黃幸 丁峰， 彭宏祥 潘介春 何新華，3 徐炯志 李琳

（1. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530004；2. 廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所，南寧 530007；3. 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004）

轉(zhuǎn)錄因子是一種具有特殊結(jié)構(gòu)并且能行使調(diào)控基因表達(dá)功能的蛋白質(zhì)分子。植物的轉(zhuǎn)錄因子有2 種，一種是非特異性轉(zhuǎn)錄因子，它們可以非選擇性地調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如大麥中的HvCBF2（C-repeat/DRE binding factor 2）［1］；另一種為特異性轉(zhuǎn)錄因子，它們能夠選擇性調(diào)控某種或某些基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如WRKY、bHLH、bZIP、MYB、NAC、HMG、HSF、zinc-finger 蛋白、AP2/ERF（乙烯響應(yīng)因子）等，它們在調(diào)控植物的特異性方面發(fā)揮著重要而獨(dú)特的作用［2-3］。其中WKRY 基因家族是高等植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在整個植物譜系中均有發(fā)現(xiàn)。Ishiguro 等［4］從甘薯中克隆出世界上第一個WRKY 基因SPF1（Swet potato factor 1），隨后在多種植物中成功分離鑒定到WRKY 轉(zhuǎn)錄因子。WRKY 基因家族在進(jìn)化過程中，從綠藻中的一個或幾個基因，到最早陸生苔蘚中的30 多個基因，再到高等植物中的100 多個基因，顯示了其基因擴(kuò)張的過程（表1）。

表1 21 種植物的WRKY 家族基因

Rushton 等［5］從 歐 芹 中 鑒 定 出WRKY1、WRKY2 和WRKY3，將其命名為WRKY（發(fā)音為“worky”），并首次證明了WRKY 蛋白在調(diào)節(jié)植物對病原體的反應(yīng)中起著重要的作用。同時在調(diào)控蔗糖（SPF1）或萌發(fā)過程（ABF1 和ABF2）基因表達(dá)方面也發(fā)揮著潛在的作用［4-5］。自2000 年有學(xué)者發(fā)表了關(guān)于WRKY 轉(zhuǎn)錄因子文章以來，在過去的十幾年里，科學(xué)家們對WRKY 蛋白的研究取得了重大進(jìn)展。以往的研究綜述主要集中在WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在防御反應(yīng)中的作用，本文將從WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物中調(diào)控作用、WRKY 蛋白功能機(jī)制、涉及WRKY 轉(zhuǎn)錄因子信號傳遞中自調(diào)節(jié)和交叉調(diào)節(jié)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及基于WRKY 基因組測序的基因進(jìn)化等方面總結(jié)植物WRKY 轉(zhuǎn)錄因子最新研究進(jìn)展，以便更全面地了解它們在植物中的作用。

1 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征與分類

1.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)特征

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子具有非常顯著的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，其蛋白結(jié)構(gòu)基本含有1-2 個WRKY 結(jié)構(gòu)域（圖1），為DNA 結(jié)合域（DBD），約由60 個高度保守的氨基酸殘基組成，包括位于N 端的七肽和位于C 端的鋅指結(jié)構(gòu)。位于N 末端的七肽WRKYGQK 絕對保守，是核心序列，位于C 端的序列由C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）型鋅指結(jié)構(gòu)組成［23-25］。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可通過WRKY 結(jié)構(gòu)域與靶基因啟動子區(qū)的順式作用元件TTGAC（C/T）核苷酸序列（W-box）特異性結(jié)合，以此激活或抑制轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)［15，26］。Yamasaki等［27］報道了擬南芥WRKY4 結(jié)構(gòu)域由一個四鏈β 片層組成，在β 片層的C 端由保守的半胱氨酸/組氨酸（Cys/His）殘基形成一個鋅結(jié)合袋，WRKYGQK殘基對應(yīng)于序列的N 端鏈，在序列的中間被Gly 殘基扭折，使得涉及Trp（色氨酸）殘基的廣泛疏水作用，進(jìn)而促使β 鏈的結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性。β 鏈的WRKYGQK 基序可以接觸一個大約6 bp 區(qū)域，這在很大程度上與W-box（TTGACY）的長度是一致的。表明WRKYGQK 的基序可以與靶基因啟動子區(qū)的W-box 結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域在不同植物中存在多種變異。水稻W(wǎng)RKY 家族成員有19 個WRKY 結(jié)構(gòu)域的變體，其中WRKYGEK 和WRKYGKK 是7 個域和5 個域共有的常見突變體［28］。在中間錦雞兒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)鑒定的53 個CiWRKY基因中，CiWRKY 蛋白既含有高度保守的WRKYGQK 基序，同時又包含2 個變異的WRKYGKK 和WKKYEEK 基 序［29］。有研究表明WRKYGQK 序列突變可顯著降低WRKY轉(zhuǎn)錄因子與DNA 的結(jié)合活性［25］。煙草NtWRKY轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)域中，C 端結(jié)構(gòu)域活性較強(qiáng)，而N 端WRKY 結(jié)構(gòu)域與W-box 的結(jié)合活性較弱，其C2H2型鋅指狀基序中保守的半胱氨酸和組氨酸殘基被取代，也能使WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合遭到破壞［25］。

