□ 張 琳 賈 俊 吉林省產品質量監(jiān)督檢驗院 曲玉超 吉林天圓檢測有限責任公司付連娟 吉林省產品質量監(jiān)督檢驗院 武旭明 馮 吉 長春工業(yè)大學化學與生命科學學院

膽堿（choline）是一種強有機堿性化合物，在動物有機體內的存在形式主要為游離態(tài)膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂或鞘磷脂等。膽堿及其衍生物是對人體非常重要的一類具有生物功能的小分子代謝物，其重要意義在于能夠促進神經元的信息傳遞，特別是對嬰兒大腦的發(fā)育及代謝具有至關重要的作用。嬰幼兒由于攝入的食物比較單一，容易造成膽堿類物質缺失，可能因此造成免疫力降低、記憶力損害及腎臟損害等疾病[1,2]。國家標準GB 14880-2012對嬰幼兒配方奶粉中膽堿的添加限量作了明確規(guī)定，限量為 380 ～ 1 500 mg/kg[3]。

比較常見的膽堿檢測方法有雷氏鹽比色法[4]、高氯酸非水滴定法[5]、雷氏鹽質量法[6]等，由于選擇性不好，背景干擾因素比較多，可造成檢測偏差較大。

現(xiàn)行國家標準GB/T 5413.20-2013[7]采用酶反應顯色分光光度計法進行奸惡，這種檢測膽堿含量的方法，優(yōu)點是專屬性較強，缺點是缺少對水解液的凈化處理，其樣品中的核黃素等發(fā)色物質，經水解后顏色加深，容易造成樣品背景值增高；此外樣品中含有的維生素C等還原性物質，會影響酶的氧化反應，容易造成膽堿測定值偏低，為克服以上檢測過程中出現(xiàn)的問題，本文將提出一種改良的酶比色法，用于測定嬰幼兒乳粉中膽堿的含量。

1 實驗儀器與試劑

實驗儀器：紫外可見分光光度計（T6新世紀）、電子天平（Metteler Toledo ML204）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-6）、pH計（PHS-3C），離心機。

試劑：99%膽堿酒石酸氫鹽標準品、過氧化氫酶、膽堿氧化酶、磷脂酶D,4-氨基安替比林、三羥甲基氨基甲烷、鹽酸、氫氧化鈉與苯酚，活性炭粉，以上試劑皆為分析純。

2 實驗方法

2.1 實驗原理

膽堿經酸水解后，加入活性炭對水解液進行凈化，再經過酶氧化，然后發(fā)生顯色反應，最后使用分光光度法進行測試。

2.2 樣品處理

取5 g（精確到0.000 1 g）樣品，1 mol/L的鹽酸溶液30 mL，放在100 mL錐形瓶中，65～75 ℃水浴加熱，不時震蕩混勻，共需水解3 h，冷卻至室溫并用氫氧化鈉溶液（500 g/L）調pH為3.5～4.0，加入0.5～2.0 g活性炭后渦旋振蕩，離心過濾，將水解后的上清液轉入50 mL容量瓶中。加入12倍配置好的酶反應液，同時應保證測試時濾液呈弱堿性，在37 ℃左右保溫反應10～30 min，對樣品溶液進行測定。

2.3 實驗步驟分析

2.3.1 標準曲線

取2、4、6 mL與8 mL的膽堿標準溶液，按表1加入試劑，然后按照2.2中的方法進行處理。加入發(fā)色劑后，標準溶液發(fā)生顏色變化（見圖1），混勻，將試管用密封膜密封，置于水浴中37 ℃保溫反應15 min。

表1 標準曲線制備時的試劑添加量

圖1 標準溶液梯度顏色圖

2.3.2 活性炭含量對測試結果的影響

按表2中試劑的添加量要求，分別投放在準備好的8支試管中進行測試。通過以上的實驗得出結論，加入0.6 g活性炭能使測定樣品中還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫型，其吸附影響不明顯。由對比試管F、G、H可以看出，當不使用活性炭進行樣品脫色處理時，測定結果準確度較差，回收率和重現(xiàn)性降低。

2.3.3 試樣的測定

按表3所示的試劑添加量進行試驗，每個試樣都準備（B、C）2支試管。加入發(fā)色劑后標準溶液開始顏色反應，混勻后將試管用密封膜密封，置于水浴中37 ℃保溫反應15 min。

3 實驗結果

3.1 標準曲線方程

標準曲線方程為y=0.003 3x-0.018 2，相關系數(shù)R2=0.999 3，線性良好（見圖2）。

3.2 實驗結果

取4種不同嬰幼兒配方奶粉5 g，用改進的方法進行檢測，同一種樣品取平行樣，分別測膽堿含量，見表4。（檢出限為1 mg/100 g，定量限為3 mg/100 g）

表2 測定加標樣時的試劑添加量

表3 試劑添加量表格

圖2 膽堿的標準曲線圖

表4 膽堿含量

4 結論

通過添加活性炭等步驟，對檢測方法進行改良，去除了維生素C等還原性物質對酶氧化反應的影響并減小背景值，該方法對嬰幼兒乳粉中膽堿含量的測定更加準確、可行、高效。