賈建磊 陳倩 靳繼鵬 袁贊 張利平

（1. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016；2. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070）

卵泡發(fā)生是母羊卵巢功能的基礎(chǔ)，包括受精過程中成熟卵母細胞的產(chǎn)生及維持母羊發(fā)情周期所需要的生殖激素的生成［1］。骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1B 基 因（Bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B）屬于轉(zhuǎn)化生長因子β 超家族，在許多組織和器官中通過調(diào)節(jié)細胞分化、增殖等生理過程對哺乳動物胚胎發(fā)育、胎兒出生后發(fā)育及激素釋放等起重要作用［2］。綿羊BMPR1B基因第8 外顯子（A746G）發(fā)生突變，突變體BB 個體卵巢部分功能喪失，使得此受體對配體GDF5和BMP4不敏感，從而高劑量的GDF5便抑制了孕胴的分泌，使排卵率增加，產(chǎn)仔數(shù)增加。近幾年來，大量研究表明，BMPR1B基因是Booroola Merino 羊、劍橋羊以及我國小尾寒羊和湖羊的多胎主效基因［3-4］。

BMPR1B 蛋白是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，在綿羊卵巢內(nèi)廣泛的表達（包括顆粒細胞、卵母細胞和卵泡膜細胞）［5］。BMPR1B具有同絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶受體結(jié)構(gòu)類似的信號傳遞機制，其主要功能是參與哺乳動物卵巢卵泡發(fā)育、動物的胚胎發(fā)育、骨組織形成、癌細胞的生長及大腦組織恢復(fù)等［8-10］。BMPR1B 蛋白包含3 部分：N 末端胞外配體結(jié)合域、單跨膜區(qū)域和C 末端絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域（GS）。BMPR1B基因編碼區(qū)第746 位點A →G 的突變，使受體胞內(nèi)激酶區(qū)第249 位氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榫彼幔蛔兒蟮腂MPR1B 蛋白與配體結(jié)合時，BMPR-IIB 可將BMPR1B 蛋白的GS 結(jié)構(gòu)域磷酸化，由于磷酸化的存在，增強了GS 結(jié)構(gòu)域?qū)τ贗 型受體信號傳導(dǎo)。同時，GS 結(jié)構(gòu)域中的磷酸化位點被II 型受體磷酸化，阻止I 型受體的磷酸化，導(dǎo)致下游級聯(lián)的激活并使部分受體失活。進而使配體GDF5 和BMP4 對類固醇生成的抑制作用減弱，改變SMADs的表達和磷酸化的狀態(tài)，促進FSH 誘導(dǎo)雌激素的合成，抑制孕酮的合成與分泌，結(jié)果使攜帶BB 突變體的母羊顆粒細胞加快分化，促使卵泡成熟速度加速，引起突變型母羊排卵數(shù)增加，被稱為FecB突變［11］。據(jù)報道，BMPR1B基因是綿羊高繁殖力的主效基因和控制綿羊繁殖性能遺傳的重要候選基因［8］。

隨著后基因組學(xué)時代的到來，蛋白質(zhì)組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)、生物信息學(xué)等方面的研究在功能基因和分子生物學(xué)上展現(xiàn)出前所未有的優(yōu)勢。目前為止，BMPR1B基因研究的主要集中在運用分子遺傳學(xué)和DNA 分子遺傳標(biāo)記（MAS）技術(shù)探索其多態(tài)性與綿羊產(chǎn)羔數(shù)關(guān)聯(lián)性，蛋白質(zhì)為生物功能的執(zhí)行者，為了探究BMPR1B及其相互作用蛋白的假定生物學(xué)功能，預(yù)測BMPR1B及其相互作用蛋白的作用通路，揭示了BMPR1B及其互作蛋白和綿羊產(chǎn)羔數(shù)的生物學(xué)功能聯(lián)系。本研究通過構(gòu)建BMPR1B基因真核表達體系并表征BMPR1B 蛋白質(zhì)，通過生物信息學(xué)分析并預(yù)測BMPR1B 蛋白及其相互作用蛋白在綿羊卵巢卵母細胞發(fā)育及排卵的作用通路。從蛋白質(zhì)角度進行BMPR1B對綿羊產(chǎn)羔性狀作用通路進行研究，旨為進一步研究了BMPR1B作為綿羊產(chǎn)羔性狀主要基因的生物學(xué)功能和特異性診斷試劑的開發(fā)奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所有程序均按照青海大學(xué)動物福利及動物倫理指南進行。2018 年3-5 月購自青海省海東市樂都金元牧業(yè)有限公司6 只成年健康經(jīng)產(chǎn)且有產(chǎn)羔記錄的小尾寒羊經(jīng)頸動脈放血屠宰后采集卵巢，剝離卵巢表面韌帶及脂肪后，無菌水沖洗立即置于液氮中帶回實驗室，-80℃保存。

