劉紅芳，陳發(fā)波，李文博，方 平

(長江師范學(xué)院 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院，重慶 涪陵 408100)

蘿卜(RaphanussativusL.)屬于十字花科(Brassicaceae)蘿卜屬(Raphanus)蘿卜種，是我國第二大蔬菜類作物。除作為蔬菜食用外，有的蘿卜品種還是提取天然色素的理想原料，如胭脂蘿卜。胭脂蘿卜又名紅心蘿卜，主產(chǎn)于重慶市涪陵區(qū)及鄰近區(qū)縣，是涪陵的第二大特產(chǎn)[1]。從胭脂蘿卜中提取的蘿卜紅色素不僅可以作為食品添加劑，還具有抗氧化、抗痛風等藥用功效，其應(yīng)用前景廣闊。從分子水平解析胭脂蘿卜紅色素合成的機制，可以為通過基因工程手段提高胭脂蘿卜色素含量提供理論，對開發(fā)和利用胭脂蘿卜具有重要意義。我國學(xué)者先后對胭脂蘿卜的品種選育、相關(guān)性狀遺傳和蘿卜紅色素的提取等方面開展了研究。陶紅英等[1]對胭脂蘿卜根部性狀進行了研究，結(jié)果表明，胭脂蘿卜色素含量與其肉質(zhì)根皮厚度呈正相關(guān)。王麗霞等[2]研究了胭脂蘿卜肉質(zhì)根生長中的過氧化物同工酶含量的變化規(guī)律，結(jié)果表明，過氧化物同工酶有提高蘿卜產(chǎn)量的作用，且與蘿卜花青素的形成有著密切聯(lián)系。劉海軍等[3]提出了以乙酸溶液浸提輔以超聲波法來提取優(yōu)質(zhì)蘿卜紅色素的方法，進一步優(yōu)化了生產(chǎn)中蘿卜紅色素的提取方法?；ㄇ嗨?Anthocyanin)是植物次級代謝的重要產(chǎn)物，屬于天然色素中的一種，其存在形式為花色苷，在27科72屬的開花植物(被子植物)中廣泛存在[4]。花青素有許多功能，比如預(yù)防紫外線損傷、預(yù)防病原體和吸引昆蟲傳播花粉等[5]?；ㄇ嗨睾铣擅?Anthocyanid in synthase,ANS)最初是在玉米的A2突變體中克隆得到的，催化無色的原花色素氧化產(chǎn)生有色的花色素，大多數(shù)ANS基因由2個外顯子和1個內(nèi)含子組成，且剪切位點都一致[6]。SHI等[7]分析了不同顏色武當木蘭花瓣中ANS基因的表達量，表明紅色花瓣中其表達量是白色花瓣的26倍。趙志常等[8]通過對芒果ANS基因的克隆及其序列分析發(fā)現(xiàn)，芒果花色素苷合成代謝途徑中至關(guān)重要的基因包括ANS基因，其對芒果果皮紅色的形成具有重要作用。目前，對胭脂蘿卜的研究主要集中在新品種選育、相關(guān)性狀遺傳和蘿卜紅色素的提取等方面，而有關(guān)蘿卜顏色控制基因的研究相對較少，ANS基因是花青素生物合成途徑后期非常重要的基因。鑒于此，分析不同肉質(zhì)顏色蘿卜ANS基因表達量與色素含量的相關(guān)關(guān)系，可為通過基因工程選育高色素含量蘿卜品種提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料為16份不同肉質(zhì)顏色蘿卜品種，由長江師范學(xué)院提供，材料編號及相關(guān)表型性狀見表1。

1.2 蘿卜肉質(zhì)根色素含量的測定

按照陶紅英等[1]的方法測定蘿卜肉質(zhì)根的色素含量，將新鮮的蘿卜肉質(zhì)根對分成2份，1份用于含水量的測定，另外1份用于色素含量的測定。提取胭脂蘿卜肉質(zhì)根汁液，在 520 nm下測定吸收值，制作標準曲線。1 000 g蘿卜肉質(zhì)根的色素含量C(‰)=V×y。其中，汁液容積V(mL)=1 000×肉質(zhì)根含水量(%)，汁液質(zhì)量濃度y(g/mL)由標準曲線的回歸方程計算。

