樊輕亞，許衛(wèi)軍，代春美

(1.信陽職業(yè)技術學院 藥學院，河南 信陽 464000;2.中國中醫(yī)科學院，北京 100700)

倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)是著名的藥用植物，以根及全草入藥，有清熱利濕、散瘀止血、止咳等功效[1-2]。倒提壺的主要成分是吡咯里西啶類生物堿，在臨床中有著非常重要的藥用價值[3-5]。姚志道[6]和買買素唐[7]等發(fā)現(xiàn)倒提壺生物堿治療神經(jīng)衰弱具有較好的療效。劉清華等[8]研究發(fā)現(xiàn)，毛果天芥菜堿對實驗腫瘤系統(tǒng) Walker-256 系統(tǒng)有顯著活性。陳昭文等[9]研究發(fā)現(xiàn)綠花倒提壺堿(Virdiflorine)具有增強小鼠心肌耐缺氧作用。Pandey 等[10]發(fā)現(xiàn)天芥菜堿能顯著降低尼古丁所致的神經(jīng)節(jié)激動效應，而刺凌德草堿(Echinatine)不僅有神經(jīng)節(jié)阻滯作用，還能增強腎上腺素的升壓作用。因此，研究倒提壺中生物堿具有很好的臨床應用價值。

雙水相萃取系統(tǒng)(Aqueous two-phase system，ATPS)是由兩種化學結構不同的親水性聚合物，或一種親水性聚合物、低分子量親水性有機溶劑與無機鹽在水中以適當濃度而形成的互不相容的兩水相系統(tǒng)，利用目標物在兩相中的不同分配特性從而實現(xiàn)分離[11-12]。雙水相體系最早發(fā)現(xiàn)于1896 年，經(jīng)過近半個世紀的發(fā)展，雙水相萃取技術已應用于生物、食品、醫(yī)藥以及稀有金屬的分析[13-15]。近年來雙水相體系發(fā)展迅速，在中藥有效成分的萃取分離中逐漸得到應用，顯示了良好的應用前景[16-19]。由于其具有操作環(huán)境溫和，不改變目標物質(zhì)的生物活性，避免了使用有機溶劑，且操作條件簡單，節(jié)約成本，符合綠色化學的發(fā)展要求，因此是一種具有極大發(fā)展前景的萃取技術。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術具有較高的靈敏度、選擇性和重現(xiàn)性，可確保復雜基質(zhì)中目標分析物的準確定量[20-22]。本文首次將雙水相萃取技術引入中藥材倒提壺中有效成分的分離，采用 UHPLC-MS/MS技術建立了倒提壺中8種生物堿(天芥菜品、毛果天芥菜堿、綠花倒提壺堿、天芥菜堿、天芥菜定、刺棱德草堿、仰臥天芥菜堿、歐天芥菜堿)含量測定的方法，從而為更加全面地控制倒提壺藥材的質(zhì)量，開發(fā)倒提壺制劑提供了可靠依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

DFY-200搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市大德中藥機械有限公司)；美國 Waters Xevo TQ-MS型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源；天芥菜品、毛果天芥菜堿、綠花倒提壺堿、天芥菜堿、天芥菜定、刺棱德草堿、仰臥天芥菜堿、歐天芥菜堿對照品(純度為98.5%，武漢ChemFaces有限公司)；甲醇、乙腈(色譜純，美國默克公司)。實驗用倒提壺藥材均購于網(wǎng)絡藥材市場，經(jīng)鑒定為倒提壺(CynoglossumamabileStapfetDrumm)全草。

1.2 實驗方法

1.2.1 乙醇回流法提取生物堿稱取一定量粉碎過100目篩的倒提壺藥材，加4倍量95%乙醇回流3次，每次1.5 h，過濾，濾液合并，濃縮，備用。

1.2.2 雙水相體系的配制稱取一定量的K2HPO4·3H2O，加入一定量的水，超聲溶解，加入30%乙醇，振搖，靜置，使形成乙醇/磷酸氫二鉀雙水相體系。

1.2.3 雙水相法萃取提取液(ATPE)取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏，用鹽酸或氨水分別調(diào)節(jié)水相 pH 值。加入EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相溶液，25 ℃下超聲萃取20 min，取上清液，轉入分液漏斗靜置分層后，取上層有機相待測。

