毛艷菲，周岳娟，徐靜紅

(浙江省麗水市中心醫(yī)院藥劑科，麗水 323000)

銀屑病是一種慢性炎癥性皮膚疾病，全世界發(fā)病率2%～3%，且目前缺乏安全、有效的治療方法[1]。研究證實，皮膚局部促炎癥細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)及趨化因子如腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)增加，激活下游核因子-κB(NF-κB)，吸引免疫細(xì)胞在炎癥皮膚區(qū)域聚集并增殖替代原有的正常細(xì)胞，與銀屑病的發(fā)病有著密切聯(lián)系[2]。白藜蘆醇(resveratrol，RSV)是一種天然存在的多酚類化合物，研究顯示，其能夠通過抑制多種炎癥因子如IL-1Β、IL-6及TNF-α等的表達(dá)，下調(diào)NF-κB，發(fā)揮較強的抗炎作用[3]，有望成為防治銀屑病的新型化合物。但是由于白藜蘆醇水溶性差，化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定易被氧化分解，導(dǎo)致傳統(tǒng)口服等給藥方式藥物難吸收，體內(nèi)生物利用度低限制了其臨床應(yīng)用[4-5]。本次實驗在前期研究基礎(chǔ)上[6]，以自主合成的維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)-接枝-(ε-多聚賴氨酸，polylysine，PLL)(VES-g-PLL)聚合物為膜材制備包載白藜蘆醇的納米粒，提高藥物穩(wěn)定性、水溶性，改善其皮膚穿透性，繼以絲素凝膠為基質(zhì)分散納米粒，延長藥物在皮膚等局部組織的滯留時間，制備成白藜蘆醇納米粒-絲素凝膠，通過蘇木精-伊紅 (Hematoxylin-Eosin，HE)染色法、 馬松染色(Massom)及免疫組化染色等綜合考察載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠對于小鼠銀屑病的治療效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性BALB/c小鼠60只(8～11周)購自溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。實驗動物生產(chǎn)許可證號：SYXK(浙)2015-0001，合格證號：wydw2013-0050。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度(22±2)℃，相對濕度50%～60%，12 h循環(huán)照明的環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，自由攝食和飲水。

1.2藥品與試劑 白藜蘆醇(購自阿拉丁，含量≥99%，批號：36794)、維生素E琥珀酸酯-接枝-(ε-多聚賴氨酸)聚合物由實驗室前期合成，咪喹莫特(imiquimod，IMQ)，含量≥98%，購自3M Health Care Limited 公司(批號：H20160079)，小鼠 TNF-α、IL-6 和 IL-8專用 ELISA 試劑盒(eBioscience 公司，批號分別為168235001，146735017和165536004)、HE染色試劑盒(北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號：201560326)。

1.3儀器與設(shè)備 透射電鏡(日本電子公司，型號JEM-1230)、粒徑分析儀(美國Microtrac公司，型號S3500)、細(xì)胞破碎儀(SCIENTZ公司，型號：IID)、掃描電鏡(美國FEI公司，型號：Nova Nano SEM 200)。

1.4實驗方法

1.4.1白藜蘆醇納米粒的制備及其質(zhì)量表征 稱取適量白藜蘆醇以及VES-g-PLL聚合物，預(yù)先共溶于一定體積二甲亞砜(DMSO)溶液中，在磁力攪拌(轉(zhuǎn)數(shù)：1500 r·min-1)下，將上述DMSO溶液緩慢(15滴·min-1)滴入去離子水中自發(fā)組裝，在室溫、避光條件下攪拌過夜，將組裝納米粒轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，用純化水透析、離心，除去未包裹的游離藥物以及有機溶劑，制備白藜蘆醇納米粒(RSV-NPs)[7]。按照上述方法，不加白藜蘆醇，制備空白納米粒(Bk-NPs)。

透射電鏡觀察載藥及空白納米粒的微觀形態(tài)，同時應(yīng)用粒徑分析儀測定平均粒徑和Zeta電位。采用離心分離法測定載藥納米粒的包封率：取等量載藥及空白納米粒13 000 r·min-1離心10 min(r=10 cm)，去除上清液，將沉淀用去離子水沖洗后晾干24 h。將載藥納米粒沉淀質(zhì)量減去空白納米粒沉淀質(zhì)量即為載藥納米粒中包封的白藜蘆醇質(zhì)量。

