宋琳， 蔣益蘭

1.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；2.湖南省中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410006

結(jié)腸癌的發(fā)生和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高，且缺乏有效治療手段，導(dǎo)致結(jié)腸癌患者極高的病死率[1]。據(jù)相關(guān)資料表明：結(jié)腸癌新發(fā)病例在全世界男性、女性中分別排名第3位及第2位，死亡率分別排名第4位及第3位[2]。找出結(jié)腸癌發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)控分子以及揭示侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制對(duì)結(jié)腸癌的防治具有重要的理論價(jià)值。研究表明腫瘤的發(fā)生發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移與腫瘤所處的微環(huán)境密切相關(guān)[3]，而缺氧是腫瘤最重要的微環(huán)境特點(diǎn)之一。實(shí)體腫瘤組織內(nèi)部普遍存在缺氧環(huán)境，缺氧是惡性腫瘤進(jìn)展的啟動(dòng)因子之一[4-5]。大量體外實(shí)驗(yàn)表明缺氧可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及腫瘤細(xì)胞上皮-間充質(zhì)化過(guò)程[6-7]。臨床研究也表明，缺氧與腫瘤生長(zhǎng)、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移有關(guān)[8]。

隨著循證醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)的發(fā)展，臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展迅速，中醫(yī)藥作為腫瘤綜合治療的手段之一，以其整體辨證論治、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，能改善腫瘤缺氧微環(huán)境，同時(shí)誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡，抑制誘導(dǎo)腫瘤基因表達(dá)，抑制癌癥細(xì)胞遷移，對(duì)結(jié)腸癌的治療有一定的療效[9]。因此，本課題組經(jīng)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，根據(jù)結(jié)腸癌“虛、毒、淤”的病機(jī)特點(diǎn)，以“健脾益氣，化瘀解毒”治則創(chuàng)制了經(jīng)驗(yàn)方健脾消癌方。核心方中以人參、薏苡仁健脾益氣，重樓、半枝蓮清熱解毒，莪術(shù)、郁金活血化瘀，全方配伍，扶正抗癌，標(biāo)本兼顧。既往臨床及實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)健脾消癌方的有效性[10-11]，并且前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)健脾消癌方能下調(diào)缺氧微環(huán)境中結(jié)腸癌細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)因子-1 水平(hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)，間接影響其下游靶基因的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡、減弱細(xì)胞的遷移和侵襲性并提高結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，發(fā)揮抗癌作用。

本實(shí)驗(yàn)?zāi)M缺氧微環(huán)境，觀察缺氧微環(huán)境下健脾消癌方對(duì)結(jié)腸癌裸鼠生長(zhǎng)情況、體重、瘤體體積、瘤重影響以及腫瘤組織病理切片細(xì)胞組織變化，證明健脾消癌方對(duì)結(jié)腸癌的抑瘤有效性。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞株

70 只SPF 級(jí)BALB/C-nu/nu 裸鼠，體質(zhì)量(20±2)g，雌雄各半，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SYXK(蘇)2016-0081。于江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 級(jí)層流室飼養(yǎng)，相對(duì)濕度40%～60%，12 h 明暗交替進(jìn)行，自由飲食飲水，定期更換墊料，適應(yīng)性飼養(yǎng)4周。結(jié)腸癌SW620細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞研究所，用RPMI1640完全培養(yǎng)基(內(nèi)含10%小牛血清、1%鏈青霉素)，在二氧化碳培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

小牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰酶消化液、RPMI1640 細(xì)胞培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，青霉素、鏈霉素購(gòu)自上海國(guó)藥集團(tuán)，電子分析天平(AB-204-N；梅特勒托利多有限公司)。

1.3 健脾消癌方

白花蛇舌草30 g，莪術(shù)10 g，法半夏10 g，黨參15 g，仙靈脾15 g，郁金15 g，黃芪20 g，薏苡仁30 g，半枝蓮30 g等。以上藥物均根據(jù)《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)由江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房采購(gòu)，實(shí)驗(yàn)中所用的同一味藥為同一產(chǎn)地同批藥材。將以上所有藥按5 倍量處方，加8倍量水浸泡30 min，煎煮1 hr，過(guò)濾；再加6 倍量水，煎煮1 hr，過(guò)濾，合并兩次濾液靜置24 hr，離心后將上清液壓縮至850 ml，4 ℃冷藏48 hr，離心冷藏液得到約800 ml 上清，滅菌后制成1 ml 含2.1 g 生藥的水煎劑備用。根據(jù)臨床推薦用量，70 kg 成人的健脾消癌方為320 g/d，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)設(shè)定成人0.0026倍劑量為裸鼠等效劑量，為41.6 g/kg。

