張宇辰 劉晶瑩 李世英 袁淑靜 章慧豐

有研究顯示，慢性牙周炎是由牙齦卟啉單胞菌、中間普氏菌等牙周致病菌引起的牙齦和牙周組織的慢性感染性疾病，而牙周致病菌可引起宿主自身的免疫防御和炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生大量細(xì)胞因子［1］。其中TNF-α、IL-6、IL-8等炎癥因子在慢性牙周炎病理過程中發(fā)揮重要作用，能引起牙周組織的繼發(fā)性損傷，進(jìn)而加重牙周組織的破壞［2］。有研究表明，TNF-α、IL-6和IL-8在慢性牙周炎患者的牙周膜等牙周組織中呈高表達(dá)，并且其表達(dá)水平隨炎癥程度的加重而有升高趨勢(shì)［3］。有研究顯示，通過唾液中所含的分子物質(zhì)可檢測(cè)多種疾病狀態(tài)，并且唾液具有與組織、血漿相似的miRNA表達(dá)譜，特異性的miRNA在唾液、病變組織和血液中均會(huì)發(fā)生明顯變化［4］。因此，唾液中miRNA具有作為疾病診斷及治療靶點(diǎn)的潛力。miRNA是非編碼內(nèi)源性小分子RNA，長(zhǎng)度約19～24 nt，其在腫瘤、感染性疾病及自身免疫性疾病等的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用［5］。大量研究顯示，miRNA的異常表達(dá)與慢性牙周炎密切相關(guān)［6-7］。本研究旨在檢測(cè)唾液中miR-193a在慢性牙周炎的表達(dá)水平，分析其與TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14等炎癥因子的相關(guān)性，探索唾液中miR-193a作為檢測(cè)慢性牙周炎的生物標(biāo)志物的意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2017-06～12于天津市人民醫(yī)院口腔科就診的慢性牙周炎患者100例，其中男57例，女43例，年齡21～68歲，平均（44.7±21.9）歲。入組患者均符合1999年牙周病分類國(guó)際研討會(huì)制定的慢性牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［8］。納入標(biāo)準(zhǔn)：①無口腔或局部炎癥，包括扁桃體炎、咽炎等；②無免疫性疾病、傳染病或其他全身性疾病；③近3個(gè)月未服用抗生素、未經(jīng)過牙周基礎(chǔ)治療；④婦女無妊娠及哺乳。另選取本院同期體檢的牙周健康者50例作為健康對(duì)照組，其中男22例，女28例，年齡24～66歲，平均（46.2±19.3）歲。

1.2 方法

1.2.1 唾液標(biāo)本采集 于清晨采用棉簽法采集慢性牙周炎組和健康對(duì)照組受試者的唾液標(biāo)本。在唾液采集前2 h受試者需空腹，禁止抽煙、劇烈運(yùn)動(dòng)及情緒劇烈波動(dòng)等。采樣時(shí)受試者采取坐位、頭稍前傾，用棉簽蘸檸檬酸以刺激唾液分泌，于1.5 min后吐出唾液；然后將唾液標(biāo)本收集于10 ml無RNA酶的離心管中，立即于4℃下3 000 r／min離心15 min，取上清液；將收集好的唾液上清凍存于-80℃冰箱待檢測(cè)。

1.2.2 臨床牙周指標(biāo)檢查 檢查記錄牙周臨床指標(biāo)，包括菌斑指數(shù)（PLI）、牙齦指數(shù)（GI）、牙周探診深度（PD）和附著喪失（AL）。根據(jù)PD、GI、AL以及牙槽骨吸收程度，將慢性牙周炎患者分為3組，輕度牙周炎組（n＝41）：GI＞1，AL為1～2 mm，PD≤4 mm，牙槽骨吸收＜根長(zhǎng)1／3；中度牙周炎組（n＝37）：GI＞1，AL為3～4 mm，4 mm＜PD≤6 mm，牙槽骨吸收為根長(zhǎng)1／3～1／2；重度牙周炎組（n＝22）：GI＞1，AL≥5 mm，PD＞6 mm，牙槽骨吸收＞根長(zhǎng)1／2。

1.2.3 qRT-PCR檢測(cè) 采用mirVana PARISKit試劑盒（Amhion，加拿大）提取和純化唾液上清中的總RNA，提取步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。用Smartspec plus分光光度儀（Bio-Rad，美國(guó)）檢測(cè)唾液上清中提取總RNA的濃度和純度，進(jìn)行RNA濃度、純度、完整性測(cè)定。

