楊愛霞，徐蕾，張力凡

(1.武漢市第一醫(yī)院藥學部，武漢 430022；2.湖北中醫(yī)藥大學藥學院，武漢 430065)

白癜風患病率為0.1%～2%[1]，是由皮膚黑色素合成功能喪失或減退導致，臨床表現(xiàn)為皮膚色素脫失，為常見的后天性皮膚病，常常影響患者的生理及心理健康。白癜風病因復雜，尚未明確，從中醫(yī)角度來看，目前有氣血失和、氣血瘀滯、肝腎不足、肝郁氣滯學說；從西醫(yī)角度來看，目前有自身免疫學說、遺傳因素、黑素細胞自毀學說、微量元素學說、神經(jīng)化學因素、黑素細胞凋亡異常學說。中醫(yī)認為白癜風的發(fā)生為風邪外襲、氣血失調，與心、肝、脾、肺等臟器有關[2]。祛白顆粒共包含9種中藥，其中：蒺藜[3]、鉤藤，散結祛瘀、清熱平肝；雞血藤、夜交藤，補血造血、祛風通絡；生地、牡丹皮、赤芍，清熱涼血、活血化瘀；當歸、丹參，補血活血、清心祛瘀。因此本方從中醫(yī)角度具有清心養(yǎng)肝、調養(yǎng)氣血、消風解瘀、涼血祛斑的功效。本研究通過制造白癜風小鼠模型并給予祛白顆粒治療，之后通過皮膚復色評分、病變組織病理學檢測、血清相關蛋白酶檢查，了解祛白顆粒治療小鼠白癜風模型的療效。

1 材料與方法

1.1試劑 丹皮酚(中國食品藥品檢定研究院，批號：201407，含量：96.8%)；阿魏酸(中國食品藥品檢定研究院，批號：201614，含量：97.3%)；2，3，5，4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷(北京中科質檢生物技術有限公司，批號：201311，含量：≥98%)；對苯二酚(國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170704，AR)；羧甲基纖維素鈉800-1200(國藥集團化學試劑有限公司，批號：F20090916，CP)；膽堿酯酶(cholinesterase，ChE，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：E20180701-28436B)；單胺氧化酶 (monoamine oxidase，MAO，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：E20180702-28367B)；酪氨酸(tyrosinase,TYR)試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：E20180703-20470B)；祛白顆粒(武漢市第一醫(yī)院實驗室自制，批號：20180302)。

1.2儀器 電子天平(BS124S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，感量：1 mg )；pH酸度計(上海儀電科學儀器)；MK3型酶標儀(熱電上海儀器有限公司)，85-2型恒溫磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)。

1.3實驗動物 C57BL小黑鼠，級別SPF，體質量(18±2)g，雌性，由湖北省實驗動物研究中心提供。合格證號：42000600028197，許可證號：00269039。飼養(yǎng)于武漢市第一醫(yī)院動物實驗室，實驗室溫度(20±2) ℃，相對濕度(40±10)%，實驗動物使用許可證號：SYXK(鄂)2015-0018，No：00264380；實驗動物從業(yè)人員上崗證：W20180224。

1.4動物造模

1.4.1造模原理 TYR是一種含銅的氧化酶，催化酪氨酸轉化為多巴，多巴轉化為多巴醌，在黑色素的形成中發(fā)揮作用，是黑色素合成的限速酶。氫醌制備白癜風模型的原理為阻斷TYR催化酪氨酸生成黑色素[4]，也有認為氫醌通過進入黑素細胞產(chǎn)生細胞毒性，從而抑制黑色素生成[5]。

1.4.2造模方法 小鼠51只，采用隨機數(shù)字表法分為5組：正常對照組、模型對照組和祛白顆粒小劑量組、中劑量組各10只，大劑量組11只。對模型對照組和祛白顆粒小劑量組、中劑量組、大劑量組小鼠進行造模制備白癜風模型。選擇小鼠頸背部黑色部位2 cm×2 cm造模，電動剃毛刀脫毛，每日在背部脫毛區(qū)均勻涂抹2.5%氫醌軟膏[5-7](羧甲基纖維素鈉1 g與氫醌2.5 g溶于去離子水100 mL中)，電磁攪拌1 h，正常對照組小鼠每日于背部脫毛處涂抹空白基質(羧甲基纖維素鈉1 g溶于100 mL去離子水中)0.5 mL，持續(xù)60 d。在此期間，各組小鼠每5天脫毛1次。造模每10天對造模區(qū)域進行攝像，記錄皮膚脫色情況，并對造模情況進行評分。評分標準：0分，造模處膚色較脫色前色素減退不明顯；1分，造模處膚色較脫色前出現(xiàn)輕微色素減退；2分，造模處膚色出現(xiàn)明顯色素減退或出現(xiàn)實驗區(qū)皮膚上少量毛發(fā)變白；3分，造模處膚色蒼白或出現(xiàn)明顯的毛發(fā)變白。評分為3分表示造模成功[8]。在試驗過程中，模型對照組、祛白顆粒小劑量組、中劑量組小鼠各死亡1只。

