劉 丹，李然紅，陳 鑫，王立鳳

(牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012)

狗棗獼猴桃[Actinidiakolomikta(Maxim.et Rupr.)Maxim.]，別名狗棗子，大型落葉藤本植物，主要分布于我國東北、四川、河北、云南等地。狗棗獼猴桃是最為耐寒的獼猴桃品種之一，作為抗寒育種資源，在生長發(fā)育過程中葉片顏色會發(fā)生動態(tài)變化，形成白、粉、淺紅和淺綠的斑狀彩葉，其果實(shí)柔軟多汁、酸甜可口、富含維生素C，是一種藥食觀賞兼用植物[1-3]。脅迫相關(guān)蛋白(Stress associated proteins，SAP)是鋅指蛋白中參與植物脅迫調(diào)控的一類蛋白，是植物體在非生物脅迫應(yīng)答中大量表達(dá)的一種重要蛋白，在植物免疫及脅迫應(yīng)答中起重要作用[4-5]。SAP是鋅指結(jié)構(gòu)蛋白中的一員，含有典型的CCCH型結(jié)構(gòu)。SAP首次在水稻中被發(fā)現(xiàn)，隨后在高粱、擬南芥、番茄、毛果楊、玉米等高等植物中被發(fā)現(xiàn)并研究。研究表明，水稻中的SAP基因受非生物脅迫誘導(dǎo)，超表達(dá)時(shí)能顯著提高轉(zhuǎn)基因植株對低溫、高溫及干旱的抗性[6]。AtSAP5在擬南芥中超表達(dá)能夠提高植株對高鹽和滲透脅迫的抗性[7]，同時(shí)AtSAP10表達(dá)量的增加對重金屬脅迫的抗性影響明顯[8]。對小麥SAP基因啟動子的分析發(fā)現(xiàn)，其具有組織特異性及多種誘導(dǎo)表達(dá)特性，在脅迫早期發(fā)揮作用[9]。此外，過表達(dá)SAP基因煙草植株對病原菌侵染的抵抗能力也有所提高[10]。以狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為參考，篩選到鋅指蛋白(AkSAP)的cDNA序列，利用生物信息學(xué)方法對其編碼蛋白的理化性質(zhì)、疏水性/親水性、蛋白結(jié)構(gòu)功能域、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)及同源性等方面進(jìn)行預(yù)測和分析，以期為狗棗獼猴桃AkSAP功能研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料來源

狗棗獼猴桃AkSAP基因cDNA序列從牡丹江師范學(xué)院植物遺傳育種實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得，中華獼猴桃變種(PSS30759.1Actinidiachinensisvar.chinensis)、茶樹(XP_028055510.1Camelliasinensis)、葡萄(XP_010646914.1Vitisvinifera)、麻瘋樹(XP_012079197.1Jatrophacurcas)、歐洲栓皮櫟(XP_023921012.1Quercussuber)、歐洲橄欖(XP_022858348.1Oleaeuropaeavar.sylvestris)、毛桃(XP_007204485.2Prunuspersica)、蓖麻(XP_002522314.2Ricinuscommunis)、橡膠樹(XP_021669412.1Heveabrasiliensis)、木薯(XP_021631338.1Manihotesculenta)、野李變種(PQQ18171.1Prunusyedoensisvar.nudiflora)、梅花(XP_016651631.1Prunusmume)、櫻桃(XP_021825074.1Prunusavium)、牽?；?XP_019195606.1Ipomoeanil)、菟絲子(RAL40770.1Cuscutaaustralis)、白梨(XP_009366811.1Pyrus×bretschneideri)、馬鈴薯(XP_006338214.1Solanumtuberosum)等17種植物氨基酸序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載。

1.2 方法

狗棗獼猴桃AkSAP的理化性質(zhì)用ProtParam(https://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam)進(jìn)行分析；采用NCBI-CDD預(yù)測保守結(jié)構(gòu)域及蛋白家族(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/)；采用Inter-ProtScan(http://www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search)及SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測功能位點(diǎn)；采用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)預(yù)測蛋白磷酸化位點(diǎn)；采用NetNGlyc 1.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)預(yù)測N-糖基化位點(diǎn)；采用NetOGlyc 4.0 server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)預(yù)測O-糖基化位點(diǎn)；采用 SOPMA及PredictProtein 數(shù)據(jù)庫(https://www.predictprotein.org/)預(yù)測二級結(jié)構(gòu)及蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)；采用SWISS-MODEL(http://swissmodel.Expasy.org/)在線軟件預(yù)測蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)。從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中獲得17條不同植物的SAP氨基酸序列信息，利用MEGA5.1軟件的Neighbor-joining法構(gòu)建蛋白質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AkSAP蛋白理化性質(zhì)預(yù)測