1.2 方法

1.2.1BMPR1B基因的PCR 擴增及克隆 根據(jù)GenBank 上提交的BMPR1B全基因mRNA 的堿基序列（登錄號：NM_001009431.1），運用Primer Prim 5.0設(shè)計BMPR1B基因編碼區(qū)PCR 引物。F：5′-CCGCT CGAGAACATGCTTTTGCGAAGTTCAG-3′，R：5′-CGC GGATCCCAGAGCTTAATGTCCGGGACT-3′，擴增片段大?。? 509 bp，劃線部分為酶切位點（上游為XhoI，下游為BamH I）。

卵巢總RNA 提取后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，并進行PCR 擴增（擴增條件：94℃變性4 min；94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 110 s，35 個 循 環(huán)；72℃ 10 min）。PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用凝膠回收試劑盒將目的條帶進行凝膠回收。使用T4 DNA連接酶將純化的PCR 產(chǎn)物連接到pMD19-T 中，4℃過夜。使用熱休克方式在42℃將連接混合物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 細胞中90 s，然后冰上孵育。將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有50 mg/mL 氨芐青霉素的LB 瓊脂上過夜培養(yǎng)。挑取白色斑點，轉(zhuǎn)移至含有氨芐青霉素的LB 肉湯培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，進行菌液PCR，選擇陽性克隆，送上海生工生物工程公司測序。使用酚-氯仿將轉(zhuǎn)化產(chǎn)物pMD19-T-BMPR1B進行純化，將提取的pcDNA3.1a 真核表達質(zhì)粒載體和構(gòu)建的pMD19-T-BMPR1B克隆載體用限制性內(nèi)切酶BamH I 和XhoI 分別進行雙酶切（雙酶切體系：pcDNA3.1a 10 μL，pMD19-T-BMPR1B10 μL，BamH I 0.5 μL，XhoI 0.5 μL，10×K Buffer 2 μL，加無菌水至20 μL。37℃酶切4 h），2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，凝膠回收空載體和目的基因片段。用T4 連接酶連接目的基因片段和空載體（連接體系：T4 DNA 連接酶 1 μL，空載體1 μL，目的基因片段10 μL，連接Buffer 2.5 μL，加無菌水至25 μL，16℃過夜連接）。將25 μL 連接產(chǎn)物加入100 μL 感受態(tài)大腸桿菌中，冰浴30 min；42℃熱激45 s，再冰浴1 min；加入1 mL LB 培養(yǎng)基，37℃，170 r/min，搖床培養(yǎng)1 h，離心后取200 μL 菌液置于含有氨芐青霉素的LB 肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過夜培養(yǎng)，挑取白色斑點，菌液PCR 檢測陽性克隆，送生工生物工程公司（上海）進行測序。

1.2.2 重組靶基因的真核表達 使用Sf 9 細胞進行BMPR1B基因的蛋白質(zhì)體外表達。將10 mL Sf9 昆蟲細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的Grace’s 培養(yǎng)基中；取8×105個細胞加入六孔板中，室溫靜置20 min，使細胞貼壁；將20 μL 質(zhì)粒DNA（20 μg）稀釋于200 μL 胎牛血清Grace′s 培養(yǎng)基中，同時將100 μL 細胞轉(zhuǎn)染試劑（QIAGEN）稀釋于1 mL 胎牛血清Grace′s 培養(yǎng)基中，然后將稀釋的質(zhì)粒DNA 滴加到稀釋的細胞轉(zhuǎn)染試劑中并輕輕混合以避免沉淀，在室溫下放置20 min 后將混合液加入到Sf 9 細胞中，并在28℃下在水平振蕩器上以150 r/min 溫育直至細胞“病變”（CPE）超過80%（達到最大靶蛋白表達，72 h-96 h），分別收集上清液和沉淀物，分離并純化重組蛋白的純化。

