陳 潁，周家德，顏士杰，肖 蘭

卵巢上皮性腫瘤是女性生殖系統(tǒng)最常見的卵巢腫瘤，一經(jīng)確診超過70%已是中晚期，從而導(dǎo)致了易復(fù)發(fā)、預(yù)后差以及病死率高等特點，因此，找尋與卵巢癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的診斷指標(biāo)對深入了解卵巢癌的發(fā)病機(jī)制具有重要的意義。

人類的FAT4亦稱之FAT-J，于2004年首次報道[1]，F(xiàn)AT4是一種單跨膜蛋白受體，與調(diào)控哺乳動物的細(xì)胞分化、組織發(fā)育相關(guān)。研究表明，F(xiàn)AT4蛋白在食管癌[2]、肝癌[3]中表達(dá)均顯著降低；在胃癌中，F(xiàn)AT4低表達(dá)可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖[4]；另有報導(dǎo)，乳腺癌中FAT4表達(dá)缺失與FAT4啟動子甲基化有關(guān)[5]；Bossuyt et al[6]報道，F(xiàn)AT4作為一個細(xì)胞黏附蛋白可影響細(xì)胞的遷移運動。國內(nèi)外對FAT家族的研究主要集中于FAT1，而對FAT4研究較少，目前對于FAT4與卵巢惡性腫瘤的研究幾乎未見報道。本實驗應(yīng)用免疫組化法比較正常卵巢組織及上皮性卵巢癌組織中FAT4表達(dá)，及其與臨床病理特征間的聯(lián)系；FAT4體外干預(yù)對上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖和侵襲力的影響，以探討上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展與 FAT4 表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 病例資料及試劑選取2016年1月～2018年12月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理確診上皮性卵巢癌的石蠟標(biāo)本60例 (患者術(shù)前均未行放化療或生物治療)，分為實驗組及對照組。實驗組：年齡48～55(52.21±2.82)歲，其中Ⅰ～Ⅱ期18例，Ⅲ～Ⅳ期42例。卵巢腫瘤按照WHO組織學(xué)分級標(biāo)準(zhǔn)分為：漿液性腺癌25例，黏液性腺癌27例，其他類型8例；對照組：年齡47～53(50.07±3.74)歲，同期因非卵巢疾病手術(shù)患者的正常卵巢組織30例。所有入組患者均為初診且臨床病例資料完整，均知情并簽訂知情同意書。A2780購自上?；鄯f生物有限公司；RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；FAT4兔抗人多克隆抗體購自英國Abcam公司；CCK-8試劑盒購自上海碧云天公司；TRIzol(總RNA抽提試劑) 購自美國Gibco公司；脂質(zhì)體Lipofectamine2000 購自美國Invitrogen公司；FAT4- siRNA購自美國Santa Cruz公司；PVDF膜購自美國Millipore公司。

1.2 免疫組織化學(xué)方法檢測FAT4蛋白將患者的臨床病理資料，如年齡、月經(jīng)情況、病理類型、腫塊大小、臨床分期、腫瘤分級與FAT4表達(dá)進(jìn)行比較。免疫組織化學(xué)方法進(jìn)行FAT4檢測，所有石蠟塊標(biāo)本均連續(xù)切片，切片厚度4 μm，切片先行抗原修復(fù)，再經(jīng)脫蠟、脫二甲苯、3% H2O2封閉和枸櫞酸修復(fù)液微波修復(fù)，F(xiàn)AT4一抗?jié)舛纫? ∶150稀釋， 4 ℃孵育過夜，次日常規(guī)復(fù)溫，抗兔二抗以1 ∶2 000稀釋，37 ℃孵育30 min，PBS漂洗5 min×3次，滴加5% DAB顯色。再經(jīng)蘇木精復(fù)染、乙醇化、脫水以及中性樹膠封片固定，室溫風(fēng)干后光鏡下觀察。細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核中為棕褐色細(xì)顆粒狀為陽性。結(jié)果判定FAT4蛋白陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)或核呈棕黃色顆粒，每例樣本隨機(jī)觀察10個高倍視野(×200)，鏡下無陽性細(xì)胞為陰性(-)，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為弱陽性(1+)，陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%為陽性(2+)，陽性細(xì)胞數(shù)>25%為強(qiáng)陽性(3+)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞于含10%小牛血清RPMI1640培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合度達(dá)到70%左右時行轉(zhuǎn)染，實驗分3組：未轉(zhuǎn)染組(空白對照組)、FAT4-NC組、FAT4-siRNA組，具體轉(zhuǎn)染步驟按Lipofectamine 2000試劑說明書上操作，轉(zhuǎn)染4 h后更換為1640完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別提取RNA及蛋白用于Q-PCR及Western blot檢測FAT4抑制情況。