表1 16份不同肉質(zhì)顏色蘿卜性狀

1.3 蘿卜ANS基因表達量的測定

1.3.1 蘿卜肉質(zhì)根總RNA的提取 采用柱式植物總RNA抽提純化試劑盒SK8661提取蘿卜肉質(zhì)根總RNA，試劑盒由上海生工生物工程有限公司提供。

1.3.2 反轉(zhuǎn)錄cDNA 使用第1鏈cDNA合成試劑盒，反轉(zhuǎn)錄合成ANS基因第1鏈cDNA。在0.2 mL PCR管中加入總RNA 5 L、隨機引物p(dN)6(0.2 g/L)1 L和無RNA酶ddH2O 5 L，放入70 ℃溫度下水浴5 min后，轉(zhuǎn)入到 0 ℃下冰浴10 s。然后加入反應(yīng)緩沖液4.0 L、10 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸混合液2.0 L、20 U/L核糖核酸酶抑制劑1.0 L和10 U/L逆轉(zhuǎn)錄酶2.0 L。于37 ℃溫度下水浴5 min，再在42 ℃下水浴60 min，最后70 ℃水浴10 min終止反應(yīng)。

1.3.3 熒光定量PCR檢測 管家基因引物序：actin-F:5′-TATGAGCAAAGAGATCACAGCACT-3′；actin-R:5′-TGAGGGAAGCAAGAATGGAA-3′，目的基因引物序列：ANS-F:5′-TACATTGAAGCGACGAG-TGAGT-3′；ANS-R:5′-AGGGC-ATTTCGGGTAATA-GTT-3′，引物由上海生工生物有限公司合成。將已合成的cDNA樣品作8倍稀釋處理后作為模板上機檢測。反應(yīng)混合液見表2，在ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進行反應(yīng)，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性120 s，95 ℃變性10 s，60 ℃退火40 s，40個循環(huán)。

表2 熒光定量PCR反應(yīng)混合液

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用2-ΔΔCt法對蘿卜ANS基因含量進行相對定量分析，采用DPS軟件和Excel 2010軟件進行相關(guān)圖表的制作、方差分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同蘿卜品種色素含量分析

對16份不同肉質(zhì)顏色蘿卜色素含量進行方差分析(表3)，結(jié)果表明，16份蘿卜色素含量存在極顯著差異(F=114.294 0，P=0.000 1)。圖1顯示，14號蘿卜色素含量最高，為25.43‰，15號和16號蘿卜次之，色素含量分別為23.48‰和22.58‰，而2號、3號和4號蘿卜幾乎不含色素。

表3 16份蘿卜色素含量方差分析

注：**表示在0.01水平差異顯著,下同。

Note:** indicate significance at the 0.01 level,the same below.

不同字母表示在0.05水平差異顯著，下同

根據(jù)表1中肉質(zhì)根皮色及肉質(zhì)顏色，將16份不同肉質(zhì)顏色蘿卜分為5種類型，即白皮白心、紅皮白心、綠皮花心、紅皮花心和紅皮紅心。對5種類型蘿卜色素含量進行方差分析(表4)，結(jié)果表明，5種類型蘿卜色素含量存在極顯著差異(F=255.925 0，P=0.000 1)。圖2顯示，紅皮紅心蘿卜色素含量最高，為23.80‰，紅皮花心蘿卜次之，色素含量為7.00‰，白皮白心蘿卜色素含量最低，僅為0.10‰。紅皮紅心蘿卜色素含量顯著高于其他類型蘿卜。