包封率(%)=載藥納米粒中白藜蘆醇量(測定方法詳見上述包封率測定步驟)/白藜蘆醇總量×100%。

1.4.2白藜蘆醇納米粒-絲素凝膠的制備及其質(zhì)量表征 蠶繭(由西南大學(xué)蠶絲學(xué)實驗室提供)先在1.5%碳酸鈉溶液中煮沸30 min，然后用純化水清洗去除雜質(zhì)。洗凈的絲素蛋白在9.3 mol·L-1溴化鋰溶液60 ℃條件下充分溶解2 h。再把絲素蛋白溶液在透析袋中用純化水透析72 h。最終得到的絲素蛋白溶液濃度約2%。取制備好的絲素蛋白溶液和RVS-NPs溶液按體積比1：1混合，然后用細(xì)胞破碎儀超聲(功率20%)混合溶液1 min得到白藜蘆醇納米粒-絲素凝膠(RVS-NPs-gel)[8]。將RVS-NPs溶液換成等體積純化水，按照上述步驟制備空白絲素凝膠。

掃描電鏡觀察空白及載藥絲素凝膠的微觀形態(tài)，同時測定RSV-NPs及RVS-NPs-gel的體外藥物釋放度：將1 mLRVS-NPs溶液或RVS-NPs-gel加入到透析袋中(截留分析量3500 Da)。然后將透析袋放入10 mL釋放介質(zhì)[0.5%聚山梨酯80，pH=7.4磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer solution，PBS)]中，在37 ℃，120 r·min-1攪拌條件下進(jìn)行釋放試驗。分別于1，3，6，9，12，18，24，30，36，42，54，66及78 h抽取定量釋放介質(zhì)，及時補充空白釋放介質(zhì)。

采用高效液相色譜(HPLC)法測定釋放介質(zhì)中白藜蘆醇的濃度，色譜條件為：Agilent XDB C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)(安捷倫公司，美國)，甲醇-水(60：40)，流速1 mL·min-1，檢測波長為306 nm，進(jìn)樣量20 μL，以峰面積定量。以上述釋放介質(zhì)為溶劑系統(tǒng)溶解白藜蘆醇對照品，作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.3白藜蘆醇納米粒-絲素凝膠的在體藥物透皮實驗 取健康雄性BALB/c小鼠10只，采用隨機數(shù)字表法隨機分成兩組，除去背部皮膚上的毛發(fā)，選取1 cm2均勻涂抹白藜蘆醇溶液絲素凝膠或RVS-NPs-gel(20 mg RVS)。于48 h后處死小鼠，剝離背部皮膚后，用0.9%氯化鈉注射液反復(fù)沖洗干凈，冰凍切片，厚度5 μm，苯基吲哚染色(DAPI)7 min后激光共聚焦顯微鏡下觀察載藥納米膠束的皮膚滲透深度。

1.4.4白藜蘆醇納米粒聯(lián)合絲素凝膠在體治療小鼠銀屑的實驗研究

①銀屑病皮膚模型的建立。另取上述健康BALB/c小鼠60只，采用隨機數(shù)字表法選取小鼠15只作為正常對照組，另外45只正常小鼠參考文獻(xiàn)[9]建模方法，建立小鼠銀屑病皮膚模型，將實驗組小鼠背部剃毛后固定選取皮膚面積2 cm×3 cm，每天涂抹5%IMQ乳膏劑量為60.5 mg，每天1次，連續(xù)用藥8 d，以小鼠后背皮膚出現(xiàn)鱗屑及紅斑為造模成功，正常對照組小鼠每天給予同等劑量凡士林，用法同造模組。

②實驗分組及治療藥物干預(yù)。將上述造模成功后小鼠45只采用隨機數(shù)字表法隨機分成銀屑病對照組、白藜蘆醇溶液絲素凝膠組(RVS-gel組)、白藜蘆醇納米粒絲素凝膠(RVS-NPs-gel組)，每組15只，分別接受相應(yīng)形式的藥物治療，RVS-gel組及RVS-NPs-gel組小鼠分別給予RVS-gel及RVS-NPs-gel包含白藜蘆醇20 mg，涂抹于銀屑病皮膚處，隔天1次，總共5次，銀屑病對照組給予同等劑量空白絲素凝膠，正常對照組小鼠給予同等劑量PBS。