除WRKY 結(jié)構(gòu)域之外，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子還包含其他結(jié)構(gòu)域，包括TIR-NBS-LRR（Toll/interleukin-1 receptor-nucleotide binding site-leucine-rich repeat）、激酶結(jié)構(gòu)域、脯氨酸富集區(qū)、谷氨酰胺富集區(qū)、絲氨酸-蘇氨酸富集區(qū)、亮氨酸拉鏈、核定位結(jié)構(gòu)域等［30］。擬南芥AtWRKY7 同時含有一個WRKY 結(jié)構(gòu)域和一個鈣調(diào)蛋白CaM 結(jié)合結(jié)構(gòu)域［31］。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子多樣的結(jié)構(gòu)域表明，擁有特殊結(jié)構(gòu)的WRKY轉(zhuǎn)錄因子可以在基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮重要的特殊功能作用。

1.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的分類

從植物中獲得完整的WRKY 基因家族序列之前，Eulgem 等［23］把WRKY 家族成員分為Group I、GroupII 和GroupIII 3 個 亞 家 族。Group I 含 有2 個WRKY 保守結(jié)構(gòu)域，其C 端的鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2型；Group II 只含有1 個WRKY 保守結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)與I類相同，為C2H2型；Group III鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC型，包含1 個WRKY 保守結(jié)構(gòu)域（圖1-A）。但也有少部分WRKY 蛋白的結(jié)構(gòu)類型與這3 類特征都不匹配，如AtWRKY10，其結(jié)構(gòu)可能是N 末端的WRKY 保守結(jié)構(gòu)域發(fā)生了丟失，只含有1 個WRKY 保守結(jié)構(gòu)域，與Group I 的蛋白結(jié)構(gòu)特征相似但又不一致［24］；如蘋果的WRKY 蛋白C 末端因缺少完整的類似鋅指蛋白結(jié)構(gòu)而被分類為Group IV［13］。Zhang 等［28］認(rèn)為Eulgem 等對擬南芥WRKY 家族的分類并不完全基于系統(tǒng)發(fā)育分析，為了反映WRKY 域的演化過程，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子分為I、IIa+IIb、IIc、IId+IIe 和III，而II 類并不單獨(dú)分為一類。隨后，Tamura 等［34］通過純系統(tǒng)發(fā)育數(shù)據(jù)分析也證實(shí)了這一點(diǎn)（圖2）。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析對理解植物生物多樣性的整體機(jī)制，以及WRKY 基因在植物調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮的特殊功能具有重要意義。

圖1 WRKY 結(jié)構(gòu)域［32］

圖2 高等植物WRKY 基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹［34］

2 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子基因家族的生物學(xué)功能

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，在植物不同發(fā)育時期和多種環(huán)境因素誘導(dǎo)下，激活或抑制目的基因表達(dá)特定的目的蛋白，發(fā)揮著各種非常重要的生物學(xué)功能，主要涉及對植物的生長發(fā)育和衰老調(diào)控、非生物和生物脅迫應(yīng)答等過程。

2.1 生長發(fā)育調(diào)控

植物基因組基因的有序表達(dá)是植物生長發(fā)育的基礎(chǔ)。大量研究表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在不同的組織中發(fā)揮非常重要的功能作用，調(diào)控植物的生長發(fā)育。許多研究已證實(shí)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植株生長、根系發(fā)育、果實(shí)成熟、衰老等代謝過程等多種生理過程中的重要作用。