1.2.3 單克隆抗體的制備 抗BMPR1B單克隆抗體的制備由美國GenScript 公司完成。用體外表達的BMPR1B 蛋白免疫6 只Bal b/c 小鼠，每次免疫7 d，加強免疫后用間接ELISA 方法檢測免血清效價，當(dāng)效價大于1∶64 000，采用電融合方法進行細胞融合后篩選針對靶蛋白呈陽性融合細胞的上清液，將陽性母克隆細胞擴大培養(yǎng)，進行亞克隆篩選后進行BMPR1B單克隆抗體的制備，采用Protein A/G 親和層析方法純化。

1.2.4 母羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白的鑒定 分別使用試劑盒免疫沉淀法和常規(guī)免疫沉淀法進行母羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白的鑒定，每種方法進行3 次重復(fù)。單獨表達空載體的Sf9 細胞用作陰性對照。對于試劑盒免疫沉淀法，按照說明是使用Mag sProtein A/G Co-Immunoprecipitation 試 劑 盒（BioCanal）富集母羊卵巢中的BMPR1B及其相互作用蛋白。對于常規(guī)免疫沉淀法，在4℃條件下，用500 μL 的0.5% NP40 裂解緩沖液裂解母羊卵巢30 min。將沉淀物在PBS 中洗滌2 次后4℃下用500 μL的1% NP40 裂解緩沖液裂解，并在水浴超聲波儀中2 級超聲處理4 個循環(huán)。將3 mg 總蛋白用于50 μg IgA 進行免疫沉淀。

1.2.5 蛋白質(zhì)鑒定和生物信息學(xué)分析 MALDI-TOF/TOF 結(jié)合Mascot 數(shù)據(jù)庫檢索鑒定目的蛋白。實驗組和對照組以上調(diào)和下調(diào)3.0 倍來鑒定差異蛋白質(zhì)（P＜0.05）。使用Uniprot 數(shù)據(jù)庫結(jié)合BLAST2GO 軟件進行差異蛋白質(zhì)的功能注釋和分類；使用KAAS平臺進行通路分析（http：// www.genome.jp/kegg/mapper.html），同時通過Fisher 精確檢驗進行通路富集統(tǒng)計（P＜0.05）；使用Cytoscape 3.0 軟件用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

2 結(jié)果

2.1 綿羊總RNA提取及PCR擴增

提取的小尾寒羊卵巢總RNA 結(jié)果見圖1，提取的小尾寒羊卵巢總RNA 明顯可見28S 與18S 兩條帶，提取效果較好，可直接用于反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄PCR 擴增BMPR1B基因編碼區(qū)序列，結(jié)果見圖2，擴增片段與目的片段大小一致（1 509 bp）且特異性良好，可直接進行下一步實驗。

2.2 重組BMPR1B基因的真核表達

通過XhoI 和BamH I 限制酶消化DNA 質(zhì)粒后結(jié)果表明，用XhoI 和BamH I 限制酶切割質(zhì)粒pcDNA3.1a-BMPR1B發(fā)現(xiàn)兩條帶，在瓊脂糖凝膠電泳上產(chǎn)生預(yù)期的DNA 片段（1 509 bp），而pMD19-T-NP 僅有一條帶（未發(fā)現(xiàn)預(yù)期的DNA 片段）。證實BMPR1B基因成功連接到真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1a中，插入的DNA 的大小與PCR 產(chǎn)物相同（圖3）。