③小鼠背部銀屑病皮膚表型觀測及評分。借鑒臨床PASI評分標(biāo)準(zhǔn)[10]采用盲法對各組小鼠進(jìn)行銀屑病皮膚嚴(yán)重程度評估。評分內(nèi)容包括：紅斑、鱗屑及增厚。評分標(biāo)準(zhǔn)如下：0：無現(xiàn)象；1：輕微；2：中度；3：顯著；4：十分顯著。藥物干預(yù)后開始評分，每天1次，總共進(jìn)行10 d。

④HE染色實驗。10 d之后，處死小鼠，取部分背部皮膚用甲醛固定后進(jìn)行包埋切片、按照HE染色標(biāo)準(zhǔn)步驟行(試劑盒說明書)皮膚組織HE染色，考察各組藥物干預(yù)結(jié)束后小鼠表皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及肉芽組織新生情況，剩余背部皮膚組織用于后續(xù)檢測。

⑤酶聯(lián)免疫法測定(ELISA)檢測。取上述各組剩余皮膚組織1 cm2，加入PBS充分混勻，制成20%勻漿液，離心(2000 r·min-1，15 min)后取上清液，按試劑盒說明書進(jìn)行操作，采用ELISA檢測各組小鼠皮膚組織中TNF-α、IL-6和IL-8含量。

2 結(jié)果

2.1白藜蘆醇納米粒的質(zhì)量表征 空白及載藥納米粒形態(tài)圓整，載藥前后形態(tài)無明顯變化，粒徑及Zeta電位檢測顯示，空白及載藥納米粒粒徑分別為(45.21±4.37)和(52.71±6.12)nm，Zeta電位分別為(21.41±2.34)及(17.53±1.43)mV，均大于15 mV，說明本次實驗制備的空白及載藥納米粒穩(wěn)定性好。本次實驗制備的載藥納米粒的包封率高達(dá)(85.54±3.21)%，說明應(yīng)用VES-g-PLL聚合物制備的新型納米粒能夠?qū)﹄y溶性藥物白藜蘆醇實現(xiàn)高包封。見圖1。

A.空白納米粒；B.包載白藜蘆醇納米粒。

A.blank nanoparticles; B.RVS-loaded nanoparticles.

Fig.1Blankanddrug-loadednanoparticlesdetectedbytransmissionelectronmicroscopy

2.2白藜蘆醇納米粒-絲素凝膠的質(zhì)量表征 空白絲素凝膠的內(nèi)部主要以海綿樣片狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行互相連接，形成3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，為載藥納米粒的著床及釋藥提供骨架結(jié)構(gòu)。而載藥納米粒絲素凝膠的掃描電鏡結(jié)果顯示，載藥納米粒如絮狀物一般吸附在海綿樣3D網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的表面，從而用于銀屑病的治療。見圖2。

白藜蘆醇納米粒絲素凝膠和白藜蘆醇溶液絲素凝膠都沒有明顯的突釋現(xiàn)象，同時在pH值=7.4的PBS中，72 h后只(30.9±2.5)%的藥物從納米粒-絲素凝膠釋放，而(46.0±4.1)%的藥物從白藜蘆醇溶液絲素凝膠釋放，說明相比于單純的絲素凝膠，應(yīng)用納米粒結(jié)合絲素凝膠能夠更好地實現(xiàn)難溶性藥物的緩釋作用，延長藥物在靶部位的作用時間。見圖3。

2.3白藜蘆醇納米粒-絲素凝膠的在體藥物透皮實驗 在激光共聚焦顯微鏡下白藜蘆醇顯綠色熒光而細(xì)胞核顯藍(lán)色熒光。見圖4。結(jié)果證實：應(yīng)用白藜蘆醇溶液絲素凝膠干預(yù)48 h后大部分的白藜蘆醇還是停留在皮膚表面的角質(zhì)層，而應(yīng)用載藥納米粒絲素凝膠48 h后，皮膚組織的所有層面包括角質(zhì)層、上皮層及真皮層都分布有綠色熒光，說明應(yīng)用載藥納米粒絲素凝膠能夠增加藥物穿透皮膚的能力，增加藥物的治療效果。

A.空白絲素凝膠；B.白藜蘆醇納米粒-絲素納米凝膠。

圖2 掃描電鏡觀察空白絲素凝膠及載藥納米粒-絲素凝膠

A.blank NPs-gel；B.RVS-NPs-gel.

