張瑩瑩

（山西師范大學(xué)臨汾學(xué)院，山西臨汾 041000）

茶作為一種有很悠久歷史的飲品，目前已經(jīng)研究出它可以降低血糖、減少血脂、清除抗氧化劑的自由基，增強(qiáng)免疫力和阻斷活性等。羅祖有等還采取了其他措施證明了藤茶多糖進(jìn)行抗氧化作用、減少自由基和提高免疫力，是研究和了解植物多糖藥理活性的基礎(chǔ)。許多研究表明，茶中的許多化學(xué)物質(zhì)會(huì)產(chǎn)生自由基，包括抗氧化劑、多酚氨基酸鏈和多糖等，可以通過(guò)不同的方式研究茶多糖的抗氧化和自由基顯像活性。而迄今為止，還沒(méi)有關(guān)于復(fù)合多糖對(duì)多糖活性的貢獻(xiàn)的研究。

1 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)儀器與材料

1.1 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)儀器

CARY50全波長(zhǎng)紫外掃描儀，自動(dòng)旋光儀WZZ-2S，Agilent 7890A-5975C氣相色譜質(zhì)譜儀，配備DB-5柱（30m×0.25mm，0.25mm）和質(zhì)譜檢測(cè)儀器，Agilent1200液相色譜儀，配備G1352ARID檢測(cè)器，TSK5000G5000PWXL凝膠色譜柱（300mm×7.8mm），LAB-ORATA4000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，電子秤AR224CN，TD5A-WS高速度監(jiān)控器，冷凍干燥機(jī)ZRQ30，WF2UV-2100紫外光譜儀。

1.2 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)材料與試劑

茶葉的毛尖樣品存儲(chǔ)在實(shí)驗(yàn)室樣品庫(kù)中（編號(hào)為20150822-1）。DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，一氧化氮（NE）測(cè)試試劑盒（硝酸還原酶法），1,1-二苯基-2-三硝基苯基肼，多糖分子量(分別為12000,25000,50000,80,000,270000,410000,670000Da，美國(guó)Aldrich公司）透析袋，葡萄糖，木糖，半乳糖，阿拉伯糖，甘露糖，氯化鈉，氯仿，正丁醇和全乙醇等試劑。

2 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法

2.1 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)毛尖茶葉多糖的提取

將1250g毛尖茶葉用乙醇回流萃取兩次。按照文獻(xiàn)中的多糖提取方法處理殘?jiān)?，通過(guò)Sevag方法除去殘留物，直到掃描的波長(zhǎng)280nm的地方?jīng)]有清晰的吸收峰為止。重復(fù)用乙醇和丙酮的水溶液進(jìn)行洗滌，以獲得從毛尖茶葉的精制多糖。

2.2 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)毛尖茶葉多糖的分離純化

將12.74g從毛尖茶葉中提取的多糖溶解在蒸餾水中，并通過(guò)DEAEDE-52離子交換色譜法進(jìn)行分離，并從蒸餾水和0.2、0.4、0.6升/lNaCl溶液洗脫，從每一批收集5.0L。將洗脫的部分濃縮，置于透析袋中進(jìn)行透析、分離并純化，然后以水為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫。用收集器收集洗脫的部分，每個(gè)收集管大約收集3ml，將通過(guò)高效液相色譜法檢測(cè)到的相似峰合并，得到對(duì)稱(chēng)的毛尖茶葉多糖組分，將其稱(chēng)為MTP。

2.3 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP的特性分析

2.3.1 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)旋光度測(cè)定

把10.0mgMTP放置在25ml的容量瓶中，以水溶解，配制0.4g/l的多糖溶液。將20ml溶液加入到旋光管中，作為空白對(duì)照組，通過(guò)自動(dòng)旋光儀測(cè)量MTP的光學(xué)強(qiáng)度。

2.3.2 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)分子量分布的測(cè)定

通過(guò)HPLC測(cè)定多糖的一般溶液和一系列MTP溶液。色譜柱為T(mén)SK G5000PWXL（300mm×7.8mm）凝膠色譜柱。柱溫為40°C，流動(dòng)相在0.002mol/l磷酸氫鈉（含0.05%NaN3）下的流速為0.8ml/min，RID檢測(cè)器檢測(cè)。加入適量的分子量為12000、25000、50000、80000、270000、410000和670000Da的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入去離子水，配制成2g/l的溶液，并進(jìn)行過(guò)濾。同時(shí)進(jìn)行HPLC分析，用保留時(shí)間（RT）作為橫坐標(biāo)x，用分子量的log10的值作為縱坐標(biāo)y，得到y(tǒng)=-0.332x+10.224（r=0.9980）。稱(chēng)量一定量的MTP并添加去離子水，再按照上述步驟制備質(zhì)量濃度為2g/l的樣品溶液，并根據(jù)上面的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算。

2.3.3 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)單糖組成的測(cè)定

根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法，對(duì)MTP進(jìn)行完全水解，以減少乙酰基衍生化，并且使用標(biāo)準(zhǔn)單糖作為參考來(lái)測(cè)量MTP的單糖組成。氣相條件為DB-5色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）。該檢測(cè)器輸入溫度為250°C，檢測(cè)器的溫度為280℃，氮?dú)饬魉贋?.6ML/min，分流比例為20：1，進(jìn)樣量為5μL，程序溫度在200℃，2分鐘，溫度升至約2℃至245℃，然后以10°C/分鐘的速度升高至270°C，持續(xù)2分鐘。