利用ProtParam軟件對AkSAP氨基酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果表明，AkSAP基因cDNA全長2 089 bp，編碼區(qū)(CDS)為cDNA上第283—1 731個(gè)堿基，共編碼477個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為53 919.46 u，理論等電點(diǎn)為9.36，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為57，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為74，分子式為C2 337H3 697N709O726S18，總原子數(shù)為7 487，不穩(wěn)定指數(shù)(Instability index,Ⅱ)為60.98，脂肪系數(shù)(Aliphatic index)為55.64，親水性(GRAVY)的平均水平為-1.035。該蛋白中含量最多的為絲氨酸，占9.4%，其次為賴氨酸和脯氨酸，分別占8.8%和7.5%，含量最少的為色氨酸，為0.6%，吡咯賴氨酸及硒半胱氨酸含量均為0(圖1)。通過ProtScale軟件分析預(yù)測，該蛋白的整個(gè)肽鏈中均含有親水性和疏水性氨基酸，得分最大值為2.167，在205個(gè)氨基酸處，最小值為-3.200，在第59—62個(gè)氨基酸處，從整體分布看(圖2)，氨基酸的負(fù)值多且分值大，親水性明顯。結(jié)合理化性質(zhì)分析得到該AkSAP為非穩(wěn)定親水蛋白。

Ala:丙氨酸;Arg:精氨酸;Asn:天冬酰胺;Asp:天冬氨酸;Cys:半胱氨酸;Gln:谷氨酰胺;Glu:谷氨酸;Gly:甘氨酸;His:組氨酸;Ile:異亮氨酸;Leu:亮氨酸;Lys:賴氨酸;Met:蛋氨酸;Phe:苯丙氨酸;Pro:脯氨酸;Ser:絲氨酸;Thr:蘇氨酸;Trp:色氨酸;Tyr:酪氨酸;Val:纈氨酸;Pyl:吡咯賴氨酸;Sec:硒半胱氨酸

圖2 SAP親水/疏水性分析

2.2 AkSAP信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)

信號肽常指多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移的特殊氨基酸序列，長度大約5～30個(gè)氨基酸，其主要任務(wù)為引導(dǎo)蛋白質(zhì)在細(xì)胞含膜的亞細(xì)胞間轉(zhuǎn)移，包含信號肽的C端、N端和疏水核心區(qū)。SignalP-4.0預(yù)測AkSAP蛋白不含信號肽(圖3)，同時(shí)不存在跨膜結(jié)構(gòu)，D值為0.103(<0.5)。

C值:原始剪切位點(diǎn)的分值;S值:信號肽的分值;Y值:綜合剪切位點(diǎn)的分值

2.3 AkSAP結(jié)構(gòu)域預(yù)測

通過NCBI-CDD氨基酸序列的比對，對AkSAP保守序列及蛋白家族進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明，AkSAP是SAP基因家族的成員(ID：10488483)(圖4)，其第86—116個(gè)氨基酸之間的序列區(qū)域?yàn)镾AP家族的保守結(jié)構(gòu)域。使用Inter-ProtScan及SMART對氨基酸序列進(jìn)一步分析得出AkSAP含有SAP保守結(jié)構(gòu)(圖5)。

圖4 蛋白保守序列分析

圖5 AkSAP蛋白結(jié)構(gòu)分析

2.4 AkSAP二級、三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)是指肽鏈由氫鍵構(gòu)成的有規(guī)則的卷曲折疊具有周期性的空間結(jié)構(gòu)，使用PredictProtein對AkSAP的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(圖6)，該蛋白26.21%可能會形成螺旋(Helix)，9.85%可能形成延伸鏈(Strand)，4.40%為轉(zhuǎn)角(Turn)，59.54%為無規(guī)卷曲(Random coil)，無二硫鍵的形成，沒有特殊的二級結(jié)構(gòu)。用SWISS-MODEL對AkSAP蛋白進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測，結(jié)果如圖7所示。