1.2.4 溶劑法萃取提取液(SE)取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏，用稀鹽酸溶液超聲溶解后置于分液漏斗中，氯仿萃取后，旋干，用甲醇定容后，待測。

1.2.5 反膠束法萃取提取液(RME)[23]取經(jīng)“1.2.1”提取后的倒提壺生物堿粗提液浸膏，以 KCl調(diào)節(jié)水相的離子強度，加入4倍體積的二(2-乙基己基)磷酸酯/二(2-乙基己基)丁二酸酯磺酸鈉(DOLPA/AOT)-異辛烷反膠束溶液，電磁攪拌萃取后取上層有機相轉移至一錐形瓶中，加入等體積的水，室溫下進行電磁攪拌反萃取 30 min后，轉入分液漏斗靜置分層，取下層水相待測。

1.2.6 對照品溶液的制備精密稱取8種對照品各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，得各對照品儲備液。分別吸取儲備液各1 mL，置于50 mL容量瓶中，用甲醇定容后即得混合對照品溶液。

1.3 樣品分析條件

1.3.1 色譜條件色譜柱：ACQUITY UPLC BHE C18(50 mm×2.1 mm，1.7μm，美國Waters公司)；流動相：乙腈(A)-0.1 mol/L醋酸銨(B)，梯度洗脫程序:0～2 min，5%～15%A；2～7 min，15%～40%A;7～10 min，40%～80%A;10～12 min，80%～5%A；柱溫：30 ℃；流速：0.3 mL/min；進樣量：3 μL。

1.3.2 質(zhì)譜條件電噴霧離子源：ESI；檢出模式：正離子模式；離子源溫度：100 ℃；質(zhì)量掃描范圍：10～600m/z；干燥氣(N2)流速：10.0 L/min；干燥氣溫度：350 ℃；毛細管電壓：3.5 kV；錐孔氣流量：50 L/h；碰撞氣流量：2.5 L/h。

2 結果與討論

2.1 雙水相體系的篩選及萃取條件的優(yōu)化

影響雙水相萃取的因素較多，為了篩選合適的雙水相體系，本文采用單因素實驗方法考察乙醇質(zhì)量分數(shù)、磷酸氫二鉀質(zhì)量分數(shù)、萃取劑與樣品的相比、水相體系的pH值等萃取條件，研究了各萃取條件對倒提壺中8種生物堿萃取率的影響。

2.1.1 雙水相體系成相物質(zhì)的篩選將無水乙醇與不同的無機鹽按一定比例混合，按是否成相及成相的難易程度，成相范圍的寬窄等為指標，初步篩選雙水相的成相物。實驗考察了不同無機鹽(NH4)2SO4、K2HPO4·3H2O、Na2CO3、CaCl2、Na2SO4、NaCl與乙醇形成雙水相的性質(zhì)，結果顯示，K2HPO4·3H2O、(NH4)2SO4能與無水乙醇形成穩(wěn)定的雙水相體系，而Na2CO3、Na2SO4雖然也能與無水乙醇形成雙水相，但成相范圍很窄，下相容易產(chǎn)生沉淀，其他無機鹽則不能與無水乙醇形成雙水相體系。

進一步采用濁點滴定法繪制EtOH/(NH4)2SO4與EtOH/K2HPO4·3H2O兩種雙水相體系的相圖。由實驗可知，在醇的質(zhì)量濃度較小時，分相所需的無機鹽的量較大，乙醇/K2HPO4雙水相體系比EtOH/(NH4)2SO4體系的分相曲線更接近原點，在鹽質(zhì)量濃度相同的情況下僅需較少的醇即可形成雙水相體系，說明EtOH/K2HPO4·3H2O比EtOH/(NH4)2SO4更易形成雙水相，故本實驗選擇EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相體系進行后續(xù)研究。