2.4 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖的影響

根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法，在96孔板中測(cè)量了MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增值能力的影響。第1組為對(duì)照組，第2-7組為藥物組。藥物治療組的多糖溶液的最終濃度為30,90,150,300,500,800mg/l，對(duì)照接受終濃度為10mg/L。施用藥物后，將細(xì)胞在5%CO2，37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，吸去培養(yǎng)液，并在每個(gè)孔中加入20μmLMTT，并在上述條件下培育4小時(shí)。棄去上清液，加入150μlDMSO混合并進(jìn)行振蕩。在酶標(biāo)儀570nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，對(duì)照組的吸光度為100%，并為每個(gè)監(jiān)測(cè)組計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)生長(zhǎng)速率。

2.5 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

根據(jù)文獻(xiàn)中描述的方法，將中性紅用作對(duì)象，并在96孔板中測(cè)量MTP對(duì)RAW264.7小鼠噬菌體吞噬作用的影響，分組管理等效于2.5。施用藥物后，在5%CO2,37°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)，加入濃度為720mg/L的100mg中性紅色溶液。再將細(xì)胞在5%CO2,37°C的培養(yǎng)箱中放置24小時(shí)。攪拌培養(yǎng)物，將50μl冰醋酸和50μl乙醇充分混合，并在4°C下在冰箱中保存2小時(shí)。將96孔板從冰箱中取出，并振蕩10分鐘以找到包括酶標(biāo)儀在495nm波長(zhǎng)的吸光度。對(duì)照組的吸光度為100%，并分別根據(jù)兩組的攝取率計(jì)算細(xì)胞增值的比率。

3 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP的旋光度及分子量

經(jīng)過(guò)計(jì)算得出，MTP旋光度為20D=+42.0°。MTP的HPLC色譜圖如圖1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出5.5×105Da的重均分子量。

3.2 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP的單糖組成

測(cè)量得出，MTP由阿拉伯糖精、木糖、葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為2.44：1：1：1.54：1.28。

3.3 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP的清除DPPH自由基活性

MTP對(duì)0.1 mmol/LDPPH自由基清除的濃度為38.26%（RSD=2.28%）。

3.4 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞增殖的影響

圖2顯示了在不同質(zhì)量濃度條件下吸收值的比值?？梢钥闯?，不同濃度的MTP溶液對(duì)細(xì)胞增殖有多種作用。在30-500mg/L范圍內(nèi)，給藥物組與對(duì)照組之間存在顯著差異。在500mg/L的高濃度下，擴(kuò)散效果逐漸增強(qiáng)并達(dá)到最大值。

圖1 MTP的高效液相色譜圖

圖2 MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響

3.5 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞吞噬能力的影響

圖3結(jié)果顯示了在不同質(zhì)量濃度條件下每個(gè)孔中的吸收值之比。在圖3中，可以看出不同濃度的MTP溶液對(duì)細(xì)胞的吞噬作用具有不同的作用。在30-500mg/L范圍內(nèi)施用多糖組和對(duì)照組之間存在顯著差異。吞噬細(xì)胞活性的發(fā)生率逐漸增加，并在500mg/L的濃度下達(dá)到峰值。

3.6 毛尖茶葉多糖的提取與活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響

圖4顯示了在不同質(zhì)量濃度條件下產(chǎn)生NO的量。圖4表明，不同濃度的MTP溶液對(duì)細(xì)胞中NO產(chǎn)生的影響不同。在300-800mg/L的范圍內(nèi)，NO產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞的影響顯著不同，在500mg/ml達(dá)到最大值。

4 討論與結(jié)論

圖3 MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬能力的影響

圖4 MTP對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO能力的影響

在本文中，主要研究了從毛尖茶中分離純化出單糖多糖成分MTP，以評(píng)估單糖的組成和分子量分布，其特征主要在于多糖結(jié)構(gòu)。此外，本文通過(guò)多種提供藥理活性的方法來(lái)論述MTP的藥理活性，這些方法為多糖和其他毛尖茶葉多糖的開(kāi)發(fā)和使用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。藥理實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，MTP具有消除DPPH自由基的特定能力。DPPH自由基可能是毛尖茶葉的有效活性來(lái)源之一，該結(jié)果與作者先前的研究結(jié)果一致，進(jìn)一步表明了多糖顆粒的自由基清除活性。體外藥理模型在Raw264.7細(xì)胞活性測(cè)試中研究了不同MTP質(zhì)量濃度對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞不同生理序列的影響，在30-500mg/l的藥物輸送范圍內(nèi)，隨著給藥濃度的增加促進(jìn)了小鼠吞噬細(xì)胞的增殖，增加了細(xì)胞吞噬作用和NO的產(chǎn)生，并證明了毛尖茶葉可以顯示多糖的免疫刺激作用，為進(jìn)一步研究多糖提供了實(shí)驗(yàn)環(huán)境。MTP對(duì)其他模型的影響對(duì)于進(jìn)一步的研究和分析是有價(jià)值的，從而可以使用更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更準(zhǔn)確，可以正確地分析毛尖茶葉多糖。此外，當(dāng)MTP的質(zhì)量濃度很高時(shí)，藥物活性實(shí)驗(yàn)的指標(biāo)反應(yīng)會(huì)減少，并且大劑量MTP對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞的作用會(huì)引起細(xì)胞代謝或細(xì)胞毒性。低劑量的MTP生產(chǎn)活性和高劑量的線性趨勢(shì)表明，MTP對(duì)RAW264.7細(xì)胞具有明確的靶點(diǎn)或通路，尚需要進(jìn)一步研究。本研究為毛尖茶葉的合理開(kāi)發(fā)和利用提供了理論依據(jù)。