表4 5種類型蘿卜色素含量方差分析

A：白皮白心；B：紅皮白心；C：綠皮花心；D: 紅皮花心；E：紅皮紅心,圖4同

2.2 不同蘿卜品種ANS基因表達量分析

對16份不同肉質(zhì)顏色蘿卜ANS基因表達量進行方差分析(表5)，結(jié)果表明，16份不同肉質(zhì)顏色蘿卜間ANS基因表達量存在極顯著差異(F=95.984 0，P=0.000 1)。圖3顯示，14號蘿卜ANS基因表達量最高，為9.173 0，其次為16號蘿卜(7.143 9)，2號、3號和4號蘿卜ANS基因表達量最低，分別為0.142 9、0.109 3和0.090 9。

對5種類型蘿卜ANS基因表達量進行方差分析(表6)，結(jié)果表明，5種類型蘿卜間的ANS基因表達量存在極顯著差異(F=137.995 0，P=0.001)。圖4顯示，紅皮紅心蘿卜的ANS基因表達量最高(6.439 0)，其次為紅皮花心蘿卜(1.303 0)、綠皮花心蘿卜(1.239 0)、紅皮白心蘿卜(0.709 0)和白皮白心蘿卜(0.126 8)，紅皮紅心蘿卜的ANS基因表達量顯著高于其他類型蘿卜。

表5 16份蘿卜ANS基因表達量方差分析

圖3 16份不同類型蘿卜ANS基因表達量

表6 5種類型蘿卜ANS基因表達量方差分析

Tab.6 Variance analysis ofANSgene expression level in five types of radish

變異來源Source of variationSSdfMSFP區(qū)組間Block2.532 321.266 11.664 00.248 7處理間Treatment419.974 54104.993 6137.995 0??0.000 1誤差Error6.086 880.760 9總變異Total428.593 614

圖4 5種類型肉質(zhì)根中ANS基因表達量

2.3 ANS基因表達量與蘿卜色素含量的相關(guān)性分析

利用DPS軟件對蘿卜ANS基因表達量與蘿卜色素含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，蘿卜ANS基因表達量與蘿卜色素含量相關(guān)系數(shù)為0.83，且達到極顯著水平，說明蘿卜ANS基因與蘿卜色素含量密切相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

天然色素與人工合成色素相比有許多突出優(yōu)點，比如安全性高、低毒副作用、毒理學(xué)評價不高等[7]?；ㄇ嗨厥侵匾奶烊簧?，其應(yīng)用廣泛。而ANS基因在花青素生物合成途徑的后期起著重要作用，它能夠依賴2-酮戊二酸離子和二價鐵離子將無色的花青素催化成顯色的花青素[8-11]，這使ANS基因與花青素生物合成關(guān)系方面的研究成為近年來科學(xué)研究的熱點。馮文亭[12]對紅早酥梨花色素苷合成相關(guān)基因進行克隆及功能研究，結(jié)果表明，ANS基因是花色素苷生物合成重要的結(jié)構(gòu)基因。王雪等[13]通過對蘋果梨果皮花色素苷合成相關(guān)基因PyANS的克隆與表達進行分析，認為PyANS基因?qū)麑嵒ㄉ剀辗e累有一定的促進作用。孫梓健[14]研究發(fā)現(xiàn)，不同葉色根用芥菜中ANS基因的表達量與花青素的積累有密切關(guān)系，ANS基因在紅葉芥葉片中的表達量要比綠葉芥葉片中的高。胭脂蘿卜是提取天然色素的理想材料，但對其色素合成的分子機制研究報道相對較少。本研究結(jié)果表明，16份不同類型蘿卜間肉質(zhì)根ANS基因的表達量和色素含量均存在極顯著差異，且紅皮紅心蘿卜的ANS基因表達量和色素含量均顯著高于其他類型蘿卜。相關(guān)性分析，不同類型蘿卜ANS基因表達量與色素含量呈極顯著正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)較大(0.83)，表明ANS基因可在蘿卜色素生物合成中扮演重要角色，在接下來的研究中可以重點克隆胭脂蘿卜ANS基因，并開展其分子作用機制研究，進而通過轉(zhuǎn)基因手段提高蘿卜色素的產(chǎn)量。