2.1.2 EtOH和K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分數(shù)對8種生物堿萃取率的影響EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相體系的成相原理為乙醇與鹽之間對水分子的締合競爭，因此醇與鹽的質(zhì)量分數(shù)對體系的構成與性質(zhì)，以及目標物的萃取都具有極大的影響。兩相質(zhì)量分數(shù)的變化會改變體系的成相行為，進而影響生物堿在兩相中的分配。在實驗條件下，調(diào)節(jié)萃取劑與樣品相比為6∶1，萃取劑pH值為4.0，對無水乙醇和K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分數(shù)進行考察，結果見圖1。

由圖1A可知，固定K2HPO4·3H2O質(zhì)量分數(shù)為20%，8種生物堿的萃取率隨乙醇質(zhì)量分數(shù)的增大呈先增大后降低趨勢，且當乙醇質(zhì)量分數(shù)為30%時，8種生物堿的提取率最大。這是因為乙醇比例增大時，分相范圍增大，有利于倒提壺生物堿的分配及萃取。但當乙醇比例大于30%時，下相有晶體析出，體系不穩(wěn)定，所以萃取率下降，因而選30%乙醇作為最佳比例。

由圖1B可知，固定乙醇質(zhì)量分數(shù)為30%，倒提壺生物堿的萃取率隨著K2HPO4·3H2O質(zhì)量分數(shù)的增加呈先增大后減小趨勢。這是因為隨著K2HPO4·3H2O質(zhì)量分數(shù)的增大，分相能力也增大，倒提壺中的生物堿更易增溶到上相中，故萃取率升高，當K2HPO4·3H2O的質(zhì)量分數(shù)超過20%時，分子間相應碰撞增加，分相時間延長，上相體積減小，溶液中分子間的作用力增大，使得生物堿分子不易進入上相。此外，K2HPO4·3H2O的加入量較多時，鹽較難完全溶解，不利于物質(zhì)在相間的擴散，故萃取率先增大后減小。最終確定K2HPO4·3H2O的最佳質(zhì)量分數(shù)為 20%。

圖2 雙水相萃取劑與樣品的相比對倒提壺中8種生物堿萃取率的影響Fig.2 Effect of aqueous two-phase and sample ratios on extraction efficiencies of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm1.heliotrine；2.lasiocarpine；3.heliotridine；4.supinine；5.echinatine ；6.heliosupine；7.virdiflorine；8.europine

圖3 萃取劑pH值對倒提壺中8種生物堿萃取率的影響Fig.3 Effect of pH value on extraction efficiencies of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm1.heliotrine；2.lasiocarpine；3.heliotridine；4.supinine；5.echinatine ；6.heliosupine；7.virdiflorine；8.europine

2.1.3 萃取劑與樣品相比對8種生物堿萃取率的影響萃取劑與樣品的相比會影響固相和液相之間的傳質(zhì)推動力。取“1.2.1”提取后的生物堿儲備液，分別加入Et(OH)(30%)/K2HPO4·3H2O(20%)雙水相萃取劑，調(diào)節(jié)萃取劑pH值為4.0，按萃取劑與樣品的相比分別為1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1、10∶1時考察萃取物體積與雙水相萃取劑用量的相比對萃取率的影響(見圖2)。結果顯示，隨著萃取劑用量的增大，倒提壺生物堿的萃取率逐漸增大，當萃取劑和樣品相比為6∶1時，萃取劑基本可將倒提壺中的生物堿萃取完全，繼續(xù)增加萃取劑，萃取效率變化不大。這是因為液料比越小，兩相間的濃度差越小，從而傳質(zhì)推動力就越小，所以萃取率較低。隨著液料比的提高，傳質(zhì)推動力得到提高，但成本也相應增加，萃取劑與樣品相比大于6∶1時，萃取率已無明顯變化，綜合考慮，最終選擇萃取劑與樣品的最佳配比為6∶1。

