系統(tǒng)，通過正反向引物對ORFs區(qū)域中內(nèi)含子、啟動子進行特異擴增，因不同物種以及個體內(nèi)含子、啟動子與間隔區(qū)序列長度不等而產(chǎn)生多態(tài)性[16]。研究利用SRAP分子標(biāo)記法鑒定生產(chǎn)中常用的黑木耳菌株，具有重復(fù)性好，操作簡單，引物具有通用性，正反向引物可自由組合成引物對，引物使用率高，引物合成成本低的特點[17]，但與ISSR分子標(biāo)記相比多態(tài)性較低[18]。SRAP技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于食用菌的菌株分子鑒定、分類學(xué)研究、遺傳多樣性及親緣關(guān)系分析等方面[7，9-15]，為食用菌遺傳學(xué)研究和育種提供了依據(jù)。劉華晶等[9]利用SRAP技術(shù)對大興安嶺地區(qū)野生黑木耳菌株進行遺傳多樣性分析。利用SRAP法對黑木耳生產(chǎn)菌株進行鑒定和遺傳分析，旨在澄清黑木耳市場菌種混雜退化，解決生產(chǎn)中常用黑木耳菌株的同物異名和同名異物的問題。本研究中，從生產(chǎn)中收集的24株黑木耳菌株經(jīng)SRAP分子鑒定，PCR擴增獲得133個擴增位點，片段大小0.1～2.0kb，平均每條引物的擴增位點為6個，25對引物的133個擴增位點中，59個位點具多態(tài)性，平均多態(tài)性比率為40.5%，多態(tài)性豐富度較低；在遺傳系數(shù)0.56時分為了兩大類，第一類包括黑豐、黑29、黑威15號、大筋王、黑耳厚、厚筋6個菌株；第二類包括黑山與黑威單片、黑威伴金、瑞寶等18個黑木耳菌株。而黑29與黑威15號、厚筋與黑耳厚、大筋王、黑豐；UR38、UR87、黑山及其余15株菌株的遺傳相似系數(shù)為1.0，表明它們相互間不存在遺傳差異。

經(jīng)SRAP分子標(biāo)記技術(shù)鑒定生產(chǎn)中常用黑木耳菌株，結(jié)果表明生產(chǎn)中常用的黑木耳栽培菌株多態(tài)性較低，聚類分析分類也較少，從而進一步說明了生產(chǎn)中黑木耳栽培菌株存在同物異名現(xiàn)象。