1.5給藥 按劑量分別灌胃給藥，給藥的容積為20 mL·kg-1，每天 1 次，連續(xù)灌胃40 d。按照小鼠體質量計算每日服藥量，根據(jù)Meeh-Runer公式，60 kg成人用藥量換算為小鼠用藥量為：成人用量(g·kg-1)×9.01×W小鼠(成人體質量按60 kg計算)。治療組分別按照該劑量的0.5，1，2倍作為祛白顆粒小、中、大劑量組。祛白顆粒小劑量組：1.955 17 g·kg-1；祛白顆粒中劑量組：3.910 34 g·kg-1；大劑量組：7.820 68 g·kg-1；灌胃量0.5 mL[7]。造模第20天開始分組灌胃。正常對照組和模型對照組每天灌胃0.5 mL純凈水，小劑量組、中劑量組、大劑量組分別按劑量進行灌胃。

1.6觀測指標

1.6.1復色觀察 選取造模成功動物開始灌胃給藥，每10 d對實驗動物進行攝像評估，觀察造模部位色素沉著情況，實驗結束后觀察造模部位膚色變化并評分評價整體的治療有效率[8]。評分標準：3分，造模區(qū)呈深褐色或黑色，色素基本恢復正常；2分，造模區(qū)為中褐色或淺灰色、色素恢復面積>50%；1分，造模區(qū)為淡褐色、色素恢復面積<50%；0分，造模區(qū)皮膚呈白斑狀或蒼白。有效率(%)=(3分數(shù)+2分數(shù))/總數(shù)×100%。

1.6.2病理切片 實驗結束后處死小鼠，取造模處皮膚約1 cm×1 cm，多聚甲醛固定，石蠟包埋。每張切片取皮膚縱切面、橫切面各兩張。分別進行HE染色，顯微鏡下觀察縱切面各組黑色素分布情況；掃描橫切面，用CaseViewer在相同放大倍數(shù)下每個視野中棘層黑色素毛囊、基底層黑素、含黑素顆粒表皮細胞[6，9]的數(shù)量。

1.6.3生化指標 文獻報道白癜風的發(fā)生與體內(nèi)血清TYR、ChE、MAO[7]活性有關，第40天灌胃1 h后麻醉小鼠，取眼眶血0.5～0.8 mL，低溫離心(5000×g)10 min后小心吸取血清共約0.3 mL，按照酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法試劑盒說明書測定TYR、MAO、ChE含量。

2 結果

2.1小鼠脫色與復色結果評定 正常對照組小鼠背部皮膚在此期間無變化，模型對照組小鼠皮膚出現(xiàn)脫色、白斑且伴隨非造模區(qū)域毛發(fā)變白無光澤現(xiàn)象。灌胃治療結束后，與模型對照組比較，祛白顆粒小、中、大劑量組背部皮膚出現(xiàn)色素沉著，毛發(fā)逐漸由白色變?yōu)樽厣⒑谏?，見圖1。祛白顆粒小、中、大劑量組治療有效率分別為44.4%，66.7%，81.2%，與模型對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

2.2小鼠黑色素細胞計數(shù)及病理切片觀察 見圖2。從小鼠皮膚縱切片可以看出，正常對照組表皮無增生，表皮及毛囊細胞有大量黑色素顆粒；模型對照組小鼠表皮細胞及毛囊細胞中黑色素顆粒明顯較少，且表皮增生，毛囊數(shù)量減少；祛白顆粒小、中、大劑量組表皮均有一定程度的增生，但黑色素顆粒及毛囊數(shù)量隨給藥劑量的增加而增加。掃描切片計數(shù)皮膚中黑色素毛囊、基底層黑素細胞、含黑素顆粒表皮細胞得知，祛白顆粒對小、中、大劑量組小鼠的治療效果呈劑量依賴性。見表2。

2.3生化指標 給予不同劑量祛白顆粒治療40 d后，與正常對照組比較，其余組小鼠血清中TYR、ChE活性降低，MAO活性升高。與模型對照組比較，祛白顆粒小、中、大劑量組TYR、ChE活性增加(P<0.01)，MAO活性得到抑制(P<0.01)，且與給藥劑量呈正相關。見表3。

