李力，潘倩雯，郭偲，周萌萌，肖俊勇，劉宏

(1.中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院碩士研究生班，武漢 430065；3.華中科技大學(xué)無限極現(xiàn)代制劑技術(shù)聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，武漢 430075；4.國(guó)家納米藥物工程技術(shù)研究中心，武漢 430075)

肉豆蔻是肉豆蔻科常綠喬木肉豆蔻(Myristica fragrans Houtt.)的干燥種仁[1]。肉豆蔻種仁入藥，可治虛瀉冷痢、脘腹冷痛、嘔吐等，亦有降血糖、降血脂、保肝、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗抑郁以及抗癌等作用[2]，肉豆蔻在傳統(tǒng)的多種方劑中都有使用，例如復(fù)方二神丸[3]、四神丸[4]、肥兒丸[5]等。揮發(fā)油是肉豆蔻的主要生物活性成分[6]。目前關(guān)于研究報(bào)道中與肉豆蔻揮發(fā)油成分比較分析相關(guān)的主要有不同采收季節(jié)的肉豆蔻揮發(fā)油成分比較[7]、肉豆蔻葉和種仁揮發(fā)油氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)分析比較[8]和白豆蔻、紅豆蔻、草豆蔻和肉豆蔻揮發(fā)油成分的比較[9]等。筆者尚未見文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于多種提取方法所得肉豆蔻揮發(fā)油成分的比較分析。本研究是肉豆蔻揮發(fā)油譜效學(xué)系列研究中的一部分內(nèi)容。為了獲得在譜效學(xué)研究中足夠多的差異化組成的樣品，本研究采用了傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法、微波輔助水蒸氣蒸餾法、超臨界二氧化碳(CO2)流體萃取法和冷榨法提取肉豆蔻揮發(fā)油，并通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)分析肉豆蔻揮發(fā)油化學(xué)成分，比較不同方法提取肉豆蔻揮發(fā)油化學(xué)成分的差異，為后期肉豆蔻揮發(fā)油的譜效關(guān)系研究提供差異化樣品的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1儀器 揮發(fā)油提取器(武漢民權(quán)化玻實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；WBFY-201微波化學(xué)反應(yīng)器(上海恬恒儀器有限公司)；DF-101T集熱式恒溫磁力攪拌器(河南鞏義予華儀器有限公司)；HA221-40-11-C型超臨界萃取裝置(上海亞榮生化儀器廠)；S120F科美特榨油機(jī)(常州市沃科特機(jī)械有限公司)；7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)安捷倫科技有限公司)；HP-5MS氣相毛細(xì)管色譜柱(美國(guó)安捷倫科技有限公司)。

1.2藥品與試劑 肉豆蔻購(gòu)自河北省安國(guó)市健仁藥材有限公司，經(jīng)海南興隆熱帶藥用植物園朱平主任鑒定為肉豆蔻科肉豆蔻干燥種仁。無水硫酸鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.0%，分析純，批號(hào)：20160622)；氯化鈉(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量≥99.5%，分析純，批號(hào)：20161013)。

2 方法與結(jié)果

2.1傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法 稱取粉碎粒徑為0.250～0.425 mm肉豆蔻粉末50.00 g置于1000 mL圓底燒瓶，加入純化水600 mL，放入沸石，振搖混合，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管，浸泡1.5 h后開始加熱，并保持微沸，提取6.0 h。揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥，并用孔徑0.22 μm濾膜過濾，供試樣品待測(cè)。

2.2微波輔助水蒸氣蒸餾法 稱取粉碎粒徑為0.250～0.425 mm的肉豆蔻粉末50.00 g置于500 mL圓底燒瓶，加入300 mL純化水，放入沸石，振搖混合后置于微波化學(xué)反應(yīng)器內(nèi)，浸泡1.5 h，連接揮發(fā)油測(cè)定器與回流冷凝管。微波功率為390 W，微波時(shí)間為2.5 h。揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥，并用孔徑0.22 μm濾膜過濾，供試樣品待測(cè)。