2.5 蛋白修飾位點(diǎn)的預(yù)測

AkSAP蛋白質(zhì)磷酸化是調(diào)節(jié)和控制蛋白質(zhì)活力和功能的最基本、最普遍，也是最重要的機(jī)制。通過NetPhos 3.1 Server對蛋白磷酸化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，該蛋白存在56個(gè)磷酸化位點(diǎn)(圖8)。蛋白質(zhì)的N-糖基化修飾是生物體調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能、活性、壽命和多樣性的一種普遍的翻譯后修飾。利用NetNGlyc 1.1 Server對N-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，該蛋白含有3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，分別在第136、396、423個(gè)氨基酸。O-糖基化是另一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，O-糖鏈能維持所連接蛋白質(zhì)部分的空間構(gòu)象，采用NetOGlyc 4.0 Server對O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測分?jǐn)?shù)均大于0.5的認(rèn)為是陽性，故推測該蛋白含有31個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。PredictProtein預(yù)測分析結(jié)果見表1。

圖6 AkSAP蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖7 AkSAP蛋白的三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖8 AkSAP蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測

表1 AkSAP蛋白修飾位點(diǎn)的預(yù)測

Tab.1 Prediction of AkSAP modification sites

項(xiàng)目ItemcAMP和cGMP依賴的蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)cAMP- and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation site蛋白激酶磷酸化位點(diǎn)Protein kinase C phosphorylation site酪蛋白磷酸激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)Casein kinaseⅡphosphorylation site十四烷?；稽c(diǎn)N-myristoylation site酰胺化位點(diǎn)Amidation site位置 Site162 RRGS74 SIR157 SDK161 TRR171 TGR219 TFR228 TKR252 TTK277 TGK329 SNK13 SISD27 SRSD31 SETD44 SSCD57 SDDD67 SDFD87 TLYE105 TKSE99 GLRVSG160 GTRRGS168 GTITGR407 GSAPSA210 KGRK277 TGKK

2.6 氨基酸序列同源性對比

在NCBI數(shù)據(jù)庫中分別下載中華獼猴桃變種、茶樹、葡萄、麻瘋樹、歐洲栓皮櫟、歐洲橄欖、毛桃、蓖麻、橡膠樹、木薯、野李變種、梅花、櫻桃、牽牛花、菟絲子、白梨、馬鈴薯等17種植物的SAP序列，與狗棗獼猴桃AkSAP氨基酸序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明，狗棗獼猴桃AkSAP與中華獼猴桃變種親緣關(guān)系較近(圖9)。

圖9 SAP系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果

3 結(jié)論與討論

鋅指蛋白直接或間接參與植物的生長發(fā)育、根系建成、逆境響應(yīng)及信號調(diào)節(jié)等生理生化過程。目前，已經(jīng)從多種植物中克隆到鋅指蛋白基因，如擬南芥、大豆、小麥、水稻、矮牽牛等。根據(jù)半胱氨酸和組氨酸殘基的數(shù)目和位置，鋅指蛋白被分為C2H2、C4、C6、C4HC3、C3HC4、C2HC、CCCH等多種類型，在植物中具有高度保守基因序列。研究發(fā)現(xiàn)，番茄中的13個(gè)SAP基因在冷、熱、鹽、干旱等非生物脅迫環(huán)境下均產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)[11]。此外，水稻中的OsiSAP1在煙草中超表達(dá)，其植株在發(fā)芽率、鮮質(zhì)量、葉綠素含量方面均優(yōu)于野生型，同時(shí)在非生物脅迫環(huán)境下抗逆性顯著[1]。本研究利用已測的狗棗獼猴桃轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出狗棗獼猴桃鋅指蛋白cDNA序列信息，并對其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。AkSAP的cDNA全長為2 089 bp，CDS為1 431 bp，編碼蛋白為非穩(wěn)定親水蛋白，由477個(gè)氨基酸構(gòu)成，屬于SAP蛋白家族成員(ID：10488483)，主要構(gòu)件為α-螺旋和不規(guī)則卷曲，包含鋅指結(jié)構(gòu)特有的SAP結(jié)構(gòu)域，蛋白中絲氨酸、賴氨酸和脯氨酸含量較高，沒有跨膜結(jié)構(gòu)。選取17條氨基酸序列與AkSAP蛋白進(jìn)行比對，經(jīng)MAGA 5.1分析，AkSAP蛋白與中華獼猴桃變種親緣關(guān)系較近。以上結(jié)果為進(jìn)一步研究狗棗獼猴桃AkSAP功能提供了一定的理論基礎(chǔ)。