3 討論

祛白合劑為醫(yī)院經(jīng)方，運用于患者后其臨床癥狀均有不同程度的改善與消失，療效確切，此前的臨床使用中觀察到治療局限性白癜風總有效率為86.8%[10]，且未發(fā)現(xiàn)不良反應，值得推廣。然而中藥煎劑味苦、不易攜帶、熬制方法繁復，患者順應性較差。逐漸發(fā)展的中藥顆粒劑能有效糾正中藥煎劑的缺點，為患者提供便利。筆者在前期的課題研究中把祛白合劑制成了質量可控的祛白顆粒，本實驗旨在運用動物模型驗證祛白顆粒的作用效果，并分析其作用機制[11]。此次實驗中發(fā)現(xiàn)祛白顆粒對白癜風小鼠的作用效果呈現(xiàn)量-效關系，治療組小鼠黑色素顆粒、毛囊數(shù)及治療總有效率均有明顯增加，且治療組小鼠血清中的MAO、YTR、ChE均區(qū)別于模型對照組。交感神經(jīng)興奮致MAO活性增強導致過氧化氫聚集從而抑制黑色素生成量；ChE活性增強使得突觸間乙酰膽堿減少從而抑制黑色素生成[8]。另有文獻指出，丙二醛(MDA)、白細胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)[5，12]可能與白癜風的發(fā)生有一定關系，這些酶可能參與調控白癜風的發(fā)生過程。生化指標間接反映模型動物體白癜風的發(fā)生、發(fā)展及治療過程，是攻克白癜風重要參考標準。然而，由于祛白顆粒所含的化學成分復雜多樣，其具體作用成分及作用機制尚無法解釋，且白癜風病因尚未明確，目前也僅有3種基因收錄到數(shù)據(jù)庫中。近年西醫(yī)以單一成分-單一靶點[13]的思路研究中藥，這難以闡述中醫(yī)藥各個單味藥互相作用相輔相成的觀念。尋找中藥復方優(yōu)選組分，規(guī)避中藥的盲目性符合現(xiàn)代中醫(yī)藥發(fā)展需要[14-15]。另外，運用網(wǎng)絡藥理學分析中藥的作用機制受到諸多學者的關注，王吉燁等[16]運用admetSAR和 bSDTNB建立中藥-活性化成分-靶點-生物學過程-體液模型，基于粘液質理論分析了幾種維吾爾藥治療白癜風的作用機制，且推斷并驗證了山柰素和異鼠李素對白癜風的治療作用。按照網(wǎng)絡藥理學的思路，在后續(xù)的實驗中，筆者將運用網(wǎng)絡藥理學找出分析祛白顆粒的活性成分及作用靶點，分析出祛白顆粒中的單一成分治療白癜風的作用效果，試圖找尋白癜風的作用靶點及生物學過程，明確白癜風發(fā)病機制，從而了解疾病本質，進而辯證、協(xié)調用藥。

A.正常對照組；B.模型對照組；C.祛白顆粒小劑量組；D.祛白顆粒中劑量組； E.祛白顆粒大劑量組。

A.normal control group; B.model control group; C.low-doseQubaigranule group; D. medium-doseQubaigranule group; E. high-doseQubaigranule group.

Fig.1Backskinsoffivegroupsofmice

表1 5組小鼠的祛白顆粒治療效果比較

Tab.1ComparisonoftherapeuticeffectofQubaigranuleamongfivegroupsofmice

組別小鼠/只評分/只3分2分1分0分總有效率/%P值正常對照組1010000100.0-模型對照組9013511.1?1-祛白顆粒 小劑量組9045044.4?20.002 中劑量組9153066.7?20.000 大劑量組11272081.2?20.000

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01。

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01.

表2 5組小鼠黑色素毛囊、基底層黑素細胞、含黑素顆粒表皮細胞計數(shù)比較

組別黑色素毛囊基底層黑素細胞含黑素顆粒表皮細胞正常對照組109.67±18.93135.67±6.03164.33±11.93模型對照組34.33±9.02?164.67±14.05?163.00±7.94?1祛白顆粒 小劑量組62.33±10.8986.33±11.2486.33±9.45 中劑量組89.00±12.29?2104.00±6.00?2103.33±12.50?2 大劑量組91.67±16.07?3117.33±23.46?3138.00±18.52?3

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.05，*3P<0.01。

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.05，*3P<0.01.

A.正常對照組；B.模型對照組；C.祛白顆粒小劑量組；D.祛白顆粒中劑量組； E.祛白顆粒大劑量組。

A.normal control group; B.model control group; C.low-doseQubaigranule group; D. medium-doseQubaigranule group; E. high-doseQubaigranule group.

Fig.2Longitudinalsectionofskinsinfivegroupsofmice(HEstaining，×200)

表3 5組小鼠血清 TYR、ChE、MAO水平的比較

組別小鼠/只TYR/(μmol·L-1)ChEMAO(ng·mL-1 )正常對照組1011.1103±1.01381.5749±0.18572.1357±0.1959模型對照組93.7224±0.5789?12.9234±0.2609?13.6243±0.1002?1祛白顆粒 小劑量組94.9661±0.7389?22.4451±0.2035?22.8724±0.3052?2 中劑量組96.1795±0.8469?22.2501±0.2852?22.5800±0.3763?2 大劑量組118.7126 ±0.5925?22.0005±0.2796?22.4455±0.1325?2

與正常對照組比較，*1P<0.01；與模型對照組比較，*2P<0.01。

Compared with normal control group，*1P<0.01；compared with model control group，*2P<0.01.