2.3超臨界CO2流體萃取法 稱取粉碎粒徑為0.250～0.425 mm的肉豆蔻粉末300.00 g，采用超臨界CO2流體萃取裝置進(jìn)行萃取。萃取壓強(qiáng)為16 MPa，萃取溫度為50 ℃，萃取時(shí)間為3.0 h，CO2流量為10 mL·min-1；分離釜Ⅰ：壓強(qiáng)6 MPa，溫度25 ℃；分離釜Ⅱ：壓強(qiáng)5 MPa溫度20 ℃。揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥，并用0.22 μm濾膜過濾，供試樣品待測(cè)。

2.4冷榨法 稱取粉碎粒徑為0.250～0.425 mm的肉豆蔻500.00 g，未經(jīng)烘烤直接用科美特榨油機(jī)室溫壓榨制油，毛油經(jīng)離心過濾除去雜質(zhì)獲得壓榨油樣品。揮發(fā)油用無水硫酸鈉干燥，并用孔徑0.22 μm濾膜過濾，供試樣品待測(cè)。

2.5揮發(fā)油收率與提取時(shí)間 4種提取方法是在前期大量方法篩選的基礎(chǔ)上建立的，鑒于篇幅所限僅報(bào)道出最終獲得最優(yōu)的提取方法。結(jié)果顯示，超臨界CO2流體萃取具有最高的揮發(fā)油收率和相對(duì)較短的提取時(shí)間，微波輔助水蒸氣蒸餾提取法可顯著縮短提取的時(shí)間，揮發(fā)油收率略低于單純傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法，而傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法提取時(shí)間最長(zhǎng)，提取效率相對(duì)較低。冷榨法因?qū)儆跈C(jī)械壓榨法提取速度較快，但揮發(fā)油收率最低。所以綜合比較而言，提取效率超臨界CO2流體萃取>微波輔助水蒸氣蒸餾>傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾>冷榨法。見表1。

2.6GC-MS分析 頂空進(jìn)樣方法：稱取肉豆蔻揮發(fā)油0.5 g，置于10 mL專用頂空瓶中，采用CTC PAL 自動(dòng)進(jìn)樣器，80 ℃平衡15 min。氣相色譜條件：HP-5MS石英毛細(xì)管柱(50 m×0.25 mm，0.25 μm)，進(jìn)樣口溫度250 ℃，載氣：氦氣，載氣流速1 mL·min-1，進(jìn)樣量500 μL，分流比50：1。程序升溫：初始溫度40 ℃(保持2 min)，6 ℃·min-1升溫速率升至240 ℃(保持2 min)。質(zhì)譜條件：離子源EI源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，倍增管電壓：1.2 kV，接口溫度280 ℃，質(zhì)量范圍50～550 u。傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油標(biāo)為1號(hào)樣品(S1)，微波輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油標(biāo)為2號(hào)樣品(S2)，超臨界CO2流體萃取肉豆蔻揮發(fā)油標(biāo)為3號(hào)樣品(S3)，冷榨法獲得的肉豆蔻揮發(fā)油標(biāo)為4號(hào)樣品(S4)。按照上述條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，經(jīng)化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及用面積歸一化法從其總離子流圖中計(jì)算各組分的百分含量，所測(cè)的質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索(質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫NIST)，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004A版)分析得GC-MS總離子流疊圖(圖1)。成分分析結(jié)果顯示，傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油(1號(hào)樣品)分離出36個(gè)色譜峰(相對(duì)百分含量為99.94%)，烷烯烴類化合物有20種、醇類化合物有8種、酚類化合物有2種、酯類化合物有1種、醚類化合物有4種、未鑒定的化合物有1種，其中β-松油烯(39.27%)含量最高，其余含量較高的成分為(1R)-(+)-α-蒎烯(20.72%)、β-蒎烯(11.25%)和雙戊烯(7.52%)；微波輔助水蒸氣蒸餾提取肉豆蔻揮發(fā)油(2號(hào)樣品)分離出38個(gè)色譜峰(相對(duì)百分含量為99.96%)，烷烯烴類化合物有21種、醇類化合物有8種、酚類化合物有2種、酯類化合物有2種、醚類化合物有4種、未鑒定的化合物有1種，其中β-松油烯(47.76%)含量最高，其余含量較高的成分為(1R)-(+)-α-蒎烯(16.04%)、β-蒎烯(11.07%)和雙戊烯(8.51%)。超臨界CO2流體萃取肉豆蔻揮發(fā)油(3號(hào)樣品)分離出35個(gè)色譜峰(相對(duì)百分含量為99.65%)，烷烯烴類化合物有15種、醇類化合物有8種、酚類化合物有1種、酯類化合物有1種、醚類化合物有5種、未鑒定的化合物有5種，其中(-)4-萜烯醇(21.41%)含量最高，含量較高的成分為順式-β-松油醇(9.15%)，另外幾種未鑒定。冷榨法壓榨肉豆蔻揮發(fā)油(4號(hào)樣品)分離出19個(gè)色譜峰(相對(duì)百分含量為99.92%)，烷烯烴類化合物有13種、醇類化合物有3種、醚類化合物有3種，其中β-松油烯(42.08%)含量最高，其余含量較高的成分為(1R)-(+)-α-蒎烯(25.13%)、β-蒎烯(12.23%)和雙戊烯(5.66%)。見表2 。

