耿慧君 鄒偉 崔惠敬 李曉宇 王麗麗 徐永平，3

（1. 大連理工大學生物工程學院，大連 116024；2. 遼寧師范大學生命科學學院，大連 116029；3. 教育部動物性食品安全保障技術工程研究中心，大連 116600）

噬菌體最早由Herelle［1-2］和Twort［3］同時發(fā)現，Herelle 將能夠殺滅細菌的病毒命名為噬菌體，并提出了噬菌體用于治療的思想［4］。而關于噬菌體的研究，通常被認為是現代分子生物學發(fā)展的基礎［5］。30 年代末至40 年代初，噬菌體在西醫(yī)中的治療應用廣泛傳播［6］，但隨著抗生素的大量使用，噬菌體治療在西方國家遭遇擱淺。然而，在前蘇聯(lián)、波蘭和捷克共和國，治療性噬菌體制劑的開發(fā)和使用從未停止過。這些國家積累的大量經驗表明，以噬菌體為基礎的藥物是有效而安全的。如今，這種抗菌藥物的大規(guī)模生產仍在俄羅斯和格魯吉亞持續(xù)進行［7-8］。在波蘭，弗羅茨瓦夫免疫學和實驗治療研究所的一個實驗中心，仍然有治療性噬菌體制劑的生產和使用［9］。

近年來，由于多重耐藥菌菌株的廣泛出現，使新抗生素在醫(yī)療實踐中的引入陷入了很大困境［10］。疾病控制中心警告提示，現在是“后抗生素時代”，如果現狀持續(xù)，有可能某一天我們會面臨無藥可用的境地［11］。噬菌體作為抗生素替代品的可行性正越來越引起人們的關注［12］，因此，噬菌體療法開始重新進入人們的視線［13］，同時噬菌體在人類多重耐藥菌性疾病治療的成功案例，也使醫(yī)療工作者深受鼓舞［14-15］。

然而，噬菌體治療的一個主要問題是其安全性的不確定。對于噬菌體安全性的確定，可以通過快速分析噬菌體基因組的方法來進行，即通過確定其基因組中有無毒力基因，溶源基因及毒力轉座子等致病因子來判斷。同時，相關動物實驗也可以為噬菌體的安全性提供一定的實驗佐證。

轉錄組學（Transcriptome），是指以特殊環(huán)境或特殊生理情況為依托，某個細胞、組織以及生物體里面所得 RNA 個數總數，包括信使 RNA（mRNA）、核糖體 RNA（rRNA）、轉運 RNA（tRNA）及其他的非編碼 RNA（Non- coding RNA）。在生命活動中，不可缺少的就是蛋白質，mRNA 是其主要編碼形式，所以從狹義上來說，轉錄組其實是特指細胞能夠通過轉錄實現的所有 mRNA 編碼。Illumina 公司的新一代測序儀（包括 Genome Analyzer 及其升級版HiSeq 2000）利用基于單分子簇的邊合成邊測序技術（Sequencing by synthesis，SBS）和專有的可逆終止化學反應，可以在短時間內獲得大量數據［16］。

本課題組在前期實驗研究中，獲得兩株裂解性噬菌體vBSM-A1 和 vBSP-A2［17］，均能特異性裂解金黃色葡萄球菌，但其作為一種外源物質運用于體內，是否會刺激機體產生中和抗體而降低其治療效果，甚至對機體的安全造成威脅，這是將其運用于臨床治療必須要解決的問題。本研究采用 Ilumina HiSeqTM 2000 新一代高通量測序技術，進行了金黃色葡萄球菌噬菌體在小鼠乳腺灌注的安全性分析，對噬菌體處理后的小鼠乳腺組織轉錄組進行測序，將測序得到的大量Unigene 進行 GO、和 KEGG 分類統(tǒng)計，給出功能注釋和Pathway 注釋，并進行了通路上調或者下調的相關分析。這些注釋信息的完成及相關分析將為噬菌體治療的安全性提供基礎數據，同時也為噬菌體治療中給藥的劑量及方式提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 所有動物實驗均按照國家實驗動物福利準則（中國科技部）進行，并經大連理工大學動物福利與研究倫理委員會（2019-040）批準。昆明小鼠購自大連醫(yī)科大學（大連）實驗動物中心。分籠飼養(yǎng)，正常飼喂。環(huán)境溫度控制在 20-26℃，12 h 循環(huán)光照。適應性飼養(yǎng)一周后，將母鼠與公鼠按 1∶1 的比例合籠過夜，將母鼠移出單獨飼養(yǎng)，讓其自然分娩，并哺乳一周左右進行實驗［18］。

