程鳳峽 孫喜龍 楊玉鵬 許彥枝

牙周炎與口腔扁平苔蘚同為口腔內(nèi)的高發(fā)疾病，具有相互作用、相互影響以及伴隨發(fā)生的特征［1-2］。相關(guān)炎癥細(xì)胞因子在牙周炎伴口腔扁平苔蘚中發(fā)揮重要作用［3-6］，IL-17與組織的炎性損傷及自身免疫性疾病的發(fā)生有密切關(guān)系［7-8］。NF-kB可調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)中大量基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，NF-kB與MMPs關(guān)系密切，在MMPs基因啟動(dòng)子近端調(diào)控區(qū)有特異性NF-kB結(jié)合位點(diǎn)，可通過激活NF-kB信號通路促進(jìn)MMPs升高。牙齦發(fā)生炎癥時(shí)，齦溝液及唾液中MMPs的活性增加且其酶活性及產(chǎn)物與牙齦炎癥嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。因此，MMP通路是牙周組織破壞的關(guān)鍵通路之一。本研究探討IL-17通過激活NF-kB信號通路促進(jìn)人牙周膜成纖維細(xì)胞（hPDLFs）中MMPs的分泌從而影響牙周炎伴口腔扁平苔蘚的病理發(fā)生及進(jìn)程。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取自2016-02～2018-05就診的43例（男性14例，女性29例）牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者為研究組，年齡范圍21～67歲，平均年齡（44.1±21.3）歲。選取本院同期體檢的健康志愿者43例為對照組，包括男性18例，女性25例，年齡范圍22～65歲，中位年齡（46.2±18.6）歲，2組患者基線資料比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①口腔扁平苔蘚患者均需符合《口腔黏膜病學(xué)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②牙周炎患者均需符合國際牙周病新分類慢性牙周炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；③入組患者均為口腔扁平苔蘚和牙周炎兩種疾病伴隨發(fā)生者；④無全身系統(tǒng)性疾病及慢性疾??；⑤近3個(gè)月內(nèi)未接受過相關(guān)藥物治療者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不能確診為口腔扁平苔蘚或牙周炎的患者②單一疾病患者；③哺乳或妊娠期女性；④接受過抗生素等藥物治療者；⑤患有慢性疾病或全身系統(tǒng)性疾病者。

1.2 外周血標(biāo)本采集

根據(jù)入選標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn)篩選合格的入組患者，并抽取納入研究的患者及健康志愿者清晨空腹時(shí)的外周靜脈血，采用一次性血清分離膠管，抽取外周靜脈血約3 ml；靜置10 min，待血清析出后，使用臺式離心機(jī)以1 000 r／min離心10 min，抽取上層血清，分裝后，保存至-80℃冰箱，備用。

1.3 唾液標(biāo)本采集

于清晨采用棉簽法采集受試者的唾液標(biāo)本，在唾液采集前2 h受試者需空腹，不能喝水、喝酒、喝飲料、進(jìn)食、抽煙、劇烈運(yùn)動(dòng)及情緒劇烈波動(dòng)等。采樣時(shí)受試者采取坐位、頭稍前傾體位，采用棉簽蘸檸檬酸刺激口腔唾液分泌，1.5 min后吐出唾液，用10 ml無RNA酶離心管收集唾液標(biāo)本，立即于4℃，3 000 r／min，15 min離心取上層液體，將收集好的唾液上清凍存于-80℃冰箱，待檢測。

1.4 常規(guī)牙周檢查

詳細(xì)記錄所有研究對象牙周臨床指標(biāo)：牙周探診深度（PD）、附著喪失（AL）、菌斑指數(shù)（PLI）、牙齦指數(shù)（GI）。根據(jù)探診深度、牙齦指數(shù)、附著喪失、X線片顯示牙槽骨吸收程度來衡量牙周炎的程度。

1.5 hPDLFs細(xì)胞培養(yǎng)

取因正畸完整拔除的雙尖牙，常規(guī)組織塊法原代培養(yǎng)hPDLFs，并傳代。待第3代細(xì)胞貼壁后，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含去酚紅的DMEM、10%熱非動(dòng)化胎牛血清、10-8mol地塞米松、10 mmolβ-甘油磷酸鈉、50μg／ml抗壞血酸）。傳代至第4代時(shí)，以1.5×104／cm2的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)90%后，更換不含血清的礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12 h后，收集細(xì)胞，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)使用。

1.6 ELISA檢測

采用美國eBioscience公司的Human IL-17 Quantikine ELISA Kit，Human MMP-1 Quantikine ELISA Kit，MMP-2 Quantikine ELISA Kit，MMP-3 Quantikine ELISA Kit，MMP-9 Quantikine ELISA Kit分別檢測標(biāo)本中IL-17的含量，hPDLFs中MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9的含量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格遵從試劑盒說明書。