圖1 綿羊卵巢總RNA 提取

圖2 綿羊BMPR-1B 基因PCR 結(jié)果

圖3 用Xho I 和BamH I 酶消化的DNA 質(zhì)粒瓊脂糖電泳檢測

2.3 抗BMPR1B單克隆抗體的產(chǎn)生

將重組真核質(zhì)粒pcDNA3.1a-BMPR1B轉(zhuǎn)染于Sf 9 昆蟲細胞，28℃培養(yǎng)，經(jīng)過3 次傳代后，細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變效應(yīng)（“CPE”），轉(zhuǎn)染pcDNA3.1a-BMPR1B重組質(zhì)粒24 h 后，結(jié)果顯示pcDNA3.1a-BMPR1B轉(zhuǎn)染組“CPE”熒光強度明顯高于對照組（圖4）。連續(xù)監(jiān)測7 d后，表明轉(zhuǎn)染后72 h-96 h之間“CPE”表達最高。

如圖5 所示，重組蛋白條帶主要出現(xiàn)在沉淀中，使用Ni-NTA Superflow 蛋白純化試劑盒純化重組蛋白（圖6，圖7）。當(dāng)OD450nm的陽性/陰性（P/N）大于或等于2.1 時，判斷血清抗體滴度。ELISA 結(jié)果顯示通過4 次免疫獲得高滴度（1∶32 000）的大鼠抗BMPR1B血清。

圖4 轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后的Sf 9 細胞（100×，左）和未轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒的Sf 9 細胞（100×，右）

圖5 體外表達蛋白的檢測

圖6 重組蛋白的純化

圖7 BMPR1B 抗體Western Blotting 檢測

2.4 綿羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白的鑒定

綿羊卵巢BMPR1B相互作用蛋白結(jié)果表明，BMPR1B抗體可以有效地和特異性地從母羊卵巢提取物中沉淀相互作用蛋白。使用SDS-PAGE 電泳分離沉淀蛋白質(zhì)（圖8），結(jié)果表明，載有BMPR1B-IP（樣品1-6）存在目標(biāo)蛋白條帶，空載體IP 不存在的目標(biāo)蛋白條帶（樣品7 和8）。

常規(guī)方法和試劑盒法免疫共沉淀后目的條帶進行膠內(nèi)酶解，并通過MALDI-TOF/TOF 質(zhì)譜進行鑒定，與Uniprot 數(shù)據(jù)庫中Ovis aries 或Bos taurus 物種數(shù)據(jù)進行匹配，使用手動閾值法和概率預(yù)測算法來計算63 種差異蛋白質(zhì)中與BMPR1B蛋白的關(guān)聯(lián)性，表明共產(chǎn)生34 種目的差異蛋白，其中24 種差異蛋白在實驗組（BMPR1B抗體CoIP）和對照組（空白抗體CoIP）中表達量差異3 倍或3 倍以上（表1）。

2.5 BMPR1B互作蛋白的驗證

圖8 BMPR1B 相互作用蛋白的鑒定

采用CoIP 試劑盒方法進行BMPR-1B 蛋白及相互作用蛋白免疫共沉淀，直接作用產(chǎn)物經(jīng)洗脫純化后用SDS-PAGE 凝膠電泳進行分離（圖9），共分離6 個條帶，經(jīng)生物質(zhì)譜鑒定與BMPR-IB 相互作用蛋白，共獲5 種蛋白，分別為GDF5、BMP2、BMP4、RhoD 和HSP10。采用免疫印跡法（Western Blotting）驗證BMPR-1B 蛋白與母羊卵巢提取物免疫共沉淀的復(fù)合蛋白（BMP2、BMP4、GDF5、GDF9、RhoD 和HSP10）的特異性相互作用（陽性和陰性驗證，圖10），表明所選候選蛋白與BMPR-1B 具有特異性相互作用。