1.1.2 主要試劑 TNF-α ELISA 檢測試劑盒（購自上海碧云天生物技術有限公司）；綿羊鮮血瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂、普通瓊脂培養(yǎng)基按常規(guī)方法配制；磷酸鹽緩沖液（PBS）；三溴乙醇（2.5%）。酵母提取物（Oxoid），胰蛋白胨（Oxoid），瓊脂粉（索萊寶公司），氯化鈉（天津天大化學試劑廠）。

1.1.3 主要器材 電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒），高速微量離心機（北京鼎昊源），高速冷凍離心機（長沙湘儀），潔凈工作臺（蘇州安泰），電熱鼓風干燥箱（上海一恒），恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城），立式壓力蒸汽滅菌器（上海博訊），移液器若干（Thermo/Dragon/ Eppendorf/Genex Beta 等），旋渦混合器（海門其林貝爾），JJ500 型電子天平（常熟雙杰）。

1.2 方法

1.2.1 噬菌體的分離與培養(yǎng) 兩株金黃色葡萄球菌噬菌體vBSM-A1（GenBank ID：MK_584893）和vBSP-A2（GenBank ID：MK_656892）［17］均分離自新疆農墾建設兵團134 牛場，分離樣本為牛場污水［19］。對噬菌體進行擴增，即37℃孵育4-6 h，待菌液變澄清且燒瓶下方出現絲絮狀白色沉淀即表明噬菌體富集完成［20］。之后，經CSCl 密度梯度超速離心純化噬菌體懸浮液［21］。通過平板計數確定樣品中PFU 的確切數量。將噬菌體VBSM-A1 和VBSP-A2 按照1∶1 體積配制cocktail。

1.2.2 實驗分組及噬菌體灌注 將泌乳后10 d 的雌鼠隨機分為3 組，每組8 只。實驗前2 h 將母鼠與乳鼠隔離，腹腔注射三溴乙醇（2.5%）以麻醉，劑量為0.015 mL/g［22］。將麻醉后的小鼠腹部向上固定于體視顯微鏡下，先用 75%酒精對母鼠第4 對乳腺及其周圍皮膚進行消毒。待皮毛潤濕，乳頭充分暴露后，左手持鑷子輕輕夾持固定住小鼠乳頭，右手持50 μL 鈍性微量進樣器，從小鼠第4 對乳房的乳頭口輕輕插入乳頭管內，然后將25 μL 噬菌體懸液或PBS 注入小鼠乳池內。注射完畢后，令小鼠平躺，防止乳腺導管口處感染，待自然蘇醒。每組小鼠給藥如表1（PFU：plaque forming unit，噬菌斑形成單位）。

表1 實驗分組及處理

1.2.3 樣品采集與處理 灌注24 h 后，將母鼠脫頸處死，對L4 和R4 乳腺進行無菌解剖。將左側乳腺組織剝離剪下一部分經液氮冷卻，干冰運輸至北京百邁客公司進行轉錄組檢測；另一部分放入 10%甲醛中固定，進行組織學切片制作；右側乳腺組織取下稱重后，按 1∶9（W/V）比例加入無菌的 PBS 研磨。

