王秀男，滕 霄，劉 彪，殷浩程，任翠平，劉 淼，沈際佳

免疫共沉淀(co-immunoprecipitation，Co-IP)技術(shù)作為檢測蛋白質(zhì)之間相互作用的經(jīng)典且常用方法被現(xiàn)代基礎(chǔ)醫(yī)學研究廣泛使用，具有靈敏性高、特異性強、可信度高、自然狀態(tài)下可操作且能夠?qū)Φ鞍装攵糠治龅葍?yōu)點[1-4]。腺病毒E1A結(jié)合蛋白p300(adenovirus E1A binding protein p300，p300)是一種組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶，分子量為300 ku。維甲酸相關(guān)孤兒核受體(retinoid-related orphan receptor gamma t，RORγt)是輔助性T細胞17(T helper cell 17，Th17)的特異性關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，分子量為72 ku。由于p300與RORγt蛋白大小懸殊較大且兩者相互作用，在實驗進程中發(fā)現(xiàn)由于p300與RORγt蛋白質(zhì)分子量差別較大，進行Co-IP時使用Protein A/G-磁珠或者Protein A/G-瓊脂糖珠很難做出真正顯示出其蛋白表達量且清晰準確的目的蛋白條帶，因此為解決此問題，本文選取p300與RORγt兩目的蛋白探究如何準確選取Protein A/G-磁珠或者Protein A/G-瓊脂糖珠進行Co-IP試驗。

1 材料與方法

1.1 材料來源Myc-RORγt、Flag-p300等相關(guān)質(zhì)粒由中國科學院上海巴斯德研究所李斌研究員提供。

1.2 主要試劑抗-RORγt(# 14-6988-82)購自上海EB生物公司；抗-p300(sc-48343)購自德國Santa Cruz生物公司；抗β-actin(BM0627)購自上海BOSTER生物公司；蛋白抑制劑Cocktail(#083M4021V)和抗-Myc(#2276)購自德國Sigma公司；抗-Flag (AT002) 抗體購自青島CMC生物公司；Opti-MEM培養(yǎng)基和抗-CD3/CD28 (11161D)Dynal beads購自美國Gibco公司；Protein A/G-磁珠 (LSKMAGA10)購自美國MILLIPORE公司；Protein A/G-瓊脂糖珠(A10001) 購自美國Abmart公司，重組人白介素6(recombinant human interleukin 6，rhIL-6)、rhIL-21、rhIL-23、重組人轉(zhuǎn)化生長因子β(recombinant human transforming growth factor β，rhTGF-β)、rhIL-1β、白介素4抗體(interleukin 4 antibody，anti-IL-4)、γ干擾素抗體(interferon-γ antibody ，anti-IFN-γ)均購自北京R&D公司。

1.3 HEK293T細胞人胚腎細胞系293T(human embryonic kidney 293T cells, HEK293T)培養(yǎng)于DMEM高糖完全培養(yǎng)基中，含10%胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS，美國Gibco公司) [內(nèi)含1%青霉素(即100 U/ml)、1%鏈霉素(即100 mg/ml)、1%谷氨酰胺]。

1.3.1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的HEK293T細胞以每孔1×106個鋪于6孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。第2天，細胞密度生長達到70%～90%時進行換液，Opti-MEM培養(yǎng)基900 μl /孔置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。以1 μg Myc-RORγt和3 μg Flag-p300為例，將1 μg Myc-RORγt和3 μg Flag-p300的質(zhì)粒DNA和100 μl OPTI-MEM培養(yǎng)基混合后加入12 μl 聚乙烯亞胺(polyethyleneimine，PEI)并渦旋振蕩2 s，混合均勻，點動離心，室溫靜置10 min。將上述質(zhì)粒和PEI混合液緩慢滴加到HEK293T細胞中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育5 h。5 h后去除含有轉(zhuǎn)染混合液的培養(yǎng)基，更換成含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。收取細胞進行實驗。為摸索最佳質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度，實驗設(shè)置了3組濃度對比，分別為：Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶2 μg或1 μg ∶3 μg或1 μg ∶4 μg。