表1 CoIP-MS 鑒定BMPR1B 相互作用蛋白表

圖9 BMPR1B 相互作用蛋白SDS-PAGE 電泳鑒定

圖10 BMPR1B 相互作用蛋白正反向Western Blotting驗證

2.6 GO及KEGG分析

為預(yù)測和鑒定與BMPR1B相互作用蛋白相關(guān)的生物學(xué)過程，我們通過基因本體論（Gene ontology，GO）方法對目的蛋白過程進行富集分析（圖11）。分析結(jié)果表明差異蛋白主要參與的“生物過程”包括繁殖和細胞質(zhì)翻譯過程，其中繁殖過程包含兩個方向：（1）與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)：如“TGF-β 信號通路”和“細胞因子-細胞因子受體相互作用”；（2）與發(fā)育相關(guān)：如“生物調(diào)節(jié)”，“細胞過程”，“生長”和“代謝過程”。細胞質(zhì)翻譯過程主要包括“下游處理”和“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”。另外富集分析結(jié)果還包括與試驗主題關(guān)聯(lián)性較小的生物過程，如“色素沉積”和“免疫系統(tǒng)過程”。

圖12 BMPR1B 及其互作蛋白GO 條目富集分析

圖11 BMPR1B 及其互作蛋白GO 分析

為進一步深入探討GO 分析所確定的生物過程，根據(jù)質(zhì)譜檢測結(jié)果通過Fisher 精確檢驗獲取顯著富集條目（P＜0.05），并將這些條目進行統(tǒng)計分析得到與綿羊繁殖性狀顯著相關(guān)聯(lián)的生物過程（圖12）。結(jié)果表明，BMPR1B及其互作蛋白主要在“正向生物調(diào)節(jié)”，“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”，“細胞過程”和“生殖過程”過程呈現(xiàn)富集狀態(tài)，其中“信號轉(zhuǎn)導(dǎo)”和“生殖過程”過程的鑒定主要是因為BMPR1B相互作用蛋白質(zhì)中存在TGF-β 家族蛋白質(zhì)，如BMPs 等，“正向生物調(diào)節(jié)”和“細胞過程”過程的鑒定主要是因為BMPR1B相互作用蛋白質(zhì)中存在起始和延伸因子，如BMP2 和BMP4。

使用KAAS 平臺鑒定與BMPR1B相互作用蛋白相關(guān)KEGG 途徑。結(jié)果表明，共鑒定到103 條代謝通路，運用Fisher 精確檢驗獲取28 條顯著富集通路（P＜0.05），按評分和重疊百分比排名的前6 個途徑分別為：“TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”，“卵巢類固醇生成通路”，“MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”，“細胞因子-細胞因子受體相互作用”，“Hippo 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路”和 “信號通路調(diào)節(jié)干細胞的多能性”（圖13-14）。KEGG 結(jié)果與GO 分析結(jié)果一致，進一步驗證BMPR1B相互作用蛋白所涉及的各種生物學(xué)功能。

2.7 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用通路預(yù)測分析

圖13 BMPR1B 及其互作蛋白KEGG 分析

圖14 BMPR1B 及其互作蛋白KEGG 富集分析

圖15 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

以試驗篩選的24 種目的蛋白為基礎(chǔ)，結(jié)合UniProt 數(shù)據(jù)庫和KEGG 圖譜，利用可視化軟件Cytoscape 軟件構(gòu)建出蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)（圖15）。結(jié)果表明，TGF-β 信號通路、卵巢類固醇生成通路和MAPK 信號通路構(gòu)成了一個復(fù)雜且緊密的交互網(wǎng)絡(luò)，同時許多其他的信號通路也基于此交互網(wǎng)絡(luò)與其他通路之間相互作用。基于互作結(jié)果，我們設(shè)計了BMPR1B調(diào)節(jié)綿羊卵母細胞的發(fā)育和排卵的代謝途徑途徑（圖16），在該預(yù)測途徑中最具交互作用的蛋白質(zhì)與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的，表明其在綿羊卵母細胞發(fā)育和排卵中具有重要作用。