2.1.1 植株生長許多轉(zhuǎn)錄因子具有調(diào)節(jié)植物發(fā)育和矮化的作用（包括WRKY、AP2/EREBP、bHLH、C2H2 和ARF）。其中，已知最多的是WRKY 家族［35-36］。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子具有誘導(dǎo)植株矮化的作用［37］。OsWRKY11過表達(dá)降低了轉(zhuǎn)基因水稻植株的高度，導(dǎo)致植株矮?。?8-39］。矮化表型主要是由于細(xì)胞分裂和細(xì)胞伸長的變化導(dǎo)致的，這些過程受細(xì)胞分裂素（CTK）、生長素（IAA）、赤霉素（GA）和油菜素類固醇（BR）的調(diào)控［40］。IAA、CTK 和GA被廣泛認(rèn)為在植物矮化中具有重要作用［41-42］。另外，BR 在植物矮化中也具有重要作用［40］。在擬南芥中，存在BR 生物合成基因缺陷的cpd、cbb3、dwf4突變體和BR6ox1、BR6ox2雙突變體均表現(xiàn)為矮化表型［43］。Zheng 等［44］研究表明，WRKY 可以直接調(diào)控BR 的生物合成。蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdWRKY9 是通過直接抑制油菜素類固醇限制合成酶MdDWF4的轉(zhuǎn)錄，減少BR 的產(chǎn)生，正向調(diào)控植株的矮?。?4］。以上證明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物發(fā)育和矮化中發(fā)揮著重要的作用。

2.1.2 根系發(fā)育 據(jù)報道WRKY 基因在調(diào)節(jié)植物激素合成中發(fā)揮作用［45-46］。一些WRKY 基因通過影響植物激素信號或基因表達(dá)來影響根系結(jié)構(gòu)［47］。與野生型相比，OsWRKY31的過表達(dá)導(dǎo)致側(cè)根更少更短，這可能是通過干擾生長素的響應(yīng)或轉(zhuǎn)運(yùn)來實(shí)現(xiàn)的［47］。

類似的研究表明，OsWRKY28功能缺失突變體可能是通過降低了JA 生物合成基因的表達(dá)從而影響根生長［48］。另外，乙烯（ETH）在根系的發(fā)育中可誘導(dǎo)根毛和不定根的形成。在小麥試驗(yàn)中，乙烯合成的1-氨基環(huán)丙烯-1-羧酸合酶基因在過表達(dá)系TaWRKY51-OE 中下調(diào)，而在基因沉默TaWRKY51-RNAi 系中上調(diào)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TaWRKY51是ETH 合成的負(fù)調(diào)控因子，TaWRKY51通過與啟動子區(qū)存在的W-box 順式元件結(jié)合抑制ETH 合成基因ACS的表達(dá)，協(xié)調(diào)小麥乙烯合成和側(cè)根形成［49］。說明WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)節(jié)植物的相應(yīng)的激素合成，然后通過這些植物激素來調(diào)控根系的發(fā)育。

2.1.3 果實(shí)成熟 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在果實(shí)成熟的生理途徑中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。通過表達(dá)模式分析顯示，近60%CaWRKY在辣椒成熟過程中表達(dá)［50］。ClWRKY在西瓜果實(shí)組織中均較高表達(dá)［51］。在鱷梨［52］和草莓［53］中也成功篩選到與成熟過程相關(guān)的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子，表明其在果實(shí)成熟過程中可能發(fā)揮一定的調(diào)控作用。其中，F(xiàn)aWRKY轉(zhuǎn)錄因子參與了脫落酸（ABA）的信號通路，通過調(diào)控ABA 的合成來促進(jìn)草莓果實(shí)的成熟［53］。

2.1.4 衰老 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子同樣能參與葉片衰老的調(diào)控。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是擬南芥衰老轉(zhuǎn)錄組中第二大轉(zhuǎn)錄因子家族［54］。AtWRKY6在衰老過程中明顯上調(diào)，通過對AtWRKY6靶基因的分析，確定衰老誘導(dǎo)了受體激酶和受體樣激酶（SIRK/FRK1）基因的表達(dá)。SIRK/FRK1編碼一種受體樣蛋白激酶，該蛋白激酶在葉片衰老過程中被強(qiáng)特異性誘導(dǎo)表達(dá)［55-56］。在其他物種中，調(diào)節(jié)衰老的WRKY 基因（包括GhWRKY42、CiWRKY40-4和BrWRKY6）相 繼 得到驗(yàn)證。如GhWRKY42的過表達(dá)導(dǎo)致導(dǎo)致衰老相關(guān)基因表達(dá)升高，促進(jìn)了葉片早衰［57］。CiWRKY40-4過表達(dá)至擬南芥延緩了葉片衰老，是衰老的負(fù)調(diào)控因子［29］。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子也可以通過調(diào)控植物激素的合成來調(diào)控葉片的衰老。GA 可以抑制葉片衰老，而BrWRKY6 通過W-box 順式元件與衰老相關(guān)基因BrSAG12、BrNYCl、BrSGR1的啟動子結(jié)合，抑制GA 生物合成基因BrKAO2和BrGA20ox2的表達(dá)，加速了葉片的衰老［58］。