Fig.2BlankandRVS-NPsloadedgeldetectedbyscanningelectronmicroscope

2.4PASI評分評價各組小鼠藥物干預(yù)結(jié)束后的銀屑病治療效果 如圖5A所示，連續(xù)用IMQ乳膏8 d后，小鼠背部皮膚出現(xiàn)明顯的膠質(zhì)細(xì)胞增殖分化、紅斑等銀屑病典型癥狀，說明本次實驗銀屑病小鼠皮膚模型造模成功。圖5B為各組小鼠藥物治療干預(yù)后的病變部位皮膚組織的PASI評分，結(jié)果包括：皮膚紅斑、鱗屑及厚度。結(jié)果顯示，藥物開始治療前(銀屑病造模結(jié)束后)，銀屑病模型組小鼠的各項PASI評分包括紅斑、鱗屑及厚度評分分別為(3.57±0.19)，(3.63±0.16)和(3.71±0.13)分，較正常對照組小鼠的各項指標(biāo)顯著升高(均P<0.05)，進(jìn)一步說明銀屑病小鼠模型造模成功。藥物治療開始后，RVS-gel治療的小鼠較RVS-NPs-gel治療組小鼠各項PASI評分下降更快，而藥物治療10 d結(jié)束后，應(yīng)用RVS-NPs-gel治療組的各項PASI評分包括較RVS-gel顯著下降，紅斑、鱗屑及厚度評分分別為(1.02±0.15)，(1.09±0.1)，(1.12±0.2)比(2.17±0.13)，(2.06±0.11)，(2.08±0.14)分，均(P<0.05)。

圖3 白藜蘆醇不同載藥形式的體外釋放度測定

Fig.3Determinationoninvitroreleaseofresveratrolindifferentdrugloadingforms

圖4 RVS-NPs絲素凝膠及RVS溶液絲素凝膠的在體皮膚滲透結(jié)果

A.RVS干預(yù)IMQ乳膏誘導(dǎo)銀屑病小鼠的治療效果圖。B.4組小鼠RVS干預(yù)后的PASI評分。與正常對照組比較，*1P<0.05，與RVS-NPs-gel組比較，*2P<0.05。

A.Images of therapeutic effect of RVS on IMQ cream-induced psoriasis mice.B.PASI scores of four groups of mice after RVS treatment.Compared with normal control group,*1P<0.05; compared with the RVS-NPs-gel group,*2P<0.05.

A.正常對照組；B.銀屑病對照組；C.RVS-gel治療干預(yù)組；D.RVS-NPs-gel治療干預(yù)組。

2.5HE染色評級各組小鼠銀屑病藥物治療效果 各組小鼠藥物干預(yù)結(jié)束后(10 d之后)皮膚組織HE染色結(jié)果如圖6所示：與正常對照組比較，銀屑病對照組小鼠皮膚厚度明顯增加，同時角質(zhì)化細(xì)胞異常增殖及分化，出現(xiàn)明顯的角質(zhì)化不全及角化過度等典型銀屑病癥狀，而經(jīng)過不同形式藥物干預(yù)后，銀屑病小鼠皮膚的病理出現(xiàn)明顯改善，特別經(jīng)過RVS-NPs-gel干預(yù)組小鼠的皮膚表皮厚度較銀屑病對照組及RVS-gel治療干預(yù)組明顯變薄，皮膚未見明顯角質(zhì)化不全及角質(zhì)化過度等銀屑病病理特征。

2.6皮膚組織TNF-α、IL-6和IL-8的含量測定 如表1所示：相比于正常對照組，銀屑病模型組小鼠的皮膚組織TNF-α、IL-6和IL-8含量顯著升高(P<0.05)，而相比于銀屑病模型組及RVS-gel治療干預(yù)組，應(yīng)用RVS-NPs-gel治療干預(yù)組小鼠皮膚組織的TNF-α、IL-6和IL-8含量顯著下降(P<0.05)。