3 討論

綿羊卵巢卵母細胞的成熟和排卵主要是受促性腺激素的調(diào)節(jié)，即卵泡刺激素（FSH）和促黃體激素（LH），促性腺激素激素（FSH 和LH）的釋放最初是由卵巢內(nèi)各種因素的控制［7］。研究表明，BMPR1B基因在綿羊卵巢中廣泛表達，包括顆粒細胞，卵母細胞，卵泡和黃體［12］。蛋白質(zhì)在核糖體內(nèi)合成后被轉(zhuǎn)運到特定的細胞器中參與細胞的各種生命活動，有效地發(fā)揮功能［13］。BMPR1B蛋白作為一種跨膜蛋白，介導(dǎo)細胞與外界之間的信號傳導(dǎo)，參與許多細胞功能（如構(gòu)成各種信號分子、激素和其他底物的受體）和細胞膜內(nèi)外物質(zhì)交換、能量和信號的傳遞等［14］。本研究使用CoIP-MS 技術(shù)來鑒定BMPR1B 蛋白及其互作蛋白并深入了解其與母羊卵巢中相互作用蛋白的調(diào)節(jié)通路。與文獻報道相同，Samds 是在綿羊產(chǎn)羔性狀代謝通路中最突出的蛋白質(zhì)家族。研究表明GDF5 和BMP4 是BMPR1B的天然配體，直接影響綿羊顆粒細胞分泌孕酮［15］；BMP2 作用于卵巢、子宮，通過抑制cAMP 的釋放以及孕酮、雌二醇和雄烯二酮激素的合成調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)，影響動物的繁殖性狀［16］；RhoD 蛋白在機體內(nèi)參與MAPK 信號通路，通過各種生物和理化刺激被激活后參與細胞分化、細胞因子的產(chǎn)生和細胞凋亡等多種細胞生理過程［17］；HSP10 通過直接或間接的方式參與細胞增殖凋亡、炎性免疫反應(yīng)、生殖等過程［18］。

圖16 綿羊卵母細胞發(fā)育和排卵過程預(yù)測通路圖［24，27，32］

BMPs 參與多種細胞活動，如增殖，分化，遷移和凋亡［19］。卵母細胞的減數(shù)分裂成熟需要將未成熟的卵母細胞轉(zhuǎn)化為完全成長的卵母細胞，這種卵母細胞存在于卵巢前卵泡中，進行受精準(zhǔn)備，這一過程受垂體促性腺激素與各種自分泌和旁分泌的BMP家族的基因相互作用調(diào)節(jié)［20］。BMP 信號通路是調(diào)控胚胎和細胞發(fā)育的重要信號通路之一，與其他信號途徑之間交互廣泛：如MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Hippo 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路 及Canonical Wnt/β-catenin通路等，同時BMP 信號通路還會對microRNA 基因表觀遺傳學(xué)、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運、卵母細胞減數(shù)分裂等有一定的調(diào)控［21-23］。