2.2 參與植物的非生物和生物脅迫調(diào)控

植物的生存環(huán)境復(fù)雜多變，經(jīng)常遭受非生物因素和生物因素的逆境脅迫，影響植物的生長發(fā)育，嚴(yán)重會直接造成植物死亡。植物通過基因的表達(dá)調(diào)控可以抵抗逆境脅迫的侵害，其中WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物對逆境脅迫響應(yīng)過程中的調(diào)節(jié)具有重要作用。

2.2.1 參與植物的非生物調(diào)控 WRKY 是一類鋅指型轉(zhuǎn)錄因子，主要存在于植物中，它在調(diào)節(jié)植物的許多非生物應(yīng)激反應(yīng)（如干旱、澇漬、高鹽、高溫、低溫、機(jī)械損傷、金屬元素等）中起關(guān)鍵作用。近年來，發(fā)現(xiàn)越來越多的WRKY 基因參與非生物逆境應(yīng)答，不僅有模式植物煙草和擬南芥，還有水稻、小麥、大豆、玉米、棉花、黃瓜、向日葵、菊花、竹子、葡萄、核桃、野生樹種等多種植物，且大多數(shù)已經(jīng)通過基因過表達(dá)或敲除的方式進(jìn)一步驗(yàn)證了其在植物非生物脅迫中的調(diào)控作用。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作為干旱、低溫等脅迫應(yīng)答的主要成分，可與下游基因啟動子中的順式作用元件特異性結(jié)合，調(diào)節(jié)一系列依賴該順式作用元件的抗逆功能基因以特定的強(qiáng)度在特定的時間與空間表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)植物對干旱、低溫及高鹽等逆境的抗性。目前，越來越多響應(yīng)非生物脅迫的植物WRKY 基因組序列被鑒定報道（表2）。

2.2.2 參與植物生物脅迫調(diào)控 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)受多種環(huán)境和內(nèi)部因子強(qiáng)烈而迅速地誘導(dǎo)，尤其是生物脅迫相關(guān)的因子。植物對生物脅迫的反應(yīng)依賴存在于細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)部種類繁多的受體蛋白。一般而言，處于細(xì)胞膜上的受體通過識別病原菌上保守的特征序列，從而啟動抗性反應(yīng)。這類保守的特征序列簡稱病原體相關(guān)分子模式（Pathogen associated molecular pattern，PAMP），識別這一序列的受體被稱為模式識別受體（Pattern recognition receptor，PRR），其介導(dǎo)的抗性反應(yīng)稱之為PAMP 觸發(fā)的免疫反應(yīng)（PAMP triggered immunity，PTI）［77-79］。另外，細(xì)胞內(nèi)部的受體蛋白多為NBS（Nucleotide binding site）-LRR（Leucine-rich repeat）類抗病基因所編碼，其直接或間接識別病原菌釋放到細(xì)胞內(nèi)部的效應(yīng)因子（Effector），啟動抗病反應(yīng)，這一反應(yīng)被稱為效應(yīng)因子觸發(fā)性免疫（Effector triggered immunity，ETI）。這兩種反均需要WRKY 轉(zhuǎn)錄因子介導(dǎo)［77，79］。植物在受到各種微生物或病原體侵害時，通過啟動這些復(fù)雜免疫系統(tǒng)來保護(hù)自己免受攻擊。近年來，越來越多的WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在這些免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用（表3）。

3 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制

3.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制：轉(zhuǎn)錄的激活、抑制和去抑制

WRKY 蛋白可以激活或抑制轉(zhuǎn)錄，通常富含潛在的轉(zhuǎn)錄激活和抑制域。一些WRKY 因子具有兩種功能。例如，在酵母中，AtWRKY53 根據(jù)啟動子上下游序列激活或抑制報告基因的轉(zhuǎn)錄。AtWRKY6在轉(zhuǎn)錄激活SIRK 基因（編碼與衰老有關(guān)的受體樣蛋白激酶）的同時，負(fù)向自調(diào)節(jié)自身的啟動子［56］。通過瞬時表達(dá)研究發(fā)現(xiàn)，OsWRKY72和OsWRKY77在糊粉蛋白細(xì)胞中是ABA 信號的激活因子，同時又是GA 信號的抑制因子［45］。CaWRKY40b既是自身啟動子的激活因子，也是免疫相關(guān)基因HSC70的轉(zhuǎn)錄的抑制因子［97］。以上表明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在多種信號通路中既可以是激活因子，又可以成為抑制因子。

