王麗敏，舒適，楊娟，*

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽550025；2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550014）

楮樹（Broussonetia papyrifera），又名構(gòu)樹，為灌木類?？茦?gòu)屬植物，雌雄異株[1]。楮實(shí)子為構(gòu)樹的干燥成熟果實(shí)，資源豐富，具有悠久的藥用歷史，我國藥典有收載。楮實(shí)子（Fructus Broussonetiae）始載于漢代《名醫(yī)別錄》，味甘性寒無毒，具有滋腎益陰、利水消腫的功效；周峰等研究顯示楮實(shí)子含有豐富的氨基酸、脂肪酸、生物堿、多糖等化學(xué)成分[2]，龐素秋對中藥楮實(shí)子的抗衰老活性成分進(jìn)行了研究，闡述了楮實(shí)子補(bǔ)腎作用機(jī)理及其抗衰老的物質(zhì)基礎(chǔ)與分子機(jī)理[3]。楮桃即構(gòu)樹果實(shí)，其果汁中含有大量營養(yǎng)物質(zhì)，其中可溶性糖和生理活性物質(zhì)類黃酮的含量較高，且含有較多的維生素和可溶性蛋白質(zhì)及多種礦質(zhì)元素。有研究以楮實(shí)為主要原料，經(jīng)過最佳的發(fā)酵工藝，研制出一款營養(yǎng)豐富、酸甜爽口、風(fēng)味獨(dú)特的果酒，這種果酒也是一種新型營養(yǎng)保健飲品[4]。周文美等以新鮮楮桃和番茄為主要原料，通過酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵，制作出楮桃和番茄復(fù)合型果醋，并對其生產(chǎn)工藝和工藝參數(shù)進(jìn)行了研究[5]。

目前對楮實(shí)的研究甚少，文獻(xiàn)多為歷代本草記載的有關(guān)中醫(yī)學(xué)理論的綜述性文章，關(guān)于楮實(shí)多糖的研究更是寥寥少數(shù)。因此本文充分利用傳統(tǒng)中藥資源楮實(shí)，從中提取得到楮實(shí)多糖，并進(jìn)一步對其抗疲勞作用進(jìn)行考察，將有利于傳統(tǒng)中藥楮實(shí)活性成分及營養(yǎng)保健機(jī)理的深入研究，對楮實(shí)資源的開發(fā)利用奠定前期基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

楮實(shí)鮮果，采自貴州省貴陽市藥用植物園內(nèi)，經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定為?？茦?gòu)屬植物構(gòu)樹Broussonetia papyrifera（Linn.）Vent 聚花果。

昆明種小鼠，雌雄各半，6 周～8 周齡，體重（20±2）g，貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。肌糖原及肝糖原測定試劑盒、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）測試盒、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）測試盒：南京建成生物工程研究所。

游泳箱（大小約 50 cm×50 cm×40 cm）[6]、BUCHIR220 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Switzerland 公司；HP-8453 紫外可見分光光度儀：惠普公司；DZ-2BC 真空干燥箱：天津泰斯特儀器有限公司；TDL-40C 低速臺(tái)式離心機(jī)、TGL-16B 高速臺(tái)式離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 楮實(shí)粗多糖（crude polysaccharide from Broussonetia papyrifera，CS）制備

參考響應(yīng)面分析法優(yōu)化楮實(shí)多糖提取工藝[7]，楮實(shí)鮮果經(jīng)60 ℃真空干燥后粉碎過80 目篩，用80%乙醇提取2 h，提取至提取液顏色變?yōu)榈S色為止，抽濾得固體粉末，再經(jīng)60 ℃真空干燥制得楮實(shí)粉備用。取楮實(shí)粉置于圓底燒瓶中，按料液比1 ∶10（g/mL）加入蒸餾水至提取罐中，沸水浴提取2 h。提取液室溫（37 ℃左右）冷卻過濾，合并濾液，濃縮冷卻至室溫（37 ℃左右），經(jīng) 4 000 r/min 離心 15 min，重復(fù)提取 3 次后，提取液合并，上清液減壓濃縮至一定體積后，加入95%乙醇進(jìn)行醇沉，終濃度不低于80%。所得沉淀依次用無水乙醇、丙酮洗滌，真空干燥得粗多糖。參考苯酚-硫酸法對慈姑多糖含量的測定[8]，制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線以及測定樣品中多糖的含量。