采用One Step PrimeSeripp miRNA cDNA Synthesis反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）將提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，U6作為miR-193a的內(nèi)參對(duì)照；用StepOne Plus實(shí)時(shí)定量PCR儀（ABI，美國(guó)）嚴(yán)格按照試劑盒的操作說明進(jìn)行miR-193a的RT-PCR檢測(cè)。將miR-193a反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在95℃下預(yù)變性10 min，95℃變性15 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。每例樣品及對(duì)照均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，取平均值。反應(yīng)結(jié)束后，由軟件自動(dòng)得出熒光反應(yīng)曲線以及每個(gè)標(biāo)本反應(yīng)體系的擴(kuò)增效率及Ct值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 ELISA檢測(cè) 采用Human TNF-αQuantikine ELISA Kit、Human IL-6 Quantikine ELISA Kit、Human IL-8 Quantikine ELISA Kit、Human IL-14 Quantikine ELISA Kit試劑盒（eBioscience，美國(guó)）分別檢測(cè)唾液上清中TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14的含量。取試劑盒中的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋；然后取酶標(biāo)包被板分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣品孔，在相應(yīng)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)品50μl、樣品稀釋液40μl、待測(cè)樣品10μl，37℃下溫育30 min后，進(jìn)行洗板、加酶、溫育、洗板、顯色、終止；加終止液15 min內(nèi)以空白調(diào)零，依序測(cè)量各孔450 nm波長(zhǎng)的吸光光度值（A值）。

1.2.5 Relative operating characteristic curve（ROC）曲線分析 miR-193a診斷慢性牙周炎的診斷效能通過ROC曲線下面積（AUC）進(jìn)行計(jì)算。0.7≤AUC＜0.8為可接受判別力，0.8≤AUC＜0.9為有好的判別力，ACU≥0.9為有非常好的判別力。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（）表示，2組樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn) α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 2組唾液中miR-193a的表達(dá)水平

qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果示，慢性牙周炎組唾液中miR-193a的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組（表1）；提示唾液中miR-193a的表達(dá)水平可能與慢性牙周炎相關(guān)。

表1 2組唾液中miR-193a的表達(dá)水平比較 （）Tab 1 Comparison of the levels of miR-193a in saliva between the 2 groups （）

表1 2組唾液中miR-193a的表達(dá)水平比較 （）Tab 1 Comparison of the levels of miR-193a in saliva between the 2 groups （）

組 別 n miR-193a健 康 對(duì) 照 組50 1.41±0.34慢性牙周炎組 100 0.89±0.42 P值 ＜0.05

2.2 miR-193a與牙周炎癥程度的相關(guān)性

對(duì)健康對(duì)照組以及輕、中、重度慢性牙周炎組唾液中miR-193a表達(dá)水平的相對(duì)差異分析發(fā)現(xiàn)：miR-193a的表達(dá)水平隨著牙周炎癥程度的加重而呈降低趨勢(shì)，其在重度牙周炎組中的表達(dá)水平最低，與健康對(duì)照組、輕度牙周炎組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）（表2）；說明，唾液中miR-193a的表達(dá)水平與牙周破壞程度呈負(fù)相關(guān)。

表2 各組唾液中miR-193a的表達(dá)水平 （）Tab 2 Expression levels of miR-193a in saliva of the groups（）

表2 各組唾液中miR-193a的表達(dá)水平 （）Tab 2 Expression levels of miR-193a in saliva of the groups（）

注：不同上標(biāo)數(shù)字序號(hào)為P＜0.05

組 別 n miR-193a健 康 對(duì) 照 組 50 1.41±0.34①輕度牙周炎組 41 1.24±0.35②中度牙周炎組 37 0.81±0.11③重度牙周炎組 22 0.75±0.15③

2.3 miR-193a與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性

慢性牙周炎患者牙周臨床指標(biāo)測(cè)定結(jié)果：PD為（5.15±0.66）mm，AL為（4.36±0.57）mm，PLI為（1.09±0.11），GI為（1.16±0.15）。

將慢性牙周炎患者唾液中miR-193a的表達(dá)水平分別與PLI、GI、PD、AL進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：miR-193a的表達(dá)水平與各項(xiàng)牙周臨床指標(biāo)均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表3）；進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-193a與牙周破壞程度密切相關(guān)。

表3 唾液中miR-193a與牙周臨床指標(biāo)的相關(guān)性 （r／P）Tab 3 Correlation between miR-193a level in saliva and periodontal clinical indexes （r／P）

