秦學(xué)潛，翁 皖，郭晶晶，吳 鋼

胰腺癌是一種惡性程度極高的腫瘤，約90%的胰腺癌為起源于胰腺上皮的導(dǎo)管腺癌，5年生存率不足5%，預(yù)后極差[1]。盡管在過(guò)去的20年間人們付出很大努力，其發(fā)病率和病死率近年來(lái)仍明顯上升。預(yù)計(jì)到2030年，胰腺癌將成為全球第2位癌相關(guān)的死因[2]。胰腺癌的病因尚不十分清楚，其發(fā)生可能與吸煙、飲酒、高脂及高蛋白飲食等有關(guān)，又由于早期沒(méi)有特殊癥狀易被忽視而導(dǎo)致沒(méi)有被及時(shí)診斷。因此，從分子水平探究胰腺癌發(fā)生、發(fā)展機(jī)制，在胰腺癌的診治與預(yù)后過(guò)程中尋找一種高特異性的診斷及預(yù)后指標(biāo)，對(duì)提高胰腺癌患者生存率至關(guān)重要。X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白(Zinc-finger protein X-linked，ZFX)是鋅指蛋白家族的一員，在調(diào)控基因表達(dá)、細(xì)胞分化及胚胎發(fā)育等過(guò)程中扮演著重要角色[3]。最新研究[4]表明，ZFX不僅參與細(xì)胞的自我更新，而且可以促進(jìn)惡性腫瘤的增殖、凋亡和遷移。但其與胰腺癌的相關(guān)性報(bào)道較少，這可能是由于對(duì)ZFX和胰腺癌之間的認(rèn)知和研究依然在起步的階段。為此，該研究采用免疫組化和Western blot檢測(cè)ZFX蛋白在胰腺癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其在生物學(xué)特性上對(duì)胰腺癌的影響，探討其在胰腺癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義，評(píng)價(jià)ZFX作為胰腺癌患者預(yù)后指標(biāo)的臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 病例資料60例配對(duì)的胰腺癌組織及癌旁無(wú)瘤組織均為上海市寶山區(qū)仁和醫(yī)院普外科2008年1月～2012年12月手術(shù)切除標(biāo)本，均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)。所有患者術(shù)前均未化療或放療，有完整的臨床病理資料。男28例，女32例，年齡≥60歲的33例，<60歲的27例，平均年齡為70.6歲；按AJCC7胰腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：0期2例，Ⅰ期8例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例，Ⅳ期12例；病理證實(shí)均為胰腺癌，按Edmondson’s標(biāo)準(zhǔn)[5]：高分化20例，中分化24例，低分化16例。所有標(biāo)本的收集均經(jīng)患者知情同意，并在手術(shù)切除后立即采集2份，1份置于滅活RNA酶的凍存管中液氮冷凍保存，另1份經(jīng)10%甲醛固定后石蠟包埋。

1.2 主要試劑鼠抗人ZFX單克隆試劑抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司(稀釋濃度1 ∶200)；鼠抗人β-actin單克隆抗體(稀釋濃度1 ∶500)、全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；山羊抗鼠IgG(稀釋濃度1 ∶100)、通用型SP免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒和supersignal發(fā)光試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1免疫組化和結(jié)果判定 ZFX蛋白陽(yáng)性信號(hào)定位于細(xì)胞核，因此以細(xì)胞核染色呈棕黃色為陽(yáng)性，對(duì)染色的程度進(jìn)行評(píng)分。細(xì)胞染色程度：陰性為0分，輕度為1分，中度為2分，重度為3分；在高倍鏡下對(duì)切片進(jìn)行觀察并記錄著色細(xì)胞的比例，著色細(xì)胞占記數(shù)細(xì)胞的百分率≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～100%為3分，將每張切片染色程度得分與染色細(xì)胞百分率得分各自相加為其最后得分:0分為陰性(-)，1～2分為弱陽(yáng)性(+)，3分為陽(yáng)性(++)，4～6分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。為統(tǒng)計(jì)方便，最終將++～+++定義為陽(yáng)性，而其他定義為陰性[6]。