表1 4種提取方法的提取時(shí)間和揮發(fā)油收率

Tab.1Extractiontimeandyieldofvolatileoiloffourextractionmethods

方法提取時(shí)間/h揮發(fā)油收率/[mL·(100 g)-1]傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾6.05.23微波輔助水蒸氣蒸餾2.54.53超臨界CO2流體萃取3.06.78冷榨0.51.00

圖1 肉豆蔻揮發(fā)油GC-MS總離子流色譜疊圖

Fig.1OverlayoftotalionchromatogramofGC-MSfornutmegvolatileoil

3 討論

本研究是肉豆蔻揮發(fā)油譜效學(xué)系列研究的基礎(chǔ)研究部分。該系列研究包括差異化肉豆蔻揮發(fā)油的提取、肉豆蔻揮發(fā)油的抗炎鎮(zhèn)痛作用藥效評(píng)價(jià)及機(jī)制研究、差異化肉豆蔻揮發(fā)油樣品抗炎鎮(zhèn)痛作用的譜效相關(guān)性分析等內(nèi)容。在本研究中，揮發(fā)油是肉豆蔻的主要生物活性成分，從文獻(xiàn)報(bào)道來看，肉豆蔻揮發(fā)油具有降血糖、降血脂、保肝、抗炎鎮(zhèn)痛、抑菌、抗抑郁以及抗癌等藥理作用[10]。但這些藥理作用后面的物質(zhì)基礎(chǔ)究竟是哪些藥效物質(zhì)群呢？即功效與成分之間是一種什么樣的對(duì)應(yīng)關(guān)系？這實(shí)際上也是中藥現(xiàn)代化一直力求揭示的規(guī)律。而現(xiàn)在逐漸被大家所接受的中藥譜效學(xué)研究則能較好地回答這個(gè)問題[11]，對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油進(jìn)行譜效學(xué)研究可篩選出藥效最明確的藥效物質(zhì)群，并可在后期制劑開發(fā)中建立確保產(chǎn)品質(zhì)量一致性的肉豆蔻揮發(fā)油的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了從盡可能多的肉豆蔻揮發(fā)油成分中篩選出對(duì)應(yīng)的活性成分，本研究采用了傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法、微波輔助水蒸氣蒸餾法、超臨界CO2流體萃取法和冷榨法4種肉豆蔻揮發(fā)油提取方法。通過GC-MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)分析肉豆蔻揮發(fā)油化學(xué)成分，比較不同方法提取肉豆蔻揮發(fā)油化學(xué)成分的差異，為篩選出具有差異性的肉豆蔻揮發(fā)油提供依據(jù)。

2015年版《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定肉豆蔻揮發(fā)油收率不得低于6.0%(mL·g-1)。本研究中傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法提取肉豆蔻揮發(fā)油的收率為5.23%，可能與此批次肉豆蔻藥材揮發(fā)油的實(shí)際含量達(dá)不到平均含量水平有關(guān)。因?yàn)槿舛罐]發(fā)油成分含量可因不同采收季節(jié)、不同的存放時(shí)間而不同。在本實(shí)驗(yàn)過程中由于采用的是同批次肉豆蔻藥材，所以在這樣的前提下可以比較出各方法的差異。另外，實(shí)驗(yàn)室水蒸氣蒸餾過程中冷卻效果不佳，揮發(fā)油來不及冷卻從而使得揮發(fā)油揮發(fā)損失過多。