1.4 FAT4基因在mRNA水平檢測TRIzol提取細(xì)胞總RNA，定量后取2 μg反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。SYBR GREEN熒光實時定量q-PCR方法進(jìn)行檢測FAT4基因表達(dá)情況。FAT4上游引物序列：5′-ATTTAGGACCAGAAGCGAGAA-3′，下游：5′-CTCTCCACTTTCCCAGCAA-3′；β-actin上游引物序列：5′- GTGGCCGAGGACTTTGATTG -3′；下游5′- CCTGTAACAACGCATCTCATATT -3′。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，60 ℃延伸1 min，共40個循環(huán)。設(shè)3個復(fù)孔，所有反應(yīng)進(jìn)行3次，2-ΔΔCT法分析A2780細(xì)胞中FAT4基因表達(dá)情況及siRNA對FAT4基因的敲除效果。

1.5 Western blot檢測細(xì)胞FAT4蛋白表達(dá)30 μg蛋白質(zhì)樣品行SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上；5% BSA室溫封閉2 h，0.05%Tween20的TBS緩沖液(TBST)漂洗3次，每次10 min；加入FAT4一抗(1 ∶500)，GAPDH一抗(1 ∶5 000)，4 ℃過夜，1×TBST漂洗3遍，相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1 ∶5 000) 37 ℃搖床溫育2 h，ECL顯色曝光，采集照片。

1.6 CCK-8法檢測各組細(xì)胞的增殖情況PBS洗滌細(xì)胞，0.25%胰酶消化細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104/ml，100 μl/孔接種于96孔板，設(shè)5個復(fù)孔。接種后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每孔更換新鮮培養(yǎng)基，各加入10 μl/的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處各孔吸光度OD值。重復(fù)3次，取平均值。

1.7 體外侵襲實驗常規(guī)洗滌消化細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，上室加入細(xì)胞濃度為8×103/ml的細(xì)胞懸液200 μl，下室加入含100 ml/L小牛血清的培養(yǎng)基500 μl。放置37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，取出小室，乙醇固定，結(jié)晶紫染色，風(fēng)干鏡檢，混勻后計數(shù)下室細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 上皮性卵巢癌組織過表達(dá)FAT4免疫組化顯示FAT4主要表達(dá)于上皮性卵巢癌細(xì)胞質(zhì)及胞核，表現(xiàn)為棕黃色顆粒，著色明顯，正常卵巢上皮細(xì)胞幾乎不著色。相比較正常卵巢上皮組織，上皮性卵巢癌組織中顯著高表達(dá)FAT4，F(xiàn)AT4蛋白陽性表達(dá)率相比(71.7%vs16.7%)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見圖1、表1。

2.2 FAT4表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理的關(guān)系FAT4表達(dá)與上皮性卵巢癌患者的年齡、月經(jīng)情況、病理類型無明顯相關(guān)性(P>0.05)，而與上皮性卵巢癌腫瘤大小(P=0.020)、FIGO分期(P=0.002)以及病理分級(P=0.029)有明顯相關(guān)性(P<0.05)，見表2。

圖1 FAT4蛋白表達(dá) ×200

A：FAT4在正常卵巢上皮細(xì)胞中表達(dá)為(-)；B：弱陽性(1+)；C：陽性(2+)；D：強(qiáng)陽性(3+)

表1 正常卵巢上皮及上皮性卵巢癌組織中 FAT4陽性表達(dá)率比較(n)

表2 FAT4表達(dá)與上皮性卵巢癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 siRNA對A2780細(xì)胞FAT4 mRNA及蛋白表達(dá)的影響A2780細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，Western blot結(jié)果顯示：細(xì)胞轉(zhuǎn)染后48 h，F(xiàn)AT4-siRNA組較對照組及FAT4-NC組FAT4蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖2；實時熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)FAT4 -siRNA組FAT4 mRNA水平相比較FAT4-NC及對照組亦明顯下調(diào)(P<0.05)，見圖3。

圖2 細(xì)胞中FAT4蛋白表達(dá)比較1:對照組; 2: FAT4-NC組; 3: FAT4-siRNA組

圖3 細(xì)胞中FAT4 mRNA相對表達(dá)量比較

1:對照組; 2:FAT4-NC組; 3:FAT4-siRNA組;與對照組比較：*P<0.05；與FAT4-NC組比較：#P<0.05

2.4 FAT4-siRNA對A2780細(xì)胞增殖的影響轉(zhuǎn)染48 h后，F(xiàn)AT4-siRNA組A2780細(xì)胞增殖較對照組及FAT4-NC組細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.01)。見圖4。

圖4 CCK-8法檢測A2780細(xì)胞增殖情況

1:對照組; 2: FAT4-NC組; 3: FAT4-siRNA組;與對照組比較：**P<0.01；與FAT4-NC組比較：##P<0.01

圖5 各組細(xì)胞的侵襲能力 結(jié)晶紫染色×400 1：對照組; 2: FAT4-NC組; 3: FAT4-siRNA組

2.5 FAT4-siRNA對A2780細(xì)胞侵襲的影響鏡下檢測結(jié)果顯示FAT4-siRNA組穿過微孔膜的細(xì)胞數(shù)目明顯少于對照組及FAT4-NC組，見圖5；經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，F(xiàn)AT4-siRNA組同其他兩組間存在顯著差異(P<0.01)，見圖6。說明FAT4基因促進(jìn)了人卵巢癌細(xì)胞A2780的體外侵襲能力。