表2 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的調(diào)控作用

3.1.1 轉(zhuǎn)錄激活 研究表明，許多基因受到與其啟動子相關(guān)的WRKY 因子的激活。BhWRKY1與BhGolS1（半乳糖醇合成酶）啟動子的W-box 結(jié)合，轉(zhuǎn)錄激活BhGolS1的表達(dá)，可以提高擬南芥的耐旱性［98］。AtWRKY50可以和TGA2或TGA5作用與PR1啟動子的W-box 結(jié)合，協(xié)同激活PR1 的表達(dá)，增強(qiáng)擬南芥的抗性［99］。

MAP 激酶（MAPK）參與調(diào)控WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合活性。例如，在擬南芥中，MEKK1 蛋白激酶是雙功能蛋白，在擬南芥衰老誘導(dǎo)的信號通路中，它既可以與WRKY53的啟動子在W-box 上游的一個位點(diǎn)（WP1）結(jié)合，又可以誘導(dǎo)AtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子磷酸化，促進(jìn)AtWRKY53轉(zhuǎn)錄因子和與其自身編碼基因啟動子的結(jié)合，調(diào)控擬南芥的衰老［100］。MAPK 通過磷酸化激活WRKY46 轉(zhuǎn)錄因子與PAMP響應(yīng)基因NHL10啟動子的結(jié)合活性，增加NHL10基因的表達(dá)，調(diào)控擬南芥的對細(xì)菌鞭毛蛋白病原體的防御反應(yīng)［101］。

WRKY 功能的另一種機(jī)制是通過小RNA（smRNA）（ 微 小RNA，miRNA 和 小 干 擾RNA，siRNA）起作用，它們已成為調(diào)控基因表達(dá)的基本模式［102］。由于多個miRNA 的預(yù)測靶點(diǎn)編碼WRKY轉(zhuǎn)錄因子［102］，因此，WRKY 不僅可以調(diào)節(jié)smRNA的數(shù)量，而且WRKY 轉(zhuǎn)錄因子本身也是smRNA 的靶向因子。

3.1.2 轉(zhuǎn)錄的抑制和去抑制 除了含有豐富的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子還存在重要的轉(zhuǎn)錄抑制區(qū)。大量的證據(jù)表明，許多基因被與其啟動子結(jié)合的WRKY 因子所抑制。從WRKY 蛋白在抑制中的作用程度可以了解WRKY 的功能。

其中，一種作用方式是靶基因被其他轉(zhuǎn)錄因子與啟動子的調(diào)控位點(diǎn)結(jié)合，阻止自身轉(zhuǎn)錄因子與靶基因啟動子的結(jié)合。例如，PcWRKY1可以結(jié)合PcPR10基因啟動子的W-box，絲裂原活化蛋白激酶在細(xì)胞核中可以修飾已結(jié)合的PcWRKY1轉(zhuǎn)錄因子，這種修飾作用導(dǎo)致PcWRKY1轉(zhuǎn)錄因子的變構(gòu)釋放，并可能被其他WRKY 轉(zhuǎn)錄因子從同源的W-box元件中取代，從而解除對PcPR10和PcWRKY1的抑制［15］。另一種方式是通過作用于其他轉(zhuǎn)錄因子來抑制其他轉(zhuǎn)錄因子的作用。例如，bZIP28的轉(zhuǎn)錄可以上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ER 蛋白基因的表達(dá)，對植物的抗病具有積極的作用，但bZIP28啟動子中存在順式作用元件W-box，WRKY7/WRKY11/WRKY17可以通過與bZIP28啟動子中的W-box 元件結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄上抑制了bZIP28的上調(diào)，使得擬南芥對丁香假單胞細(xì)菌的抗性減弱［103］。