2.1.4 不同pH值對8種生物堿萃取率的影響pH值的改變會影響磷酸鹽的解離，從而影響EtOH/K2HPO4·3H2O體系的相間電位和物質(zhì)的分配系數(shù)，同時物質(zhì)本身的結構和性質(zhì)也會隨pH值的變化而變化。取“1.2.1”提取后的生物堿儲備液，分別加入Et(OH)(30%)/K2HPO4·3H2O(20%)雙水相萃取劑，并使萃取劑與樣品的體積比為6∶1，通過采用氨水調(diào)節(jié)萃取劑的 pH值，考察了不同pH值對倒提壺中生物堿萃取效果的影響。由圖3可知，生物堿的萃取率隨著水相pH值的升高而增加，在pH 值4.0時，萃取率最大，隨著 pH 的繼續(xù)增大，溶液中帶正電荷的生物堿離子逐漸減少，生物堿主要以游離分子存在(pH 8.0)，其與EtOH/K2HPO4·3H2O間的靜電引力逐漸降低，從而導致其萃取率也逐漸降低，當pH為12.0時，萃取率幾乎為0，因此實驗選擇最佳pH值為4.0。

綜上所述，采用EtOH/K2HPO4·3H2O萃取倒提壺中生物堿，最佳萃取條件為30%乙醇/20%K2HPO4·3H2O，萃取劑pH值為4.0，萃取劑與樣品相比為6∶1。

圖4 藥用倒提壺經(jīng)雙水相萃取后的提取液總離子流圖Fig.4 TIC chromatogram of extract from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm by aqueous two-phase extraction1.heliosupine；2.lasiocarpine；3.virdiflorine；4.heliotrine；5.heliotridine；6.echinatine；7.supinine；8.europine

2.2 色譜-質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜條件的優(yōu)化對倒提壺雙水相萃取后提取液進行UHPLC分析，采用乙腈、甲醇與不同濃度氨水、醋酸銨的不同配比作為流動相系統(tǒng)進行考察。結果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈作為流動相時峰形更加尖銳，在流動相中加入一定比例的醋酸銨可以改善峰形和提高離子化效率，且醋酸銨為揮發(fā)性物質(zhì)，可減少對色譜柱的損害。因此，實驗選擇乙腈-0.1 mol/L醋酸銨溶液為流動相，在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，8種目標化合物可以得到良好分離，且各色譜峰的峰形好、峰對稱、柱效高，所得總離子流圖如圖4所示。

2.2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化分別用質(zhì)譜電噴霧電離源正離子模式和負離子模式對8種生物堿進行質(zhì)譜分析，結果發(fā)現(xiàn)負離子模式下幾乎無質(zhì)譜響應，因此選擇 ESI(+)作為離子化模式，分別找出這8種化合物的[M+H]+準分子離子峰，并對干燥氣體、霧化氣壓力、干燥氣流量等參數(shù)進行優(yōu)化，然后對母離子進行碰撞誘導解離，選擇2個信噪比較高的特征子離子分別作為定量和定性離子對，8種化合物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)見表1。在ESI(+)-MS/MS條件下，8種化合物主要發(fā)生側鏈酯鍵的斷裂和吡咯里西啶母核與整個側鏈的斷裂，8種化合物的質(zhì)譜裂解途徑見圖5。

表1 8種生物堿的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters of 8 alkaloids

圖5 8種生物堿的質(zhì)譜裂解途徑Fig.5 Fragmentation pathways of 8 compounds alkaloids1.heliosupine；2.lasiocarpine；3.virdiflorine；4.heliotrine；5.heliotridine；6.echinatine；7.supinine；8.europine