1.2.2 楮實(shí)多糖的抗疲勞活性研究

1.2.2.1 動(dòng)物分組及給藥劑量

取健康小鼠120 只，雌雄各半，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白對照組，楮實(shí)多糖低劑量組（CS-L）、中劑量組（CS-M）、高劑量組（CS-H）3 個(gè)劑量組。每組 30 只，自由攝食和飲水，給藥劑量為：20、50、80 mg/（kg·d）；空白組給予等體積生理鹽水。每天根據(jù)小鼠體重定時(shí)灌胃給藥（按 0.1 mL/10 g），飼養(yǎng)溫度（20±3）℃，濕度（55±6）%。

1.2.2.2 小鼠疲勞模型的建立

小鼠在（30±2）℃水中不負(fù)重游泳60 min 造成疲勞，游泳停止后90 min 和150 min，每組隨機(jī)抽取10 只小鼠取肌肉、肝臟和血清樣品測定肌糖原、肝糖原、乳酸脫氫酶和血尿素等指標(biāo)[9-11]。

1.2.2.3 肌糖原和肝糖原含量的測定

小鼠經(jīng)脫頸椎處死后立即取新鮮肝臟和肌肉樣本用生理鹽水漂洗后，濾紙吸干，稱重（質(zhì)量≤100 mg）。按照樣本質(zhì)量（mg）∶堿液體積（μL）=1 ∶3，一起加入試管中，沸水浴煮20 min，流水冷卻，使樣品水解。加蒸餾水配制成糖原檢測液，肝糖原測定的蒸餾水添加量（mL）為肝重的96 倍，肌糖原測定的蒸餾水添加量（mL）為肌肉的16 倍。按照試劑盒的說明，進(jìn)行肌糖原和肝糖原含量的測定。

1.2.2.4 乳酸脫氫酶活力的測定

小鼠斷頭取血，室溫（37 ℃左右）下放置30 min后，4 000 r/min 離心10 min 得上層透明液為小鼠血清。按照試劑盒的說明，進(jìn)行乳酸脫氫酶活力的測定。

1.2.2.5 尿素氮含量測定

樣品操作同1.2.2.4。

1.3 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，并進(jìn)行ANOVA 分析，多重比較采用 Dunnet’s 法，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 楮實(shí)多糖含量測定

以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，其相應(yīng)的吸收值為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=6.348 5x+0.015 7，式中：x 為葡萄糖含量，mg；y 為吸光度），相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9。取楮實(shí)多糖樣品液，于波長490 nm處測定吸光度值，代入回歸方程，計(jì)算其多糖含量為6.03 mg/g。

2.2 楮實(shí)多糖對糖原含量的影響

肝糖和肌糖是機(jī)體內(nèi)貯存糖原的主要方式，在運(yùn)動(dòng)過程，肌肉對肌糖原的需求增加，肝糖原快速分解，釋放葡萄糖快速入血，維持機(jī)體血糖以滿足運(yùn)動(dòng)肌肉對糖的需求，且肌糖原和肝糖原對維持機(jī)體運(yùn)動(dòng)的耐力較重要[12]。小鼠運(yùn)動(dòng)前后肌糖原含量、肝糖原含量、肌糖原儲(chǔ)備增長率及恢復(fù)率的變化見表1～表3。

表1 小鼠運(yùn)動(dòng)前后肌糖原含量的變化Table 1 Changes in muscle glycogen contents before and after exercise in mice

表2 小鼠運(yùn)動(dòng)前后肝糖原含量的變化Table 2 Changes of liver glycogen contents before and after exercise in mice

表3 運(yùn)動(dòng)前后小鼠肌糖原儲(chǔ)備增長率及恢復(fù)率變化Table 3 Changes in muscle glycogen reserve growth and recovery rate in mice before and after exercise

由表1～3 可知，在肌糖原和肝糖原含量的變化中，靜息時(shí)CS3 個(gè)劑量組20、50、80 mg/（kg·d）與對照組相比差異顯著（P＜0.05）；運(yùn)動(dòng)后3 個(gè)劑量組的糖原含量仍顯著高于對照組，其中50 mg/kg·d 劑量組的糖元儲(chǔ)備增長率和恢復(fù)率要明顯好于其他組。說明楮實(shí)多糖能增加糖原儲(chǔ)備，為機(jī)體提供更多能源物質(zhì)。

肌糖原、肝糖原和血糖是機(jī)體內(nèi)的三大糖儲(chǔ)備。當(dāng)糖原耗竭，將會(huì)影響運(yùn)動(dòng)的持久力，因此肌糖原含量可作為反映疲勞程度的重要指標(biāo)[13]。由表3 可知，楮實(shí)多糖低、中、高劑量均能夠增加小鼠肝糖原和肌糖原的恢復(fù)率，其中肌糖元儲(chǔ)備增長率分別為33.18%、39.49%、23.84%，且中劑量組效果比較好。