表3 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在生物脅迫中的調(diào)控作用

還有一種轉(zhuǎn)錄抑制方式是通過改變DNA 或組蛋白的高級結(jié)構(gòu)阻止轉(zhuǎn)錄的發(fā)生。如表觀遺傳修飾的DNA 甲基化和去甲基化、組蛋白乙?；腿ヒ阴；?，是誘導(dǎo)應(yīng)激轉(zhuǎn)錄關(guān)閉或開啟的關(guān)鍵機(jī)制。DNA甲基化能引起DNA 與蛋白質(zhì)相互作用方式的改變，從而抑制基因表達(dá)。例如，水稻葉片組織中2 種基因WRKY50和WRKY72啟動子上的DNA 甲基化，降低了WRKY50和WRKY72的表達(dá)水平［104］。相反，DNA 的去甲基化可以實(shí)現(xiàn)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的去抑制過程，使WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用轉(zhuǎn)為激活作用。DBR2的 啟 動 子 區(qū) 在4 個CG-、4 個CHH- 和2 個CHG-位點(diǎn)發(fā)生了去甲基化，使得青蒿素生物合成的關(guān)鍵調(diào)控基因DBR2表達(dá)上調(diào)，表明WRKY 啟動子上的去甲基化促進(jìn)了ABI5青蒿素的表達(dá)［105］。同樣，組蛋白的去乙酰化可以抑制轉(zhuǎn)錄因子與DNA 結(jié)合位點(diǎn)特異性結(jié)合，而組蛋白的乙?；瘎t發(fā)揮相反的作用。組蛋白去乙?；?9（HDA19）通過去除組蛋白尾部的乙?；种艫tWRKY38和AtWRKY62的轉(zhuǎn)錄，負(fù)調(diào)控基底防御［106］。而另外一項(xiàng)乙?；难芯勘砻?，擬南芥WRKY40啟動子上的組蛋白H3K9（組蛋白H3 第9 位賴氨酸）乙?；?，可以增加WRKY40基因的表達(dá)，提高擬南芥對鐮刀菌的抗性［107］。以上這些研究表明，通過表觀遺傳修飾的DNA 甲基化和去甲基化、組蛋白乙?；腿ヒ阴；饔?，可以誘導(dǎo)WRKY 基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)閉或開啟。

4 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

在DNA 水平上，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通過識別并結(jié)合其目標(biāo)基因中的W-box，識別自身或其他目標(biāo)基因的啟動子來激活或抑制轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)調(diào)控作用。通過蛋白質(zhì)-DNA 相互作用，WRKY 蛋白的上游調(diào)控因子和下游靶基因之間的相互作用和交叉作用構(gòu)成了復(fù)雜的WRKY 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在蛋白質(zhì)水平上，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，包括WRKY 轉(zhuǎn)錄因子之間與多種調(diào)控蛋白的相互作用，共同調(diào)控植物的生長發(fā)育和響應(yīng)環(huán)境中的各種應(yīng)激反應(yīng)。

4.1 WRKY轉(zhuǎn)錄因子的自調(diào)控和交叉調(diào)控

WRKY 信號網(wǎng)絡(luò)的一個特點(diǎn)是通過WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與其自身啟動子相互作用的自調(diào)控和其他WRKY 轉(zhuǎn)錄因子作用的交叉調(diào)控來實(shí)現(xiàn)調(diào)節(jié)，這是通過識別并結(jié)合目標(biāo)基因中的W-box 啟動子來實(shí)現(xiàn)的。例如，CaWRKY40b通過直接靶向自身啟動子中的W-box，在轉(zhuǎn)錄水平上表現(xiàn)出正反饋調(diào)控［97］，從而實(shí)現(xiàn)了WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的自調(diào)控。歐芹的PcWRKY1在啟動子中具有3 個協(xié)同作用的W-box 的保守排列［108］，在PAMP 誘導(dǎo)后，PcWRKY1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物增加［109］，通過染色質(zhì)免疫沉淀分析顯示，這3 個W-box 是由WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的，但PcWRKY1與自身的啟動子結(jié)合時PcWRKY1的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，表明PcWRKY1啟動子位點(diǎn)的W-box 被其他WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合激活轉(zhuǎn)錄［110］。基于生物信息學(xué)和植物啟動子的功能研究發(fā)現(xiàn)，許多WRKY 基因啟動子在統(tǒng)計上富集了W-box［111］。例如，在歐芹PcWRKY1中，存在多個W-box，其多個W-box 對轉(zhuǎn)錄有協(xié)同作用［108］；大麥HvWRKY38的轉(zhuǎn)錄需要2 個相鄰的W-box來有效綁定［112］；水稻2 個OsWRKY45-DBD分子交換β4-β5 鏈形成二聚體，包含2 個與W-box 相互作用的DNA 結(jié)合域［113］。WRKY 基因的多個W-box 表明自調(diào)節(jié)和交叉調(diào)節(jié)是WRKY 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的特征。

4.2 WRKY轉(zhuǎn)錄因子在蛋白水平的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

盡管WRKY 轉(zhuǎn)錄因子具有功能多樣性，而且?guī)缀跛蟹治龅腤RKY 蛋白都能識別W-box 序列，但是除了可以識別核心W-box 啟動子元件外，還存在其他機(jī)制可以實(shí)現(xiàn)WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的特異性調(diào)控。例如，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與多種蛋白相互作用，在信號和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮的調(diào)控作用。目前正在研究WRKY的信號網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的相互作用，除了前文提到的鈣調(diào)蛋白、MAP 激酶、去乙?；?，還有抗性R 蛋白和多種轉(zhuǎn)錄因子等，揭示W(wǎng)RKY 蛋白的調(diào)控功能網(wǎng)絡(luò)。