2.3 線性范圍、檢出限與加標回收率

取8種生物堿標準溶液，分別配制成一系列濃度的混合標準品，按“1.2.3”方法進行雙水相萃取，按“1.3”方法進行測定，以峰面積(Y)為縱坐標，以質(zhì)量濃度(X，mg/L)為橫坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程，按信噪比S/N=3，計算檢出限。精密稱取已測定含量的倒提壺樣品，分別向其添加低、中、高 3個濃度水平的標準溶液，每個水平做6個平行，計算其平均回收率。8種生物堿的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限及實際樣品加標回收率結果見表2。由表可知，8種生物堿在線性范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均在0.99以上，檢出限為0.03～0.10 mg/L，8種生物堿的回收率為91.5%～97.6%，相對標準偏差(RSD)不大于3.0%，方法體現(xiàn)了較高的精密度和準確度。

表2 8種生物堿的標準工作曲線、線性范圍、檢出限，及其在實際樣品中的回收率Table 2 Calibration curves, linear ranges and detection limits of 8 alkaloids， and their recoveries in real sample

2.4 穩(wěn)定性與重復性

精密稱取倒提壺藥材細粉6份，按實驗方法分別進行萃取、處理和測定，取樣品和對照品溶液于室溫下放置0～24 h后，進行含量測定。結果表明穩(wěn)定性和重復性的RSD均小于2.0%，方法具有良好的重復性和穩(wěn)定性。

2.5 萃取分析及應用

精密稱取3個產(chǎn)地的倒提壺藥材各100 g，采用雙水相萃取在最優(yōu)條件下萃取藥材中的生物堿，按“1.3”方法測定其含量，并與“1.2.4”溶劑萃取法及“1.2.5”反膠束萃取法進行對比，結果見表3。

表3 不同產(chǎn)地倒提壺藥材8種生物堿的提取分析結果(n=3)Table 3 Analytical results of 8 alkaloids from Cynoglossum amabile Stapf et Drumm obtained with different origins(n=3)

由表3可知，與傳統(tǒng)的溶劑萃取技術以及反膠束萃取技術相比，經(jīng)EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相萃取后,倒提壺中各種生物堿的萃取效率為傳統(tǒng)溶劑萃取法的2.5倍左右，比反膠束萃取法高20%左右。此外，傳統(tǒng)溶劑萃取法操作復雜、萃取效率低，且有機溶劑用量大、殘留多。反膠束萃取法也需使用有機溶劑，且萃取效率低于雙水相法。由此可見，雙水相萃取技術的操作簡單、萃取效率高，且避免使用有機溶劑、成本低，是一種實用的綠色環(huán)保萃取分離技術。此外，本文采用UHPLC-MS/MS檢測方法具有分析時間短(10 min)、溶劑消耗少等特點。因此，本文所建立的分析方法適用于該中藥材多指標成分的定量檢測。

從表3還可以看出，在所有產(chǎn)地的倒提壺中以天芥菜堿的含量最高，毛果天芥菜堿次之。此外，不同產(chǎn)地倒提壺中的生物堿含量分布明顯不同，其中云南產(chǎn)倒提壺中生物堿含量明顯高于其他2個產(chǎn)地。因此，在提取倒提壺中生物堿有效活性成分時，應根據(jù)不同產(chǎn)地、氣候及環(huán)境選擇原料，以獲得更高的提取率。

3 結 論

本文將EtOH/K2HPO4·3H2O雙水相萃取技術應用于倒提壺中生物堿的萃取，并優(yōu)化了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定生物堿含量的條件。本萃取方法利用水作為萃取體系，避免使用或盡可能少使用有機溶劑，可選擇性地將目標生物堿與其他雜質(zhì)進行分離，萃取效率高，易于工藝放大和連續(xù)操作，且溶劑可以循環(huán)利用，降低了環(huán)境污染，是一種具有極大發(fā)展前景的萃取技術。進一步采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定倒提壺中生物堿的含量，實現(xiàn)了對不同產(chǎn)地倒提壺中生物堿含量的檢測和評價。該方法簡單快速、準確靈敏，可為倒提壺制劑的開發(fā)及質(zhì)量控制提供可靠依據(jù)。