通過生物信息學(xué)分析結(jié)果和文獻報道，我們推斷目的蛋白主要通過細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Smads蛋白途徑、p38-MAPK 途徑）和細胞外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑（Erk-MAP 激酶途徑）對綿羊產(chǎn)羔性狀進行調(diào)控：（1）Smads 蛋白途徑［24-26］：原始卵泡的發(fā)育啟動不依賴于垂體促性腺激素，而受卵巢中自分泌/或旁分泌因子（細胞因子）的調(diào)控，BMPR1B 蛋白的183-205 個氨基酸之間存在跨膜區(qū)，為蘇氨酸-絲氨酸激酶受體，當(dāng)卵巢中的自分泌/或旁分泌因子（如胰島素樣生長因子IGFs）與此受體結(jié)合后細胞內(nèi)BMP 家族Ⅱ型受體通過磷酸化Ⅰ型受體的GS 區(qū)域，使胞質(zhì)內(nèi)一系列Smads 蛋白磷酸化，被激活的Smads 結(jié)合共用型的Co-Smad4 共同形成Smads 蛋白復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi)，促進DNA 的合成，進而通過募集轉(zhuǎn)錄輔激活因子或其它因子與BMP4和GDF5下游靶基因的啟動子相結(jié)合，調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)控卵泡的發(fā)生。Smads 蛋白家族目前已證實有8 種不同的Smads 蛋白，Smad6 和Smad7 由BMP-2 蛋白激活。（2） p38-MAPK 途徑［27-30］：p38-MAPK 是MAPK 家族重要的絲氨酸/酪氨酸激酶，可磷酸化絲氨酸/酪氨酸殘基，在炎癥、細胞應(yīng)激、凋亡、細胞周期和生長等多種生理過程中起重要作用。在動物的繁殖中，p38-MAPK 途徑磷酸化HSP 10，同時在LH 作用下，使卵泡細胞以及卵泡與卵母細胞間的縫隙連接中斷，導(dǎo)致卵母細胞中cAMP 水平下降，同時鈣離子結(jié)合鈣調(diào)蛋白通過p38-MAPK 調(diào)控途徑來將GnRH 傳遞信號作用到下游蛋白酪氨酸激酶受體結(jié)合位點，實現(xiàn)對動物繁殖性狀的調(diào)控。Ling 等［26］通過構(gòu)建小鼠HSP10基因siRNA 和超表達重組腺病毒載體及體外培養(yǎng)小鼠卵巢顆粒細胞發(fā)現(xiàn)，HSP10 參與卵巢顆粒細胞凋亡的調(diào)節(jié)，進而可能影響卵泡及卵母細胞的發(fā)育成熟。研究發(fā)現(xiàn)，HSP 10 在PCOS 患者間質(zhì)細胞中表達量降低，從而降低其抗凋亡作用，抑制卵泡的發(fā)育成熟，而在卵泡膜細胞中表達量升高，從而激活I(lǐng)GF-1通路，引起高雄激素血癥，抑制卵泡的發(fā)育成熟［31］。（3）Erk-MAP 激酶途徑［32］：由細胞外刺激因子（如生長分化因子、細胞因子、Rho 家族）作用，活化MEK，使其Tyr 和Thr 殘基磷酸化，從而激活ErK途徑，磷酸化下游底物。Rho 蛋白家族作為Erk-MAP 激酶途徑的關(guān)鍵分子，在胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮橋梁作用，RhoD 蛋白在機體內(nèi)參與MAPK 信號通路，通過各種生物和理化刺激被激活后參與細胞分化、細胞因子的產(chǎn)生和細胞凋亡等多種細胞生理過程［33］，當(dāng)RhoD 高表達時，可以快速激活MAPK 通路，升高底物c-fos 和c-jun 的磷酸化水平，與此同時，BMP 的下游傳導(dǎo)介質(zhì)Smad1 和Smad5 也出現(xiàn)表達增加，從而誘導(dǎo)卵母細胞的分化，調(diào)控卵泡的發(fā)生［34］。

4 結(jié)論

BMPR1B 蛋白與綿羊產(chǎn)羔性狀途徑中Smads 家族蛋白具有交互作用，在綿羊卵母細胞發(fā)育和排卵中具有重要作用。本試驗通過構(gòu)建BMPR1B基因真核表達體系并產(chǎn)生單克隆抗體，利用CoIP-MS 技術(shù)鑒定母羊卵巢提取物中與BMPR1B特異性相互作用的蛋白質(zhì)，構(gòu)建目的蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)，通過生物信息學(xué)分析并預(yù)測BMPR1B 蛋白及其相互作用蛋白在綿羊卵巢卵母細胞發(fā)育及排卵的作用通路。母羊卵巢提取物中23 種蛋白質(zhì)與BMPR1B 蛋白具有關(guān)聯(lián)性，其中6 種目的蛋白（BMP2、BMP4、GDF5、GDF9、RhoD 和HSP10） 與BMPR1B具 有特異性相互作用，通過生物信息學(xué)分析表明目的蛋白在TGF-β 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、卵巢類固醇生成通路和MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路構(gòu)成復(fù)雜且緊密的交互網(wǎng)絡(luò)，基于互作結(jié)果設(shè)計BMPR1B 蛋白調(diào)節(jié)綿羊卵母細胞的發(fā)育和排卵的代謝途徑。BMPR1B 蛋白與綿羊產(chǎn)羔性狀途徑中Smads 家族蛋白具有交互作用，在綿羊卵母細胞發(fā)育和排卵中具有重要作用。進一步研究BMPR1B基因的生物學(xué)功能和研究BMPR1B基因作為綿羊高繁主效基因的機理和分子調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。