4.2.1 WRKY-MAPK 的相互作用 絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinase，MAPK）存在于所有真核生物中，是一個高度保守的模塊。在植物中，MAPK 通路參與調(diào)控發(fā)育、生長、程序性細(xì)胞死亡，以及對多種環(huán)境刺激的反應(yīng)［114］。MAPK 信號級聯(lián)通過多個磷酸化作用將上游受體與下游目標(biāo)連接起來，通過磷酸化放大和轉(zhuǎn)導(dǎo)膜受體感知到的病原體衍生信號，并將這些信號轉(zhuǎn)導(dǎo)改變相關(guān)的基因表達(dá)［115］。

MAPK 信號傳導(dǎo)途徑響應(yīng)植物的MTI（由識別微生物的保守分子MAMP 引發(fā)的免疫）或PTI 防御信號通路反應(yīng)，植物在免疫反應(yīng)中通過細(xì)胞內(nèi)的MAPK 級聯(lián)信號可以感知到MAMP 和PAMP，并刺激WRKY 轉(zhuǎn)錄因子的誘導(dǎo)［24］。在擬南芥中，轉(zhuǎn)錄因子AtWrky33在沒有病原體感染的情況下與MAP 激酶4（MPK4）形成MAMP 或PAMP 復(fù)合物。MAMP 或PAMP 復(fù)合物被病原體感染激活MEKK1-MKK1/2-MPK4 模塊，激活的MPK4 磷酸化MKS1，導(dǎo)致MPK4-MKS1-Wrky33 復(fù)合物的核離解，MKS1和AtWrky33被釋放，激活PAD3（合成抗菌復(fù)合物所需的酶）的表達(dá)，提高了擬南芥的抗病性［116］。隨后一項(xiàng)研究中，通過磷蛋白遷移轉(zhuǎn)移試驗(yàn)，表明AtWrky33可以被MPK3/MPK6 磷酸化，并促進(jìn)AtWrky33調(diào)控植物抗毒素的生物合成［117］。相反，WRKY34中MPK3/MPK6 磷酸化位點(diǎn)的缺失影響了WRKY34在體內(nèi)的功能［118］。OsWRKY53作為MPK3/MPK6 的負(fù)反饋調(diào)節(jié)器發(fā)揮作用，從而起到誘導(dǎo)防御的早期抑制作用［119］。由MPK3/MPK6、Wrky33、類AGD2 防御反應(yīng)蛋白1（ALD1）和哌啶酸（PiP）組成的正調(diào)控環(huán)存在于系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）誘導(dǎo)過程中，推測在PiP 生物合成水平上存在不同的SAR 激活途徑［120］。

4.2.2 WRKY-抗性R 蛋白的相互作用 植物防御信號通路的ETI 是基于抗性R 蛋白對效應(yīng)蛋白的識別而產(chǎn)生的特異性抗性。當(dāng)病原菌入侵植物后，植物分泌抗性R 蛋白識別病原菌效應(yīng)蛋白，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子和抗性R 蛋白互作形成蛋白復(fù)合體，解除對基本防御途徑的抑制作用［121］。在大麥對白粉病的免疫中，涉及ETI 免疫途徑，細(xì)胞質(zhì)中的抗病R 蛋白MLA 能夠識別白粉病效應(yīng)子AVR10，并在細(xì)胞核中與HvWRKY1和HvWRKY2結(jié)合，解除HvWRKY1/2對抗病的抑制作用，從而達(dá)到抗病目的［122］。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)存在一種典型的嵌合蛋白，如R 蛋白NBSLRR 和WRKY 轉(zhuǎn)錄因子嵌合而成的組合蛋白，其在免疫調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。例如，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與RRS1（一種NBS-LRR 蛋白）相互作用形成的嵌合蛋白AtWRKY52/RRS1，通過與細(xì)菌效應(yīng)體PopP2 的相互作用對細(xì)菌致病菌產(chǎn)生免疫［123-124］。擬南芥的RRS1-R、RPS4 蛋白與WRKY 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成受體復(fù)合物，該復(fù)合物可以識別細(xì)菌效應(yīng)因子AvrRps4 或PopP2，然后激活防御系統(tǒng)［121］。以上研究證明，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子通過與抗病R 蛋白結(jié)合，識別病原微生物產(chǎn)生的效應(yīng)蛋白，引發(fā)植物產(chǎn)生特異性的防衛(wèi)反應(yīng)，在ETI 免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