勻漿處理完畢后，吸取 100 μL 進行噬菌體數（PFU）的測定，剩余部分使用ELISA 試劑盒（Abbkine）進行細胞因子TNF-α 檢測［23］。

1.2.4 乳腺組織病理組織切片的制備 將切除的乳腺組織浸于Bouin 氏液中使其充分固定，將具有代表性的組織切片修剪后放入組織處理盒中，經沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、脫蠟后進行HE染色［24］，然后將其取出，晾干，制成中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察乳腺組織病理變化。每個樣本都檢查有無壞死、多形核嗜中性粒細胞炎癥（中性粒細胞）和淋巴細胞。

1.2.5 ELISA 方法檢測乳腺組織促炎因子水平 小鼠右側乳腺組織研磨勻漿處理后，轉移到離心管中，4℃、3 000 r/min 離心20 min，以去除脂肪組織。將上清液轉移到新的離心管中繼續(xù)4℃、3 000 r/min 離心10 min，收集上清液，通過 ELISA 試劑盒的方法檢測乳腺組織勻漿中的TNF-α 水平。

1.2.6 轉錄組測序 將乳腺組織在干冰條件下送往北京百邁客生物科技有限公司，實驗流程包括RNA樣品檢測，mRNA 富集、反轉錄，末端修復，3′加A，連接接頭，PCR 富集，文庫質控，上機測序（Illumina HiSeq 2500）。

1.2.7 數據統(tǒng)計分析 用 Prism 5.0 和 SPSS19.0 對試驗數據進行統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析（ANOVA）進行兩組數據間差異性分析，所得數據以 Means±SEM 表示。*P＜0.05 代表差異顯著，**P＜0.01 代表差異極顯著，P＞0.05 代表差異不顯著。

2 結果

2.1 小鼠外部形態(tài)觀察及乳腺組織病理學觀察

相比于正常組，噬菌體灌注組小鼠未呈現明顯的生理體征區(qū)別，噬菌體VBSM-A1 實驗組（T02）和噬菌體cocktail 實驗組（T03）小鼠狀態(tài)正常，表現為精神狀態(tài)良好，毛發(fā)略有輕度蓬松，行走正常。

H.E.染色結果顯示，健康對照組（T01）的小鼠乳腺腺泡結構完整，排列緊密，無炎性細胞浸潤；噬菌體VBSM-A1 實驗組（T02）和噬菌體cocktail實驗組（T03）乳腺腺泡排列較為整齊，局部視野有少量上皮細胞脫落，腺泡間隙及腺泡內有少量炎性浸潤（箭頭處），乳腺上皮細胞基本完好，未觀察到明顯的細胞壞死崩解（圖1）。

2.2 小鼠乳腺組織中炎癥因子TNF-α的測定

圖1 小鼠乳腺組織（HE 染色，標尺示100 μm）

由圖2 可知，與健康對照組（T01）相比，噬菌體實驗組的TNF-α 含量有所增加，而噬菌體cocktail實驗組（T03）略高于噬菌體VBSM-A1 實驗組（T02）。噬菌體cocktail 組與對照組相比差異顯著（P＜0.05）。由此可知，噬菌體實驗組會誘發(fā)機體一定的免疫應答，導致炎癥因子的上調。

圖2 噬菌體處理對TNF-α 水平的影響

2.3 小鼠乳腺組織中噬菌體數量的測定

經噬菌體灌注24 h 后，在小鼠乳腺組織檢測到噬菌體數量如圖3，其中，噬菌體VBSM-A1 實驗組（T02）組檢測到的噬菌斑平均值為3.98×103（103.6）PFU/gland，T03 組平均值為檢測到的噬菌斑2.56×104（104.4）PFU/gland。