1.3.2Western blot分析 稱取100 mg胰腺癌組織，按組織和細(xì)胞裂解液1 ∶10的比例加入全細(xì)胞裂解液，于冰上勻漿器充分勻漿后12 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清液提取總蛋白，用酶標(biāo)儀于592 nm波長(zhǎng)行Bin-choninic Acid (BCA法)蛋白定量。煮沸(使蛋白變性)8 min后，按每孔60 μg蛋白量上樣，以12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濃縮膠80 V恒壓跑至分離膠后，電壓調(diào)至120 V直至分離膠底部，后經(jīng)半干轉(zhuǎn)膜法以1～1.5 mA/cm2恒流電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，PVDF膜置于一抗稀釋液(1 ∶1 000稀釋)中4 ℃過(guò)夜，PBST及PBS洗膜10 min×3次，再置于二抗稀釋液(1 ∶1 000稀釋)中室溫孵育2 h，PBST及PBS洗膜10 min×3次，加入化學(xué)發(fā)光底物(super signal west)，顯影，β-actin作為內(nèi)參照，用Quantity One 4.3.1凝膠圖象分析系統(tǒng)掃描ZFX蛋白灰度值，取不同泳道蛋白的灰度值與相應(yīng)內(nèi)參β-actin的比值代表各蛋白的相對(duì)表達(dá)水平，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫組化檢測(cè)ZFX蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)情況ZFX蛋白的表達(dá)位于組織細(xì)胞的細(xì)胞核。胰腺癌組織中ZFX蛋白的陽(yáng)性反應(yīng)呈染色均一的棕黃色或棕褐色顆粒，陽(yáng)性率為63.3%(38/60)；而癌旁組織也可見ZFX蛋白的陽(yáng)性表達(dá)，但反應(yīng)顏色較淺，呈淺黃色，陽(yáng)性率為36.7%(22/60)，明顯低于相應(yīng)癌組織(P<0.001)，圖1A-C。

2.2 Western blot方法檢測(cè)ZFX蛋白在胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)情況ZFX蛋白在胰腺癌組和癌旁組中的相對(duì)表達(dá)量分別為(0.61±0.05)和(0.25±0.08)，兩組之間蛋白的相對(duì)表達(dá)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.311，P<0.05)。見圖2。

圖1 ZFX蛋白在胰腺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

A：癌旁組織中ZFX蛋白陰性表達(dá)；B：胰腺癌組織中ZFX蛋白陽(yáng)性表達(dá)(+++)；C：胰腺癌及癌旁組織中ZFX蛋白表達(dá)強(qiáng)度評(píng)分；與胰腺癌組織比較：***P<0.001

圖2 Western blot法檢測(cè)ZFX蛋白在部分胰腺癌及癌旁組織中的表達(dá)

T：胰腺癌組織；A：癌旁組織；1～4：任意選取4對(duì)胰腺癌組織及癌旁組織

2.3 ZFX蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系胰腺癌組織中ZFX蛋白的表達(dá)水平與胰腺癌患者的年齡、性別、分化程度和腫瘤大小、部位等臨床病理指標(biāo)均不相關(guān)(P>0.05)，而與腫瘤的TNM分期和淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.01)，見表1。

2.4 胰腺癌ZFX表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系60例獲得隨訪患者中，ZFX蛋白陰性的胰腺癌患者的總生存中位時(shí)間為16.5個(gè)月(95%CI：10.83～22.17)，ZFX陽(yáng)性表達(dá)患者總生存中位時(shí)間為7.0個(gè)月(95%CI：5.87～8.13)，兩者比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank值=17.784，P<0.001)。見圖3。