4.2.3 WRKY 與多種轉(zhuǎn)錄因子的相互作用 蛋白質(zhì)，尤其是調(diào)節(jié)蛋白，很少單獨(dú)起作用，通常情況下，它們在生理上或短暫或永久地相互作用，以承擔(dān)生命系統(tǒng)中的生物功能。例如，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子可以與多種轉(zhuǎn)錄因子相互作用，共同對植物的生長發(fā)育進(jìn)行調(diào)控。AtWRKY50可以和TGA2 或TGA5 作用與PR1 啟動子結(jié)合，與TGA 轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同激活PR1 的表達(dá)［99］。VviWRKY03通過與VviMYB14轉(zhuǎn)錄因子的組合效應(yīng)發(fā)揮作用，共同激活VviSTS29啟動子，調(diào)控白藜蘆醇生物合成［125］。除了可以與其他家族的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子還可以與自身家族中其他轉(zhuǎn)錄因子相互結(jié)合，發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)控作用。WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在結(jié)合DNA 前可以通過蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用形成二聚體或多聚體。例如，在病原菌感染過程中，OsWRKY45可與OsWRKY62形成異二聚體，該二聚體可激活DPF基因（二萜植物抗毒素生物合成基因）的轉(zhuǎn)錄［114］。同時，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還可以與自身形成二聚體發(fā)揮作用，例如，激活蛋白復(fù)合物WRKY60-60 引發(fā)干旱防御反應(yīng)的可能性較高，轉(zhuǎn)錄因子WRKY40 和蛋白復(fù)合物WRKY40-40 可以抑制干旱反應(yīng)［126］。

4.2.4 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子與其他蛋白的相互作用 除了前文提到的許多重要的調(diào)控蛋白，還存在其他一些蛋白與WRKY 轉(zhuǎn)錄因子相互作用發(fā)揮調(diào)控作用。VQ 蛋白是植物特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控的一種輔助因子。VQ 蛋白與WRKY 蛋白的相互作用可能導(dǎo)致構(gòu)象的改變或翻譯后的修飾，從而激活或抑制它們與靶基因啟動子的結(jié)合［127］。在甜瓜中，共有24 個WRKY基因與11 個VQ 家族基因共表達(dá)［128］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥VQ10 和WRKY8 可在植物細(xì)胞核中形成復(fù)合物。WRKY8 的中間區(qū)域與VQ10 之間的相互作用促進(jìn)了WRKY8 與DNA 結(jié)合的活性，并正向調(diào)節(jié)植物對灰霉病菌的抗性［129］。最近研究表明，OsWRKY45的N 端與細(xì)胞核中Pb1（穗芽抗性基因）蛋白的N 端螺旋結(jié)構(gòu)域（CC）相互作用對稻瘟菌產(chǎn)生抗性［114］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了大量與WRKY 相互作用的蛋白質(zhì)，未來在已鑒定出的WRKY 相互作用蛋白的基礎(chǔ)上，預(yù)計將會有更多的WRKY 相互作用蛋白被傳統(tǒng)的方法（如酵母雙雜交）和最近發(fā)展的方法（如高密度蛋白質(zhì)微陣列）所識別，并通過其相互作用蛋白在不同水平上的相互作用完善WRKY 轉(zhuǎn)錄因子復(fù)雜調(diào)控功能網(wǎng)絡(luò)。

5 展望

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控植物生長發(fā)育和衰老、非生物及生物脅迫中發(fā)揮著重要的作用。隨著高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等技術(shù)的發(fā)展，更深入地發(fā)掘WRKY 轉(zhuǎn)錄因子生物學(xué)功能，更詳細(xì)地確定WRKY 靶基因、WRKY 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)、WRKY 轉(zhuǎn)錄因子相互作用的蛋白，為探索WRKY 轉(zhuǎn)錄因子如何在啟動子上發(fā)揮信號協(xié)同和信號拮抗的作用奠定生物化學(xué)基礎(chǔ)，從而幫助人們深入了解WRKY 轉(zhuǎn)錄因子之間的串?dāng)_機(jī)制，但要詳細(xì)地明確這一機(jī)制還需要做更深入的研究。

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子在植物中是一個龐大的基因家族，WRKY 轉(zhuǎn)錄因子種類繁多，其在調(diào)節(jié)重要的生物學(xué)功能的分子機(jī)制和功能多樣性仍然還需進(jìn)一步的研究和證明，其中一個重要的研究思路是將越來越多的測序數(shù)據(jù)與蛋白質(zhì)-DNA 和蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的信息整合在WRKY 介導(dǎo)的調(diào)控重要生物學(xué)功能的過程中，建立一個全面的WRKY 信號和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在充分了解WRKY 在分子水平上的作用機(jī)制后，通過分子輔助育種和生物技術(shù)工具，培育出達(dá)到經(jīng)濟(jì)目的的優(yōu)良品種。