通過對(duì)4種不同方法提取肉豆蔻揮發(fā)油的成分進(jìn)行對(duì)比分析可知，4種不同方法提取肉豆蔻揮發(fā)油中共有色譜峰有15個(gè)。4種方法提取肉豆蔻揮發(fā)油成分和含量均有不同程度的差異。傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法與微波輔助水蒸氣蒸餾法兩種方法所提取的肉豆蔻揮發(fā)油中組成成分種類基本一致，但在含量上存在一定差異。微波輔助提取法僅比傳統(tǒng)蒸餾法多含有微量的乙酸香葉酯(0.01%)和反式-α-佛手柑油烯(0.01%)；但微波輔助提取的肉豆蔻揮發(fā)油中最主要的成分β-松油烯(47.76%)顯著高于傳統(tǒng)蒸餾法(39.27%)。與傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法和微波輔助水蒸氣蒸餾法相比，冷榨法壓榨所得肉豆蔻揮發(fā)油成分種類顯著減少，含量稍有差異。傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法分離出36個(gè)色譜峰，微波輔助水蒸氣蒸餾法分離出38個(gè)色譜峰，而冷榨法僅分離出19個(gè)色譜峰。超臨界CO2流體萃取法主要成分種類和含量與另3種提取方法存在明顯差異，其主要成分為(-)4-萜烯醇(21.41%)和順式-β-松油醇(9.15%)，均為醇類且含量均比另3種方法高，而另3種提取方法主要成分均為烯烴類。

表2 4種不同方法提取肉豆蔻揮發(fā)油成分分析結(jié)果

傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法與微波輔助水蒸氣蒸餾法均是通過加熱回流來提取，其成分差異性可能與過程中加熱溫度不同相關(guān)，會(huì)造成低沸點(diǎn)成分不同程度的揮發(fā)損失和高沸點(diǎn)成分提取率的減少。冷榨法壓榨肉豆蔻揮發(fā)油所含成分較少可能與施加壓力相關(guān)。超臨界CO2流體萃取肉豆蔻揮發(fā)油主要成分為醇類，可能與CO2流體溶解性能相關(guān)。此外，劉博等[12]研究發(fā)現(xiàn)超臨界CO2流體萃取肉豆蔻揮發(fā)油中主要成分為肉豆蔻醚、檜烯和α-蒎烯等，亦有文獻(xiàn)報(bào)道表明主要成分為檸檬烯、γ-松油烯和α-松油烯等[9]，而本實(shí)驗(yàn)中超臨界CO2流體萃取肉豆蔻揮發(fā)油主要成分為醇類，可能與以下兩點(diǎn)有關(guān)：超臨界CO2流體萃取條件如萃取溫度、萃取壓力、萃取時(shí)間和CO2流量等；筆者采取頂空進(jìn)樣方法對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分檢測(cè)，這與文獻(xiàn)報(bào)道中直接進(jìn)樣檢測(cè)到的低沸點(diǎn)和高沸點(diǎn)成分種類和含量有差異。因此，課題組后期可通過調(diào)整超臨界CO2流體萃取條件和GC-MS進(jìn)樣方式對(duì)肉豆蔻揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行深入研究。通過4種不同方法提取獲得的肉豆蔻揮發(fā)油含有未鑒定物，其中傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾法、微波輔助水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2流體萃取肉豆蔻揮發(fā)油3種提取方法含有的未鑒定物分別是1，1和5個(gè)，可在后期深入研究中進(jìn)行分離和進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

本研究為后期課題組進(jìn)行需求量較大的肉豆蔻揮發(fā)油譜效作用研究提供了基礎(chǔ)，也可為新藥開發(fā)中肉豆蔻揮發(fā)油作為新制劑的組方成分的研究提供一定的參考。