表1 ZFX蛋白表達(dá)與胰腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖3 ZFX陽(yáng)性表達(dá)與陰性表達(dá)胰腺癌患者的生存曲線

3 討論

ZFX是鋅指蛋白家族的一員，其含有13個(gè)C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)。ZFX基因位于哺乳動(dòng)物的X染色體上，其表達(dá)在哺乳動(dòng)物中呈高度保守性，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)酸性轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、一個(gè)核定位序列及一個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)。由于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，鋅指蛋白可以選擇性地結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。ZFX在多種干細(xì)胞的自我更新和抗凋亡機(jī)制中起著重要作用[8]。近來(lái)研究[9-11]發(fā)現(xiàn)ZFX在前列腺癌、腦癌、腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤、喉癌、胃癌、淋巴瘤等多種人類惡性腫瘤中過(guò)表達(dá)，在致癌轉(zhuǎn)化中起重要作用。如在非小細(xì)胞肺癌中，ZFX可以通過(guò)調(diào)節(jié)MMP2的表達(dá)促進(jìn)肺癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，而此過(guò)程需要PI3K/Akt和STAT3的參與[11]。在膽囊癌中，miR-101通過(guò)直接作用于ZFX的啟動(dòng)子，抑制ZFX的表達(dá)，從而阻斷TGF-β/Smad誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[9]。

本研究免疫組化和Western blot結(jié)果均顯示胰腺癌組織中存在ZFX蛋白的異常高表達(dá)，即ZFX蛋白在胰腺癌組織中的表達(dá)率(63.3%)顯著高于癌旁組織(36.7%)，其在胰腺癌組織中的表達(dá)量(0.61±0.05)也顯著高于癌旁組織(0.25±0.08)，提示ZFX可能在胰腺癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮作用。在與胰腺癌臨床病理相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)ZFX蛋白的過(guò)表達(dá)與胰腺癌的TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，TMN分期中Ⅱ～Ⅳ期的ZFX陽(yáng)性率明顯高于0～Ⅰ期，提示ZFX的表達(dá)與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，即ZFX可能參與了胰腺癌的惡性進(jìn)展過(guò)程。

另有研究[4]發(fā)現(xiàn)ZFX可促進(jìn)膽囊癌細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移，臨床資料顯示ZFX是膽囊癌獨(dú)立預(yù)后因素。ZFX作為miR-144下游一個(gè)重要效應(yīng)分子參與胃癌的骨轉(zhuǎn)移，并且體外實(shí)驗(yàn)提示上調(diào)miR-144還可以抑制ZFX來(lái)促進(jìn)胃癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶的敏感性[12]。細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)表明，ZFX可以通過(guò)調(diào)控ERK-MAPK信號(hào)通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞株SGC7901和MGC803的增殖和抑制其凋亡[12-13]。Lai et al[14]發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞肝癌組織中，ZFX蛋白和信使RNA的水平顯著高于癌旁非腫瘤組織。ZFX siRNA抑制人肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期發(fā)生G0/G1期阻滯，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。這些研究體現(xiàn)了ZFX在惡性腫瘤中的重要功能。在胰腺癌研究領(lǐng)域，該分子與胰腺癌臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系鮮有報(bào)道[15]。本研究中Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果提示ZFX表達(dá)陽(yáng)性的患者的總體生存率明顯低于陰性患者，提示ZFX是胰腺癌預(yù)后影響因素，因此一定程度上可以作為胰腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，研究中ZFX蛋白在胰腺癌中高表達(dá)，與胰腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。胰腺癌組織中ZFX表達(dá)陰性者預(yù)后優(yōu)于表達(dá)陽(yáng)性者，或許可作為胰腺癌預(yù)后獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，有助于對(duì)預(yù)后作出指導(dǎo)和預(yù)后情況的及時(shí)了解。然而對(duì)于ZFX作用、分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，以期為探討胰腺癌發(fā)病的分子機(jī)制提供幫助，也為胰腺癌的靶向治療提供新的思路。