圖3 噬菌體處理組小鼠乳腺組織噬菌體濃度（lg PFU/g）

2.4 轉錄組結果

2.4.1 轉錄組測序產量 小鼠乳腺組織3 組樣品的轉錄組測序，共獲得19.23 Gb Clean Data，各樣品Clean Data 均達到6.41 Gb，質量參數Q20 堿基百分比在97.44%以上，Q30 堿基百分比在92.82%及以上；過濾后不確定的堿基比例N 值為0.00；3 組樣品的GC 含量在48.26%-49.73%之間（表2）。

表2 轉錄組測序產量

2.4.2 比對效率統(tǒng)計 分別將各樣品的 Clean Reads與指定的參考基因組進行序列比對，比對效率從95.35%-95.47% 不等。Uniq Mapped Reads 的長度最長為39、135 和963，最短為37、689 和953，比對效率從89.14%-90.61%（表3）。

2.4.3 基因差異表達分析 表達具有時間和空間特異性，在兩個不同條件下，表達水平存在顯著差異的基因，稱之為差異表達基因。本實驗中，差異分組使用”T01_vs_T02_T03”的方式命名。根據兩（組）樣品之間表達水平的相對高低，差異表達基因可以劃分為上調基因（Up-regulated 基因）和下調基因（Down-regulated 基因）。

對篩選出的差異表達基因做層次聚類分析，將具有相同或相似表達行為的基因進行聚類（圖4）。檢測差異表達基因時，需要根據實際情況選取合適的差異表達分析軟件（edgeR［25］、DEseq［25］和EBseq［27］）。對于有生物學重復的樣品的差異表達分析，采用DEseq 軟件進行差異篩選，將差異倍數（Fold Change）≥2，且 FDR ＜ 0.05 作為篩選標準。Fold Change 表示兩樣品（組）間表達量的比值，P為差異表達的顯著性，對顯著性P值進行校正會得到錯誤發(fā)現率FDR 值，控制FDR 小于一定閾值可以降低差異表達基因的假陽性率。不同的項目可根據項目的特異情況選擇合適的指標進行差異篩選。

表3 比對效率統(tǒng)計

2.4.4 差異表達基因GO 分類 GO 數據庫由 GO 組織（Gene ontology consortium）構建于 2000 年，旨在建立基因及其產物知識的標準詞匯體系，適用于各個物種。GO 注釋系統(tǒng)包含3 個主要分支，即生物學過程（Biological process）、細胞組分（Cellular component）和分子功能（Molecular function）。

樣品間差異表達基因GO 分類統(tǒng)計結果見圖5，橫坐標為GO 分類，縱坐標左邊為基因數目所占百分比，右邊為基因數目。此圖展示的是在差異表達基因背景和全部基因背景下GO 各二級功能的基因富集情況，體現兩個背景下各二級功能的地位，具有明顯比例差異的二級功能說明差異表達基因與全部基因的富集趨勢不同，可以重點分析此功能是否與差異相關。

在生物學過程（Biological process）分支中，相比于PBS 對照組（T01），噬菌體實驗組（T02、T03）在細胞凋亡（Cell killing），細胞聚集（Cell aggregation）和脫毒過程（Detoxification）均呈現校高的差異基因表達數目，尤其是細胞聚集（Cell aggregation），噬菌體實驗組（T02、T03）差異基因表達量比PBS 對照組（T01）高2 倍還多；突觸前進程（Presynaptic process involved in chemical synaptic transmission）則呈現相反的變化趨勢，PBS 對照組差異基因表達量明顯高于噬菌體實驗組（T02、T03）。

在細胞組分（Cellular component）分支中，相比PBS 對照組（T01），噬菌體實驗組（T02、T03）在擬核（Nucleoid）中呈現更多的基因值。有趣的是，在病毒粒子（Virion）和病毒粒子組分（Virion part）這兩個基因區(qū)域呈現完全相反的結果，在其他有機體（Other organism）及其他有機體組分（Other organism part）只檢測到噬菌體實驗組（T02、T03）的差異基因表達，其表達量約為200。