1.7 Western Blot檢測

首先從轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞中提取總蛋白，采用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后在SDS-聚丙烯酰胺凝膠小孔內(nèi)添加50μg經(jīng)過變性處理后的蛋白質(zhì)，再進(jìn)行濃縮膠層80 V恒壓一段時(shí)間，當(dāng)樣品在分離膠層壓成一條線時(shí)電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳，電泳后于冰上0.25 mA轉(zhuǎn)膜2 h，麗春紅染色10 min觀察轉(zhuǎn)移效果，滿意后，TBST緩沖液洗膜后在5%脫脂奶粉與搖床上孵育2 h；加入一抗（1∶500兔抗人p21多抗，1∶5 000兔抗人GAPDH單抗）置于4℃封閉過夜；洗膜后加入羊抗兔IgG／HRP二抗（1∶2 000），室溫孵育1 h，采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影得到蛋白印記條帶，用Tanon軟件分析條帶灰度值，相對定量結(jié)果以實(shí)驗(yàn)條帶灰度值／β-actin條帶光密度值表示，內(nèi)參照為β-actin。

1.8 qRT-PCR檢測

應(yīng)用美國ABI StepOne Plus實(shí)時(shí)定量PCR儀，嚴(yán)格按照日本TaKaRa公司SYBR Premix Ex TaqPCR反應(yīng)試劑盒的操作說明進(jìn)行MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-9，TIMP-1和TIMP-2的RT-PCR檢測。

1.9 CCK8檢測

采用IL-17（10 ng／ml）刺激hPDLFs，設(shè)為IL-17處理組；將未經(jīng)任何處理的hPDLFs設(shè)為NC對照組。參照CCK8試劑盒（Invitrogen公司，美國）說明書步驟進(jìn)行，各組轉(zhuǎn)染24 h后，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔加10μl CCK8，37℃培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀上480 nm波長處測定A值，表示細(xì)胞增殖能力。

1.10 觀察指標(biāo)

①對照組、研究組患者血清及齦溝液中IL-17蛋白表達(dá)水平；②檢測并記錄研究組患者牙周指標(biāo)：牙周探診深度（PD）、附著喪失（AL）、菌斑指數(shù)（PLI）、牙齦指數(shù)（GI）。將研究組患者齦溝液中IL-17表達(dá)水平與各牙周指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析；③比較IL-17處理組、NC對照組hPDLFs的CKK8檢測結(jié)果，即480 nm波長處的A值；④qRT-PCR法檢測并比較IL-17處理組、NC對照組hPDLFs中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP-1、TIMP-2的mRNA表達(dá)水平；⑤采用ELISA法檢測并比較IL-17處理組、NC對照組hPDLFs中MMP1、MMP2、MMP3、MMP9的表達(dá)水平；⑥預(yù)先使用NF-kB的抑制劑PDTC去預(yù)處理hPDLFs，然后采用IL-17（10 ng／ml）分別刺激hPDLFs和PDTC預(yù)處理的hPDLFs（IL-17+PDTC處理組），12 h后通過Western blot及ELISA檢測并比較NC對照組、IL-17處理組、IL-17+PDTC處理組的P65蛋白磷酸化、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9的表達(dá)水平。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 血清中IL-17蛋白表達(dá)水平

ELISA檢測結(jié)果示研究組患者血清中IL-17蛋白表達(dá)水平為（22.56±2.33）ng／ml，明顯高于對照組血清中IL-17蛋白表達(dá)水平（5.50±0.66）ng／ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t＝46.195，P＝0.000）。

2.2 齦溝液中IL-17的表達(dá)水平與臨床牙周指標(biāo)的相關(guān)性

統(tǒng)計(jì)結(jié)果示研究組PD、AL、PLI、GI均明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)性分析結(jié)果顯示，研究組齦溝液中IL-17的表達(dá)水平與各牙周臨床指標(biāo)均呈顯著正相關(guān)（表2）。

表1 2組牙周臨床指標(biāo)比較 （）Tab 1 Comparison of periodontal clinical indicators between the 2 groups （）

表1 2組牙周臨床指標(biāo)比較 （）Tab 1 Comparison of periodontal clinical indicators between the 2 groups （）

PLI GI研究組組別 n PD（mm） AL（mm）43 4.21±0.63 2.29±0.45 2.65±0.37 2.36±0.42對照組 43 3.78±0.29 2.09±0.30 2.34±0.19 2.21±0.21 t值 — 4.066 2.425 4.887 2.095 P值 — ＜0.001 0.018 ＜0.001 0.039