2.4 唾液中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的表達(dá)水平

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，慢性牙周炎組唾液中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的表達(dá)水平均顯著高于健康對(duì)照組（P＜0.05）（表4）。提示，TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14可促進(jìn)慢性牙周炎的發(fā)展。

2.5 miR-193a與TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的相關(guān)性

將慢性牙周炎組唾液中miR-193a的表達(dá)水平分別與TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14水平進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示：唾液中miR-193a的表達(dá)水平與上述炎癥因子的表達(dá)均呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05）（表5）；表明miR-193a在慢性牙周炎的發(fā)展過程中發(fā)揮抑制作用。

表4 2組唾液中各炎癥因子表達(dá)水平的比較 （）Tab 4 Comparison of the levels of TNF-α，ILl-6，IL-8 and IL-14 in saliva between the 2 groups （）

表4 2組唾液中各炎癥因子表達(dá)水平的比較 （）Tab 4 Comparison of the levels of TNF-α，ILl-6，IL-8 and IL-14 in saliva between the 2 groups （）

IL-6 IL-8 IL-14健康對(duì)照組組 別 TNF-α 4.12±1.98 3.06±1.01 25.41±14.81 18.26±6.17慢性牙周炎組 7.02±2.71 8.14±3.87 55.49±28.01 36.27±19.49 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

表5 唾液中miR-193a與TNF-α、IL-6、IL-8和IL-14的相關(guān)性Tab 5 Correlation between mir-193a and TNF-α，IL-6，IL-8 and IL-14 in saliva

2.6 ROC曲線分析

用ROC曲線分析進(jìn)一步評(píng)估m(xù)iR-193a作為診斷慢性牙周炎的生物標(biāo)志物潛力，結(jié)果顯示：唾液中miR-193a的表達(dá)水平可有效區(qū)分慢性牙周炎組和健康對(duì)照組（AUC＝0.785，95%CI：0.706～0.860）；當(dāng)臨界閾值為1.355時(shí)，其約登指數(shù)最高，診斷慢性牙周炎的靈敏度為70.0%、特異度為83.0%；說明miR-193a有較好的慢性牙周炎檢測(cè)效能（圖1）。

圖1 ROC曲線分析miR-193a診斷慢性牙周炎效能Fig 1 ROC analysis of mir-193a in the diagnosis of chronic periodontitis

3 討 論

有研究顯示，唾液中含有炎癥因子、病毒樣顆粒、RNA等，血清中也能檢測(cè)到相似的物質(zhì)，在疾病發(fā)生時(shí)這些物質(zhì)含量會(huì)隨之發(fā)生變化，能提示自身免疫性疾病、感染性疾病及內(nèi)分泌疾病等多種疾病狀態(tài)［9-10］。Mbulaiteye等［11］研究發(fā)現(xiàn)，唾液可替代血液判斷機(jī)體EB病毒的感染情況。當(dāng)口腔局部發(fā)生炎癥時(shí)，齦溝液的分泌量升高，溢出齦溝并混入唾液中；因此，齦溝液中所含物質(zhì)也能在唾液中檢出，唾液可能成為慢性牙周炎診斷、治療及預(yù)后療效評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)。目前，唾液miRNA已逐漸成為一種新的檢測(cè)指標(biāo)，Park等［12］發(fā)現(xiàn)，miR-125a和miR-200a在口腔鱗狀細(xì)胞癌患者唾液中的表達(dá)水平明顯降低，提示其具有成為口腔癌標(biāo)志物的潛力。

miRNA參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡及組織器官的發(fā)育等生理過程，并在多種疾病中呈異常表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控了疾病的進(jìn)展。研究發(fā)現(xiàn)，眾多miRNA均與炎癥反應(yīng)或自身免疫相關(guān)，而慢性牙周炎是由微生物所引起的牙周組織慢性炎癥性疾病，miRNA在慢性牙周炎的病理過程中扮演重要角色［13］。Lee等［14］發(fā)現(xiàn)，miR-23a等6種miRNA在牙周炎的牙周組織中呈高表達(dá)。有報(bào)道顯示，miR-23a、miR-30a與成骨分化密切相關(guān)［15］。Ogata等［16］發(fā)現(xiàn)，相比健康牙齦組織，牙周炎患者的炎性牙齦組織中miR-150、miR-233和miR-200b的表達(dá)水平均明顯升高，而miR-379、miR-199a-5p和miR-214的表達(dá)水平明顯降低。目前有關(guān)唾液中miR-193a與慢性牙周炎的關(guān)系尚鮮有報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，慢性牙周炎患者唾液中miR-193a的表達(dá)水平顯著低于健康對(duì)照組（P＜0.05），并隨著牙周炎癥程度的加重呈降低趨勢(shì)，且在重度牙周炎組患者中的表達(dá)水平最低。表明唾液中miR-193a的表達(dá)水平可能與慢性牙周炎的發(fā)生及炎癥程度具有相關(guān)性。miR-193a的表達(dá)水平與牙周臨床指標(biāo)相關(guān)性分析的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：患者唾液中miR-193a的表達(dá)水平與牙周臨床指標(biāo)PLI、GI、PD、AL均呈負(fù)相關(guān)；進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-193a與牙周炎癥程度密切相關(guān)。