在分子功能（Molecular function）分支中，相比于PBS 對照組（T01），噬菌體實驗組（T02、T03）在抗氧化活性（Antioxidant activity），化學誘導物活性（Chemoattractant activity）相關的差異基因表達呈現出更多的基因數和基因百分數；而在翻譯調控活性（Translation regulator activity）相關的差異表達基因，則呈現出相反的趨勢，即對照組（T01）呈現更高的基因含量。

2.4.5 差異表達基因KEGG 富集分析 作為有關Pathway 的主要公共數據庫［28］，KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）提供的整合代謝途徑（Pathway）查詢，包括碳水化合物、核苷、氨基酸等的代謝及有機物的生物降解，不僅提供了所有可能的代謝途徑，而且對催化各步反應的酶進行了全面的注解，包含有氨基酸序列、PDB 庫的鏈接等等，是進行生物體內代謝分析、代謝網絡研究的強有力工具。采用R 包clusterProfiler 對差異基因分別進行KEGG 通路富集分析。富集分析采用超幾何檢驗方法來尋找與整個基因組背景相比顯著富集的KEGG 通路。

圖6 中每一個行代表一個KEGG 通路。橫坐標為富集因子，表示差異基因中注釋到該通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值。富集因子越大，表示差異表達基因在該通路中的富集水平越顯著。點的顏色代表q value，點的大小代表注釋在該通路中差異基因的數目，點的形狀代表該通路中差異基因的類型（如只包含上調基因，只包含下調基因，同時包含上下調基因）。

圖4 基因差異表達分析

圖5 樣品間差異表達基因GO 分類統(tǒng)計圖

相比對照組（T01），噬菌體灌注組（T02、T03）中，TNF 信號通路富集顯著，富集因子接近4.5，只包含下調基因；NF -κB 信號通路富集較為顯著，富集因子接近4.0，同時包含上下調基因；HTLV-I 感染富集因子約為2.5，呈現出最多的差異基因數目，＞30，同時包含上下調基因。

3 討論

近年來，相關致病菌的抗生素耐藥性日趨嚴重，這些多重耐藥性菌株已對現代醫(yī)療界構成了極大威脅［29-30］。而在畜牧獸醫(yī)與食品工業(yè)領域，亦面臨相同的形勢。這意味著研發(fā)一種經濟、有效的抗生素替代物尤為迫切。噬菌體作抗生素替代物或食品抗菌劑使用具有諸多優(yōu)勢，在俄羅斯、格魯吉亞和波蘭等國均有長期且持續(xù)的使用歷史，其安全性也成為現在研究的重要方向。

圖6 差異表達基因KEGG 富集分析

噬菌體的發(fā)現者Felix d’Herelle 最早證實了噬菌體能夠在正常人體微生物群中存在。他在人和動物糞便中發(fā)現了腸道噬菌體［2］。噬菌體和細菌在同一生態(tài)系統(tǒng)中的共存是自然界中常見的現象［30］，并且在真核生物、細菌和古細菌分離之前就已經存在了［29］。這些結論表明，在某種程度上，噬菌體是能夠和人類安全共存的。

本研究采用Illumina HiSeq 高通量測序技術對灌注金黃色葡萄球菌噬菌體的小鼠轉錄組進行測序，并進行了基因差異表達分析、差異表達基因GO分類和差異表達基因KEGG 富集分析。轉錄組測序產量和比對效率統(tǒng)計顯示，共獲得19.23 Gb Clean Data，Q30 堿基百分比在92.82%及以上；各樣品的Clean Reads 比對效率從 95.35%-95.47% 不等。這些數據均表明轉錄組測序結果真實有效，符合實驗分析的標準。