3 討論

相比于傳統(tǒng)的藥物制劑，納米藥物載體在遞送藥物至表皮、真皮提高治療部位藥物濃度、減小全身毒副作用方面，具有明顯的優(yōu)勢[11]。在眾多納米載體中，納米粒因具有較小的粒徑和功能多樣性等優(yōu)勢，具有提高難溶性藥物溶解度、增加藥物穿透致密皮膚的能力[12]。本次實驗應(yīng)用自主合成的兩親性新材料維生素 E 琥珀酸酯-接枝-ε-多聚賴氨酸(VES-g-PLL)為膜材制備包載難溶性藥物白藜蘆醇的納米粒，從納米粒的質(zhì)量考察結(jié)果可知，載藥納米粒的微觀形態(tài)圓整，Zeta電位(21.41±2.34) mV，包封率高達(dá)(85.54±3.21)%，說明載藥納米粒能夠達(dá)到對于難溶性藥物白藜蘆醇的高包封，提高藥物的溶解度。

表1 4組小鼠皮膚組織TNF-α、IL-6和IL-8的含量比較

組別TNF-αIL-6IL-8正常對照組20.21±1.452.41±0.324.61±0.43銀屑病對照組36.59±2.96?1?2 5.14±0.41?1?27.87±1.67?1?2RVS-gel組28.41±1.21?23.47±0.21?26.12±1.31?2RVS-NPs-gel組21.35±0.872.63±0.225.12±0.56

與正常對照組比較，*1P<0.05，與RVS-NPs-gel組比較，*2P<0.05。

Compared with normal control group,*1P<0.05; compared with RVS-NPs-gel group,*2P<0.05.

另外，為了進(jìn)一步增加載藥納米粒在皮膚組織的停留時間，延長藥物的療效，本次實驗還應(yīng)用天然蠶絲提取物絲素作為凝膠基質(zhì)制備白藜蘆醇納米粒-絲素水凝膠。體外藥物釋放及在體的透皮實驗結(jié)果顯示，相比于白藜蘆醇溶液凝膠，應(yīng)用載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠能夠明顯減緩藥物的釋放速度(P<0.05)，同時增加藥物的皮膚穿透性能。其原因一方面可能是絲素水凝膠帶負(fù)電可用于帶正電的載藥納米粒的吸附，實現(xiàn)載藥納米粒的緩釋作用，同時納米粒又能增加藥物的皮膚穿透性能。因此，應(yīng)用載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠能夠在增加藥物的皮膚滲透性能的同時實現(xiàn)藥物的緩釋效果，進(jìn)一步延長藥物的療效。

為了驗證載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠對于銀屑病的治療效果，本次實驗應(yīng)用IMQ皮膚刺激建立小鼠銀屑病模型，同時采用經(jīng)典的PASI評分及HE染色進(jìn)行各組治療效果評價。結(jié)果顯示：藥物干預(yù)10 d結(jié)束后，銀屑病模型組小鼠皮膚表皮增厚，角質(zhì)化細(xì)胞增殖明顯，PASI的各項評分較正常對照組明顯升高(均P<0.05)，而經(jīng)過載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠治療組小鼠的皮膚組織病理結(jié)構(gòu)明顯改善，各項PASI評分較銀屑病對照組及白藜蘆醇溶液凝膠組顯著下降(均P<0.05)，說明應(yīng)用載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠較單純藥物溶液凝膠具有更好的銀屑病的治療效果。另外，本次實驗還應(yīng)用ELISA測定了促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8的濃度[13-14]考察載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠治療銀屑病的機制。結(jié)果顯示：銀屑病對照組與正常對照組小鼠皮損組織TNF-α、IL-6和IL-8含量具有顯著差異(P<0.05)。而經(jīng)過載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠治療之后小鼠皮損組織TNF-α、IL-6和IL-8含量較銀屑病對照組及白藜蘆醇溶液凝膠對照組顯著下降(P<0.05)，說明白藜蘆醇能夠通過抑制炎癥因子的表達(dá)從而發(fā)揮治療銀屑病的作用。

綜上所述，本次實驗通過應(yīng)用自主合成的新材料VES-g-PLL制備包載難溶性藥物白藜蘆醇的載藥納米粒聯(lián)合絲素凝膠能夠通過抑制TNF-α、IL-6和IL-8等炎癥因子的表達(dá)，發(fā)揮治療銀屑病的作用，有望為臨床防治銀屑病提供新的方法及途徑。