表2 齦溝液中IL-17的表達(dá)水平與臨床牙周指標(biāo)的相關(guān)性Tab 2 Correlation between the level of IL-17 in gingival sulcus fluid and clinical indicators

2.3 IL-17與hPDLFs增殖能力的相關(guān)性

細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，在480 nm波長處，IL-17處理組A值為（1.876±0.581），NC對照組為（1.693±0.554），組間比較，t＝1.495，P＝0.139。

2.4 IL-17與hPDLFs中MMPs的mRNA表達(dá)水平的相關(guān)性

IL-17處理組中MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的mRNA表達(dá)水平高于NC對照組（P＜0.01）（表3）。

表3 2組MMPs的mRNA表達(dá)水平比較 （）Tab 3 mRNA expression levels of MMPs in the 2 groups （）

表3 2組MMPs的mRNA表達(dá)水平比較 （）Tab 3 mRNA expression levels of MMPs in the 2 groups （）

MMP1 MMP2 MMP3 MMP9 NC對照組 1.000±0.164 1.000±0.122 1.000±0.151 1.000±分 組0.114 IL-17處理組 2.537±0.286 2.082±0.257 1.922±0.136 2.375±0.242 t值 30.571 24.940 29.751 33.706 P值0.000 0.000 0.000 0.000

2.5 hPDLFs中TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達(dá)水平

NC對照組與IL-17處理組的hPDLFs中，TIMP-1、TIMP-2 mRNA表達(dá)水平無顯著差異（表4）。

2.6 hPDLFs中MMPs蛋白表達(dá)水平

IL-17處理組的hPDLFs中，MMPs蛋白的表達(dá)水平均明顯高于NC對照組（P＜0.01）（表5）。

2.7 IL-17通過激活NF-kB調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)

ELISA及Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與NC對照組比較，IL-17處理組的NF-kB P65蛋白磷酸化的表達(dá)水平、MMP1、MMP2、MMP3和MMP9蛋白表達(dá)水平均顯著高于NC對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。IL-17+PDTC處理組的NF-kB P65蛋白磷酸化的表達(dá)水平、MMP1、MMP2、MMP3和MMP9蛋白的表達(dá)水平均顯著低于IL-17處理組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖1）。

表4 2組hPDLFs中TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達(dá)（）Tab 4 mRNA expression levels of TIMP-1 and TIMP-2 in hPDLFs of the 2 groups （）

表4 2組hPDLFs中TIMP-1、TIMP-2 mRNA的表達(dá)（）Tab 4 mRNA expression levels of TIMP-1 and TIMP-2 in hPDLFs of the 2 groups （）

分 組1.000±0.149 1.000±0.125 IL-17處理組 0.863±0.964 0.937±0.312 t值 0.921 1.229 P值TIMP-1 TIMP-2 NC對照組0.360 0.223

表5 2組MMPs蛋白表達(dá)水平比較 （pg／ml，）Tab 5 Proteins expression of MMPs in the 2 groups （pg／ml，）

表5 2組MMPs蛋白表達(dá)水平比較 （pg／ml，）Tab 5 Proteins expression of MMPs in the 2 groups （pg／ml，）

MMP1 MMP2 MMP3 MMP9 NC對照組 75.05±8.16 151.40±16.22 35.30±4.11 105.36±分 組10.14 IL-17處理組 166.37±17.28 256.78±30.57 131.44±15.16 215.37±23.24 t值 31.336 19.968 40.136 28.450 P值0.000 0.000 0.000 0.000

圖1 IL-17通過激活NF-kB調(diào)節(jié)MMPs的表達(dá)Fig 1 Il-17 regulates the expression of MMPs by activating NF-kB

3 討 論

TNF-α，IL-1β，IL-6，IL-8等炎癥細(xì)胞因子在牙周疾病的發(fā)展進(jìn)程中起著重要作用，與牙周炎及口腔扁平苔蘚的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。但I(xiàn)L-17與牙周炎伴口腔扁平苔蘚的關(guān)系目前尚不明確。IL-17是一種復(fù)雜的多功能細(xì)胞因子，能夠促進(jìn)T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，增強(qiáng)Fas-FasL系統(tǒng)介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用，調(diào)節(jié)促進(jìn)Th1細(xì)胞發(fā)育分化，促進(jìn)Th1細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子。有報(bào)道示IL-17能促進(jìn)炎癥因子和趨化因子的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)展成各種炎癥性疾病。IL-17與相應(yīng)IL-17R結(jié)合后，通過p38MAPK和JNK信號通路可誘導(dǎo)AP-1，NF-KB等轉(zhuǎn)錄基因表達(dá)，多種轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)增強(qiáng)，促進(jìn)下游IL-6，IL-8等炎癥細(xì)胞因子表達(dá)加強(qiáng)。許多免疫細(xì)胞包括單核細(xì)胞，巨噬細(xì)胞等都受IL-17的調(diào)控，因此，IL-17在炎癥反應(yīng)鏈中扮演著重要的角色。本研究中，與健康志愿者相比，牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者血清中IL-17蛋白表達(dá)水平升高，提示IL-17可能與牙周炎伴口腔扁平苔蘚存在相關(guān)性。牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者唾液中IL-17的表達(dá)量與菌牙周探診深度、附著喪失、菌斑指數(shù)、牙齦指數(shù)這些臨床指標(biāo)呈正相關(guān)，表示IL-17可能促進(jìn)牙周破壞程度。