1.3.2Co-IP實驗 收集細胞，加入300 μl 細胞裂解液(現(xiàn)配現(xiàn)用)，100 W超聲5 s后，4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)30 min。然后離心取上清液30 μl，加入30 μl 2×SDS上樣緩沖液作Input。將剩余約270 μl上清液中加入3 μg anti-Myc抗體于4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)3 h。洗滌Protein A/G-瓊脂糖珠或者Protein A/G-磁珠加入裂解的細胞中4 ℃垂直旋轉(zhuǎn)孵育過夜。清洗珠子，然后每管加40 μl上述洗滌液和10 μl 5×上樣緩沖液(SDS)，100 ℃，煮沸10 min，置于冰上冷卻進行SDS-PAGE電泳，然后轉(zhuǎn)膜：p300 (約300 ku)：110 v，3 h；RORγt (72 ku)；β-actin(42 ku)：110 V，1.5 h；封閉1 h后孵育一抗，4 ℃滾動搖床過夜，最后洗滌，室溫孵育二抗1 h，顯影。

1.4 CCK8實驗96孔板每孔5 000個HEK293T細胞培養(yǎng)24 h，根據(jù)試劑盒說明書進行CCK8 (CK04，上海東仁化學科技有限公司)檢測。

1.5 Th17細胞分化收集人臍血分離出單個核細胞，使用EasySepTMHuman Na?ve CD4+T Cell Isolation Kit(#28067)分選試劑盒分選出Na?ve T細胞，在anti-CD3/CD28 dynal beads的刺激下，50 ng/ml rhIL-6、25 ng/ml rhIL -21、100 ng/ml rhIL-23、 10 ng/ml rhIL-1β和1 ng/ml rhTGF-β等細胞因子和10 ng/ml anti-IL-4和10 ng/ml anti-IFN-γ兩個抗體條件下，Na?ve CD4+T細胞向Th17細胞分化，培養(yǎng)至第6天，收集細胞進行實驗。

2 結(jié)果

2.1 選取1 μg Myc-RORγt和3 μg Flag-p300轉(zhuǎn)染HEK293T細胞選取生長狀態(tài)良好的HEK293T細胞鋪板(6孔板)，培養(yǎng)24 h后，共轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶2 μg和1 μg ∶3 μg和1 μg ∶4 μg，見圖1，結(jié)果顯示Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶3 μg時轉(zhuǎn)染效果最佳(實驗重復3次以上)。

圖1 過表達Myc-RORγt和Flag-p300入HEK293T細胞

2.2 CCK8細胞活性實驗檢測為了排除轉(zhuǎn)染試劑PEI影響細胞活性而導致蛋白表達不均一的可能，實驗使用HEK293T細胞在96孔板中培養(yǎng)24 h后進行CCK8細胞活性實驗檢測，分別設(shè)置了PEI 8、10、12、14 μl，圖2顯示PEI 8、10、12 μl時細胞活性并未受影響，PEI 14 μl與8 μl比較時細胞活性略受影響(F=4.78，P=0.032)，為了保證細胞活性不受影響且能夠保證轉(zhuǎn)染效率，實驗最終選擇PEI 12 μl進行細胞轉(zhuǎn)染。

圖2 CCK8細胞活性實驗檢測 與PEI 8 μl比較：*P<0.05

2.3 HEK293T細胞中選取磁珠捕獲p300蛋白而選取瓊脂糖株捕獲RORγt體外細胞實驗共轉(zhuǎn)染Flag-p300和Myc-RORγt 入HEK293T細胞48 h后進行Co-IP，細胞裂解液用Flag抗體進行免疫沉淀，見圖3A；細胞裂解液用Myc抗體進行免疫沉淀，見圖3B，泳道1指使用磁珠捕獲蛋白，泳道2指使用瓊脂糖珠捕獲蛋白，圖3A、B可以看出使用磁珠比使用瓊脂糖珠捕獲p300蛋白效果要好，而捕獲RORγt蛋白效果則相反；圖3C(t=6.52，P=0.007，P<0.01)和圖3D(t=2.89，P=0.003，P<0.01)分別為對圖3A和圖3B 中目的蛋白灰度值比值統(tǒng)計分析，圖3C、3D數(shù)值來源于其對應的目的蛋白與對應的β-actin的比值，并且實驗均重復3次。