2.3 楮實(shí)多糖對乳酸脫氫酶活力的影響

乳酸脫氫酶是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，它能將機(jī)體劇烈運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生并堆積在肌肉中的乳酸轉(zhuǎn)化為丙酮酸，減少乳酸在肌肉中的堆積。不同給藥劑量對LDH 活力的影響見表4。

表4 小鼠運(yùn)動(dòng)前后乳酸脫氫酶活力變化Table 4 Changes of lactate dehydrogenase activity before and after exercise in mice

游泳前各給藥組的LDH 活力明顯高于對照組，游泳后90 min 的LDH 活力高于游泳前，游泳后150 min相比游泳后90 min 的LDH 活力有所下降，但仍略高于對照組，存在顯著差異（P＜0.05），其中以50 mg/（kg·d）劑量組為最佳。說明楮實(shí)多糖能提高乳酸脫氫酶活力，可以加速肌肉中過多乳酸的清除，達(dá)到減緩疲勞和加速疲勞恢復(fù)的作用[14]。

2.4 楮實(shí)多糖對小鼠血尿氮含量的影響

尿素氮是體內(nèi)氨基酸分解代謝的最終產(chǎn)物之一，機(jī)體血清尿素氮含量隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加而增加。由表5 和表 6 所示。

表5 小鼠運(yùn)動(dòng)前后血尿素氮含量變化Table 5 Changes of blood urea nitrogen before and after exercise in mice

小鼠在靜息時(shí)給藥組體內(nèi)尿素氮含量明顯小于對照組，運(yùn)動(dòng)后血尿素含量升高，各給藥組運(yùn)動(dòng)后血尿氮增加量均顯著小于對照組。各給藥組對血尿素的清除速率均顯著大于對照組，其中以50 mg/kg·d 效果為最好，清除速率達(dá)到25.67%，清除速率值越大抗疲勞效果越好。當(dāng)給藥劑量增加至80 mg/kg·d 時(shí)，抗疲勞效果并無顯著差異。從血尿氮的增量來看，各劑量組的增量都小于對照組，表明楮實(shí)多糖能夠抑制或減少疲勞小鼠血清尿素氮的產(chǎn)生，提高小鼠的抗疲勞能力。

表6 各劑量對清除速率和小鼠運(yùn)動(dòng)后血尿氮增量的影響Table 6 Effects of different doses on clearance rate and blood urine nitrogen increment after exercise in mice

3 結(jié)論

疲勞是機(jī)體復(fù)雜的生理生化變化過程，引起身體與精神狀態(tài)的下降，進(jìn)而導(dǎo)致工作能力及工作效率的衰退，肝糖原、血清尿素氮及其乳酸含量通常作為檢測疲勞的生化指標(biāo)[15]。肝糖原的主要作用是維持血糖的相對穩(wěn)定，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長，血糖水平開始下降，肝糖原分解作用增加，一旦肝糖原分解耗竭，會(huì)使運(yùn)動(dòng)肌功能不足，導(dǎo)致外周疲勞[16-17]。本研究表明楮實(shí)抗疲勞作用可能與增加肝糖原的儲(chǔ)備有關(guān)。當(dāng)機(jī)體長時(shí)間運(yùn)動(dòng)，不能得到肝糖原分解代謝產(chǎn)生的足夠能量時(shí)，機(jī)體蛋白質(zhì)與氨基酸分解，產(chǎn)生大量尿素氮。機(jī)體尿素氮含量隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷增加而增加，機(jī)體對負(fù)荷的適應(yīng)能力越差，血清尿素氮的增加就越明顯。在實(shí)驗(yàn)中3 個(gè)多糖劑量組對血尿素的清除速率均顯著大于對照組，其中以50 mg（/kg·d）效果為最好，清除速率達(dá)到25.67%，且多糖劑量組的血尿氮增量低于對照組，說明楮實(shí)多糖能夠抑制或減少疲勞小鼠血清尿素氮的產(chǎn)生，提高小鼠的抗疲勞能力。

楮實(shí)粗多糖的20、50、80 mg（/kg·d）劑量組均能顯示出具有提高小鼠在運(yùn)動(dòng)前后體內(nèi)肌糖原和肝糖原儲(chǔ)備量、乳酸脫氫酶活力及降低血尿氮含量的功效，發(fā)現(xiàn)楮實(shí)多糖對小鼠有明顯的抗疲勞作用，在本實(shí)驗(yàn)條件下，小鼠抗疲勞作用與多糖濃度表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，隨著給藥劑量增加，其作用增強(qiáng)，其中50 mg（/kg·d）劑量抗疲勞效果最好，繼續(xù)增大給藥量其抗疲勞結(jié)果無顯著差異。