圖6 穿過微孔膜A2780細(xì)胞百分比比較

1：對照組; 2: FAT4-NC組; 3: FAT4-siRNA組;與對照組比較：**P<0.01；與FAT4-NC組比較：##P<0.01

3 討論

人類FAT基因是果蠅ft基因的同源基因。ft基因通過參與調(diào)控Hippo通路和影響平面細(xì)胞極性在果蠅的整個發(fā)育過程發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。近來年，關(guān)于FAT基因家族的研究才廣泛開展起來。從蛋白組織觀點看，F(xiàn)AT蛋白的分子量是鈣黏超家族中最大的一類，作為一種單次跨膜受體蛋白，由32～34次重復(fù)鈣黏蛋白組成。

FAT家族主要包括FAT1、FAT2、FAT3、FAT4蛋白4個重要成員。已經(jīng)證實FAT1和FAT4與腫瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。FAT4在胃癌、乳腺癌、肝癌等多種惡性腫瘤的表達(dá)率顯著低于正常組織，表現(xiàn)為抑癌基因作用；Cai et al[7]研究提示FAT4蛋白在胃癌組織中表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)AT4 mRNA表達(dá)也顯著低于癌旁組織，且FAT4陰性表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、短生存期密切相關(guān)；細(xì)胞水平也證實低表達(dá)FAT4可促進(jìn)胃癌細(xì)胞發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移，提示FAT4是一個抑癌基因；Sun et al[8]報道外周血中異常FAT4甲基化與胃癌高風(fēng)險有關(guān)。而FAT4是否具有癌基因功能目前尚未見報道。

人們已發(fā)現(xiàn)在FAT四個亞型中，F(xiàn)AT1亞型既有抑癌作用又有致癌作用。在直腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤和頭頸部腫瘤中FAT1表達(dá)下調(diào)，但在乳腺癌、白血病和黑色素瘤中FAT1表達(dá)卻為上調(diào)[9-10]。那么FAT4基因是否也具有這種雙重特性呢？筆者發(fā)現(xiàn)與正常卵巢上皮組織比較，上皮性卵巢癌中FAT4高表達(dá)，提示FAT4高表達(dá)與上皮性卵巢癌發(fā)生有關(guān)；FAT4表達(dá)與上皮性卵巢癌患者年齡、病理類型無明顯相關(guān)，而與腫瘤大小、FIGO分期以及病理分級明顯相關(guān)。隨著上皮性卵巢癌FIGO分期提高，F(xiàn)AT4陽性表達(dá)率明顯升高，且上皮性卵巢癌分期越晚，F(xiàn)AT4陽性表達(dá)率越高，提示FAT4過表達(dá)與上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展呈正相關(guān)，F(xiàn)AT4過表達(dá)可能促進(jìn)腫瘤增殖，導(dǎo)致腫瘤體積增長較快，推測FAT4可能是卵巢腫瘤癌基因的候選者之一。

相關(guān)機(jī)制研究[11]發(fā)現(xiàn)FAT4表達(dá)缺失可使Hippo通路中斷，進(jìn)而導(dǎo)致乳腺腫瘤形成，當(dāng)小鼠FAT4表達(dá)恢復(fù)后其致瘤性明顯下降，提示FAT4通過Hippo信號通路在乳腺癌中起到抑癌基因作用。Bossuyt et al[6]發(fā)現(xiàn)FAT4敲除并未使小鼠肝臟形成腫瘤，F(xiàn)AT4未起到腫瘤抑制作用。該研究推測在不同組織中FAT4與Hippo通路互作不同。在結(jié)腸癌中FAT4通過調(diào)節(jié)PI3K-AKT信號傳導(dǎo)通路[12]，抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而進(jìn)一步抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力。與FAT4敲除小鼠相比，F(xiàn)AT4過表達(dá)小鼠的結(jié)腸腫瘤明顯縮小。本實驗結(jié)果顯示FAT4基因在上皮性卵巢癌A2780細(xì)胞中高表達(dá)，F(xiàn)AT4-siRNA轉(zhuǎn)染A2780細(xì)胞沉默F(xiàn)AT4基因后，A2780細(xì)胞的增殖和侵襲能力明顯受到抑制，而其作用機(jī)制尚需更多深入的研究進(jìn)一步驗證。

卵巢癌的發(fā)生發(fā)展是多因素共同參與的過程，通過各種信號調(diào)節(jié)通路相互協(xié)調(diào)制約。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)FAT4與卵巢癌細(xì)胞增殖及侵襲相關(guān)，下一步將深入研究FAT4通過激活哪些信號促進(jìn)腫瘤生長和腫瘤遷移及其具體分子機(jī)制，為尋找有效的治療卵巢癌的分子靶點提供前期研究及理論基礎(chǔ)。