1.4 方法及分組

1.4.1 結(jié)腸癌細(xì)胞接種裸鼠

將結(jié)腸癌SW620 細(xì)胞正常傳代培養(yǎng)，待細(xì)胞匯合率達(dá)80%時(shí)，用胰酶消化并收集細(xì)胞，制備成106/ml 的細(xì)胞懸液。在超凈工作臺(tái)上，將裸鼠用4%水合氯醛按0.1 ml/10 g 體重麻醉，用碘酒消毒皮膚后，用注射器吸取上述結(jié)腸癌細(xì)胞懸液100 μl 注射至20 只裸鼠右側(cè)腋部皮下，數(shù)天后可在腋下觸及小結(jié)節(jié)，之后皮下移植瘤逐漸增大，3周后腫塊大小約1 cm×0.8 cm×0.8 cm，處死裸鼠，無(wú)菌操作剝離瘤體后，用生理鹽水沖洗后用眼科剪將瘤體剪成1 mm3。將50 只裸鼠用4%水合氯醛麻醉后，用瘤體用18G套管針將上述1 mm3瘤體接種于裸鼠右側(cè)腋部皮下。2周后觀察裸鼠右側(cè)腋部皮下腫瘤開始長(zhǎng)出，視為造模成功。

1.4.2 分組與處理

取造模成功的50只裸鼠隨機(jī)分為缺氧組+健脾消癌方組和缺氧組+對(duì)照組，每組25只。裸鼠用改裝的四面密封的鼠籠飼喂裸鼠(有機(jī)玻璃板)，內(nèi)置墊料、食物、水以及鈉石灰布袋(吸收裸鼠呼出的CO2)，蓋上蓋板，板面有3 個(gè)直徑1 cm 的氣孔，分別用于進(jìn)氣、排氣和測(cè)氧含量，通入含10.5%O2，89.5% N2的混合氣體，氣流速度為1.5 L/min，排除濕氣和氨氣。通過(guò)測(cè)氧儀監(jiān)測(cè)籠內(nèi)氧含量，控制在10.5%左右(相當(dāng)于海拔5 000 m高度的空氣含氧量，恒溫(25 ± 1)℃，每日更換墊料、補(bǔ)充食物和水分。缺氧組+健脾消癌方組裸鼠采用缺氧環(huán)境飼喂，同時(shí)根據(jù)41.6 g/kg 體重劑量給予裸鼠健脾消癌方，灌胃體積為20 ml/kg，每天1 次；缺氧組+對(duì)照組裸鼠缺氧環(huán)境飼喂，給予同健脾消癌方組等體積的生理鹽水灌胃，每天1 次。連續(xù)飼喂4周。

1.4.3 取樣和檢測(cè)指標(biāo)、方法

干預(yù)期間，每天觀察裸鼠的一般情況，包括活動(dòng)情況、飲食、被毛等，每7天測(cè)量各只裸鼠的體重及瘤體體積。末次給藥24 h 后，處死裸鼠，取出移植瘤，用0.9%NaCl沖洗，稱量瘤重，將移植瘤組織切成小塊，分成兩份：一份迅速凍存于-80 ℃冰箱內(nèi)；另一份固定于4%多聚甲醛中。游標(biāo)卡尺定期測(cè)量裸鼠移植瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積(V)=π/6×長(zhǎng)徑×(短徑)2。計(jì)算腫瘤生長(zhǎng)抑制率。腫瘤生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量-藥物組平均瘤體質(zhì)量)/對(duì)照組平均瘤體質(zhì)量×100%。

1.4.4 用蘇木精-伊紅(HE)染色檢測(cè)腫瘤組織的形態(tài)學(xué)

取移植瘤組織于4%多聚甲醛溶液中固定，經(jīng)脫水、透明、透蠟處理后，進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片，厚度5 μm，HE染色后封片，于顯微鏡下觀察兩組結(jié)腸癌組織變化或病理?yè)p傷情況。

2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 缺氧條件下兩組裸鼠的一般情況

健脾消癌方組所有裸鼠在實(shí)驗(yàn)期間全部存活，第4周出現(xiàn)精神狀態(tài)變差、食欲下降，進(jìn)食進(jìn)水和運(yùn)動(dòng)有所減少，皮毛不潔黯淡，少部對(duì)外界刺激反應(yīng)性差；對(duì)照組5 只裸鼠在第21 天死亡，其余20 只實(shí)驗(yàn)期間全部存活，第3 周出現(xiàn)精神狀態(tài)、食欲均不同程度地下降，進(jìn)食進(jìn)水和運(yùn)動(dòng)有所減少，皮毛不潔黯淡，大部對(duì)外界刺激反應(yīng)性差。

3.2 缺氧條件下兩組裸鼠體重變化情況

在缺氧條件下，兩組裸鼠體重增長(zhǎng)緩慢，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)健脾消癌方組裸鼠平均體重為(32.5 ±0.6)g，對(duì)照組體重為(31.2 ± 0.7)g。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)兩組裸鼠體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P = 0.089，P＞0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 缺氧條件下兩組裸鼠體重的變化(±s，n=25)