促炎癥因子和抗炎癥因子失衡在慢性牙周炎的病變過程中發(fā)揮重要作用，其中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14等炎癥因子與炎癥、免疫反應(yīng)進(jìn)程、牙周組織的破壞密切相關(guān)［17］。TNF-α可促進(jìn)破骨細(xì)胞的形成，增強(qiáng)骨吸收活性，抑制牙周膜纖維細(xì)胞向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化及成骨細(xì)胞活性，導(dǎo)致牙周結(jié)締組織和牙槽骨組織的破壞，進(jìn)而限制了牙周組織修復(fù)［18］；同時(shí)，TNF-α還可促進(jìn)IL-14、IL-6、LI-8、GM-CSF等炎癥因子的分泌，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)。IL-6可促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放以加劇炎癥反應(yīng)，抑制牙周膜細(xì)胞生長(zhǎng)并阻礙牙周膜修復(fù)；其還可通過促使破骨前體細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成熟的破骨細(xì)胞，促進(jìn)牙槽骨吸收，進(jìn)而誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）的產(chǎn)生，最終導(dǎo)致骨基質(zhì)的降解［19］。IL-8主要通過趨化、聚集并激活中性粒細(xì)胞，使其發(fā)生脫顆粒作用而釋放溶酶體酶，導(dǎo)致牙周局部組織炎癥性損害［20］。IL-14可促進(jìn)活化的B細(xì)胞增殖及免疫球蛋白的分泌，與免疫系統(tǒng)疾病密切相關(guān)，其在慢性牙周炎患者牙周組織及外周血中的表達(dá)水平均升高［21］。Beklen等［22］發(fā)現(xiàn)，在牙周炎患者牙齦成纖維細(xì)胞中TNF-α、IL-1β的表達(dá)水平均升高，并誘導(dǎo)MMPs的生成。Takahashi等［23］發(fā)現(xiàn)，IL-6在牙周炎患者牙齦組織中呈高表達(dá)。Ganlonal等［24］研究發(fā)現(xiàn)，在牙周炎患者牙齦組織中IL-8的表達(dá)水平明顯上調(diào)，而在牙周基礎(chǔ)治療后其表達(dá)明顯降低。

本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14的表達(dá)水平在慢性牙周炎組唾液中的表達(dá)水平與健康對(duì)照組比較均明顯升高，與Noh等［25］的研究結(jié)果相似。提示，TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14可促進(jìn)牙周炎癥的發(fā)展。為進(jìn)一步闡明唾液中miR-193a的表達(dá)水平與慢性牙周炎的相關(guān)性，本研究將miR-193a分別與TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：唾液中miR-193a的表達(dá)水平與上述炎癥因子均呈負(fù)相關(guān)；表明miR-193a對(duì)牙周炎癥具有抑制作用。通過ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，miR-193a在唾液中的表達(dá)水平可有效區(qū)分慢性牙周炎患者和牙周健康人群，并且具有較好的檢測(cè)效能，具有作為診斷慢性牙周炎的生物標(biāo)志物潛力。

綜上所述，miR-193a對(duì)牙周炎癥的發(fā)生、發(fā)展具有抑制作用；慢性牙周炎患者唾液中miR-193a的表達(dá)水平與TNF-α、IL-6、IL-8、IL-14炎癥因子的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，并且隨著牙周炎癥程度的加重而顯著降低；miR-193a的表達(dá)水平還具有較好的慢性牙周炎檢測(cè)效能。因此，唾液中miR-193a的表達(dá)水平可能成為潛在的診斷慢性牙周炎的生物標(biāo)志物，并可提供新的慢性牙周炎治療研究方向。