hPDLFs是牙周組織中的主要細(xì)胞成分，具有趨化，增生，黏附，分化為成牙骨質(zhì)細(xì)胞，成骨細(xì)胞，形成礦化組織等功能。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17與hPDLFs的增殖能力無明顯相關(guān)性，說明IL-17并不是通過影響hPDLFs的增殖而參與到牙周炎伴口腔扁平苔蘚的發(fā)展過程。

MMPs在牙周組織破損過程中起著關(guān)鍵作用，其中MMP-1是膠原酶，可降解Ⅰ～Ⅲ型膠原及其他ECM，在病變的牙周組織中高表達(dá)；MMP-2是明膠酶，可降解明膠及Ⅰ～Ⅲ型膠原，在牙周組織破壞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，調(diào)控牙周組織炎癥過程；而另一種明膠酶MMP-9可降解明膠、Ⅳ型、Ⅴ型、Ⅶ型及Ⅹ型膠原，MMP-9的表達(dá)與牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者牙周組織破壞程度密切相關(guān)［9-11］。MMP-3是基質(zhì)溶解素，可激活其他MMPs，促進(jìn)炎癥進(jìn)程。相關(guān)研究表明，在牙周炎患者患病部位的齦溝液中，MMP-3和MMP-1含量明顯增加，并與患者臨床癥狀密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，MMPs功能活性可以被TIMPs調(diào)節(jié)，在炎性牙周組織中，MMPs含量高于TIMPs，炎癥程度越重，活性MMPs濃度越高［12］。與健康人群相比，牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者齦溝液及牙齦組織中MMP-1，MMP-2，MMP-3和MMP-9顯著升高，而TIMP-1和TIMP-2顯著降低［13-14］。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17可以促進(jìn)hPDLFs中MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的mRNA表達(dá)，但值得注意的是，IL-17不會(huì)對TIMP-1和TIMP-2的mRNA表達(dá)產(chǎn)生明顯影響。IL-17可促進(jìn)hPDLFs中MMP1，MMP2，MMP3和MMP9蛋白的分泌。表明IL-17可能通過上調(diào)MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的表達(dá)從而促進(jìn)牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者的病理發(fā)展。

NF-kB可調(diào)控IL-2，IL-6，IL-8，TNF-α，MMPs，GCSF等一系列細(xì)胞因子，是許多免疫炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的樞紐，通過影響NF-KB的活性有可能直接調(diào)控機(jī)體的免疫狀態(tài)。NF-kB和MMP-1有緊密的聯(lián)系，MMP-1的基因啟動(dòng)子區(qū)域包含NF-kB的結(jié)合位點(diǎn)，NF-kB和位點(diǎn)結(jié)合后，啟動(dòng)MMP-1的基因轉(zhuǎn)錄，參與蛋白的表達(dá)。MMP-9有一個(gè)NF-kB的結(jié)合位點(diǎn)，阻斷NF-kB信號通路可以下調(diào)MMP-9的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-17刺激后，NF-kB P65蛋白磷酸化的表達(dá)水平明顯降低，MMP1，MMP2，MMP3和MMP9蛋白的表達(dá)水平受到抑制。表明IL-17可激活NF-kB信號通路，誘導(dǎo)MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的表達(dá)量升高。

綜上所述，IL-17在牙周炎伴口腔扁平苔蘚患者的病理進(jìn)程中扮演了重要角色，本研究數(shù)據(jù)表明，IL-17可通過激活NF-kB信號通路，使活化的NF-kB促進(jìn)hPDLFs中的MMP1，MMP2，MMP3和MMP9的分泌，從而起到促進(jìn)牙周炎伴口腔扁平苔蘚的發(fā)展。因此，IL-17可能為牙周炎伴口腔扁平苔蘚的診斷及治療提供了新的研究方向與治療靶點(diǎn)。