3.3 缺氧條件下健脾消癌方對(duì)裸鼠瘤體體積的影響

兩組裸鼠的移植瘤體積均隨時(shí)間延長(zhǎng)呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，但與對(duì)照組相比，健脾消癌方組的移植瘤體積增長(zhǎng)明顯減緩，健脾消癌方干預(yù)21 d 后，健脾消癌方組移植瘤體積為(143.67±23.56)mm3，對(duì)照組(391.67±50.64)mm3，健脾消癌方組移植瘤體積小于對(duì)照組(P = 0.034，P＜0.05)；干預(yù)28 d后，健脾消癌方組移植瘤體積為(280.30 ± 37.89)mm3，對(duì)照組(561.4 ± 47.96)mm3，健脾消癌方組的移植瘤體積明顯小于對(duì)照組(P = 0.009，P＜0.01)，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

3.4 缺氧條件下健脾消癌方對(duì)裸鼠瘤體質(zhì)量及抑瘤率的影響

圖2 缺氧條件下兩組裸鼠瘤體體積的變化(±s，n=25)

健脾消癌方干預(yù)28 d 后，健脾消癌方組裸鼠平均瘤體質(zhì)量明顯低于對(duì)照組(P = 0.029，P＜0.05)，健脾消癌方組的抑瘤率為30.4%，見(jiàn)表1。

表1 兩組裸鼠皮下移植瘤瘤體質(zhì)量及抑制率比較(±s)

表1 兩組裸鼠皮下移植瘤瘤體質(zhì)量及抑制率比較(±s)

組別健脾消癌方組對(duì)照組瘤體質(zhì)量(g)0.342±0.06 0.863±0.09抑瘤率(%)30.4-

3.5 HE染色觀察健脾消癌方對(duì)裸鼠皮下移植瘤形態(tài)的影響

HE 染色光鏡下可見(jiàn)對(duì)照組排列不規(guī)則，細(xì)胞膜不規(guī)則，細(xì)胞核異常增大裸露，可見(jiàn)多核性，核深染，密度增加，細(xì)胞質(zhì)呈顆粒狀具有空泡，一般具有高核質(zhì)比(細(xì)胞核/細(xì)胞質(zhì))，形成結(jié)腸癌病理特征，如圖3A 所示；健脾消癌方組與對(duì)照組相比細(xì)胞排列略規(guī)則，核深染及密集程度進(jìn)一步減輕，如圖3B所示。

圖3 結(jié)腸癌組織病理改變的HE染色圖（×100）

4 討論

腫瘤微環(huán)境是指由腫瘤細(xì)胞及腫瘤周圍的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞、新生血管及內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成的，其中包括炎癥、低氧以及免疫抑制等方面。惡性腫瘤由于異常的血管形成、血管灌注減少以及腫瘤細(xì)胞無(wú)限制的生長(zhǎng)都可導(dǎo)致微環(huán)境中氧含量降低，即缺氧微環(huán)境。腫瘤細(xì)胞在缺氧環(huán)境下可通過(guò)一系列的分子改變調(diào)整細(xì)胞代謝并適應(yīng)缺氧環(huán)境并保持生長(zhǎng)。缺氧環(huán)境在促進(jìn)惡性腫瘤組織侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮著積極的作用[12-13]。因此，干預(yù)腫瘤缺氧微環(huán)境如改變細(xì)胞乏氧微環(huán)境和敲除乏氧通路關(guān)鍵基因——HIF-1α 等[14]，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)的治療方法已成為當(dāng)下研究熱點(diǎn)。

《外科正宗》云：“蘊(yùn)毒結(jié)于臟腑，火熱流注肛門，結(jié)而為腫，其患痛連小腹，肛門墜重……肛門內(nèi)蝕，串爛經(jīng)絡(luò)，污水流通大孔”。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腸癌的發(fā)生是基于臟腑功能失調(diào)，并且受外界邪氣的影響，導(dǎo)致氣血陰陽(yáng)失衡，濕、熱、痰、瘀等諸多病理因素作用下引發(fā)惡性循環(huán)，形成了有利于腫瘤發(fā)生發(fā)展的微環(huán)境。中醫(yī)藥能通過(guò)多靶點(diǎn)效應(yīng)調(diào)整機(jī)體的微環(huán)境，從而發(fā)揮遏制腫瘤生長(zhǎng)、減緩轉(zhuǎn)移等作用。

本研究模擬缺氧環(huán)境，通過(guò)建立結(jié)腸癌裸鼠皮下移植瘤模型，采用健脾消癌方進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)健脾消癌方可改善裸鼠體力狀況，延長(zhǎng)生存期，明顯抑制結(jié)腸癌裸鼠腫瘤的生長(zhǎng)，減輕結(jié)腸癌模型裸鼠的結(jié)腸病理?yè)p傷。總之，健脾消癌方對(duì)結(jié)腸癌缺氧微環(huán)境有積極影響，其充分發(fā)揮中醫(yī)藥的多靶點(diǎn)調(diào)節(jié)作用，能更好地指導(dǎo)結(jié)腸癌的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療。