圖3 共轉(zhuǎn)染Flag-p300和 Myc-RORγt入HEK293T細胞免疫共沉淀

A：用磁珠捕獲p300蛋白進行Co-IP；B：用瓊脂糖株捕獲RORγt蛋白進行Co-IP；C：兩種珠子捕獲p300蛋白效果的統(tǒng)計圖；與磁珠比較：**P<0.01；D：兩種珠子捕獲RORγt蛋白效果的統(tǒng)計圖；與瓊脂糖珠比較：**P<0.01

2.4 Th17細胞中捕獲p300蛋白適合選取磁珠而捕獲RORγt適合選取瓊脂糖珠體內(nèi)細胞實驗中，收集誘導分化第6天的Th17細胞進行Co-IP，結(jié)果與HEK293T細胞結(jié)果一致，即捕獲p300大蛋白更適合使用磁珠而捕獲RORγt適合選取瓊脂糖株，差異有統(tǒng)計學意義(Th17-p300：t=6.893，P=0.008，P<0.01；Th17-RORγt：t=2.803，P=0.005，P<0.01)，見圖4。

3 討論

Co-IP是用于蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，其中捕獲蛋白步驟在Co-IP實驗過程中占據(jù)重要地位，首先篩選出質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染最佳比例，本研究結(jié)果顯示，Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶3 μg時轉(zhuǎn)染效果最佳；轉(zhuǎn)染過程中發(fā)現(xiàn)，同等條件下共轉(zhuǎn)染Myc-RORγt ∶Flag-p300為1 μg ∶4 μg時細胞狀態(tài)較差，Western blot顯示其β-actin表達較弱可能由于細胞轉(zhuǎn)染后細胞狀態(tài)變差。本研究發(fā)現(xiàn)在保證轉(zhuǎn)染試劑PEI既不會對細胞活性有毒性又保證轉(zhuǎn)染效率的情況下，共轉(zhuǎn)染Flag-p300和Myc-RORγt質(zhì)粒條件相同時，收取細胞進行Co-IP，結(jié)果顯示用磁珠捕獲p300蛋白比用瓊脂糖珠捕獲蛋白效果較好，而RORγt則相反，于是本研究得出結(jié)論對于大分子蛋白來說，使用磁珠進行Co-IP效果更佳，而中小分子蛋白則適合使用瓊脂糖珠。

圖4 Th17細胞免疫共沉淀

A：用磁珠捕獲p300蛋白進行Co-IP效果較好；B：用瓊脂糖株捕獲RORγt蛋白進行Co-IP效果較好；C：p300蛋白分別用磁珠和瓊脂糖珠捕獲蛋白進行Co-IP條帶灰度值統(tǒng)計分析；與磁珠比較：**P<0.01；D： RORγt蛋白分別用磁珠和瓊脂糖珠捕獲蛋白進行Co-IP條帶灰度值統(tǒng)計分析；與瓊脂糖珠比較：**P<0.01

由于目的蛋白分子量大小懸殊過大，兩者相互作用進行Co-IP可能影響實驗結(jié)果以及對實驗結(jié)果的判斷。查閱很多文獻發(fā)現(xiàn)Co-IP 步驟類似，其中捕獲蛋白使用的載體珠不同，總結(jié)出在分子量為35～110 ku蛋白使用Protein A/G-瓊脂糖珠捕獲蛋白[5-7]，分子量為114～290 ku 的范圍使用Protein A/G-磁珠捕獲蛋白[8-9]，當然也有較少文獻[10]使用Protein A/G-磁珠捕獲中分子量蛋白(65 ku)，也有較少文獻使用Protein A/G-瓊脂糖珠捕獲較大分子量蛋白(164 ku)[11]，本研究對使用Protein A/G-磁珠和Protein A/G-瓊脂糖珠在Co-IP過程中捕獲不同大小的蛋白，能夠幫助研究者們在進行Co-IP實驗選取較符合自己實驗試劑和方案方法。本實驗有利于研究者根據(jù)自己的試驗目的選取正確的載體微球進行Co-IP，降低實驗結(jié)果偏差而影響試驗目的的判斷。經(jīng)檢索中外文數(shù)據(jù)庫，均沒有文獻對層析介質(zhì)進行比較的研究報道。兩種微球在捕獲不同分子量蛋白效率不同，是由于其組成介質(zhì)的不同，抑或是Protein A/G比例用量以及偶聯(lián)方法不同等因素的影響，這是試劑研發(fā)和試劑使用選擇時值得關(guān)注的問題。