在差異表達基因GO 分類分析中顯示，噬菌體實驗組（T02、T03）在細胞凋亡（Cell killing），細胞聚集（Cell aggregation）和脫毒過程（Detoxification）均呈現校高的差異基因表達數目；在擬核（Nucleoid）中呈現更多的基因值，而在病毒粒子（Virion）和病毒粒子組分（Virion part）這兩個基因區(qū)域呈現完全相反的結果；在抗氧化活性（Antioxidant activity），化學誘導物活性（Chemoattractant activity）相關的差異基因表達呈現出更多的基因數和基因百分數。在差異表達基因KEGG 富集分析中顯示，噬菌體灌注組（T02&T03）中，TNF 信號通路富集顯著，富集因子接近4.5，只包含下調基因；NF -κB 信號通路富集較為顯著，富集因子接近4.0，同時包含上下調基因。

這些結果表明，在噬菌體灌注之后，小鼠體內會有一些相關的免疫反應和炎癥應答，本實驗中的HE 染色和TNF-α 的測定也得到了相應的結果。噬菌體在乳腺內的PFU 檢測結果表明，24 h 后噬菌體的數量會有較為明顯的下降，其PFU 從107PFU/gland下降到103-4PFU/gland。相比于正常組，噬菌體灌注組小鼠未呈現明顯的生理體征區(qū)別，其狀態(tài)正常，表現為精神狀態(tài)良好，毛發(fā)略有輕度蓬松，行走正常。綜上所述，盡管噬菌體處理后會有一定的炎癥因子上調，但其HE 染色和小鼠生理體態(tài)以及其他相關數據均表明，炎癥趨勢輕微，且噬菌體數量會隨著時間推移下降，并不會影響小鼠的正常生命體征。

Koen 等［31］在實驗中發(fā)現，相比于攻菌后的噬菌體雞尾酒治療組，單一噬菌體雞尾酒灌注組小鼠（安全對照組）呈現出較低的PFU 值，其HE 染色結果也更接近于正常小鼠。這也說明在正常小鼠乳腺內，噬菌體數量會有自然的下降，其下降程度與時間成正比。Oliveira 等［32］研究發(fā)現，將3 種裂解性噬菌體-F78E（肌尾噬菌體）、phi F258E（長尾噬菌體）和 phi F61E（肌尾噬菌體）分別以口服、鼻噴霧和腹腔注射的方式給藥（108PFU/mL），3 h 后，噬菌體在脾臟、肝臟和肺部均能夠檢測到。它們在脾臟中的濃度分別為3×104、3.5×103和1×102PFU/mL。在接下來的幾個小時內，噬菌體濃度迅速下降，24 h 后，噬菌體幾乎被清除。

同時，20 世紀20 年代至30 年代的早期研究［33］也表明噬菌體在血液中能夠被迅速清除。腹腔注射噬菌體［34］的小鼠血噬菌體滴度（高達1010PFU/mL）迅速升高，12 h 后，滴度下降約103倍，并繼續(xù)呈軟曲線下降，下降趨勢因不同類型噬菌體而異。一些噬菌體可以被血液中的紅細胞和白細胞吸收［35］。噬菌體顆粒在肝臟會很快失活［32，36］，在脾臟中存活的時間稍長［32，37］，噬菌體抗體的產生會影響噬菌體治療的效果。此外，從未接受過藥物治療的患者也有一定程度的噬菌體抗體［38］。然而，現有的數據表明，這種抗體的存在與治療結果的相關性很弱［39］。這些研究結果與本實驗結果相似，隨著時間的推移，噬菌體在實驗動物體內會有下調乃至失活的趨勢。

導致噬菌體失活的原因目前尚無定論，戈爾斯基教授領導的一個研究小組最近證實了某些噬菌體顆粒對人類和動物免疫系統(tǒng)的直接影響。結果表明，噬菌體顆粒能降低由細菌或內毒素誘導的中性粒細胞產生的活性氧，抑制T 細胞的活化，從而促進移植耐受。這些噬菌體還具有一定程度的抗腫瘤作用［40-41］。研究指出，潰瘍性腸黏膜上噬菌體顆粒的濃度顯著增加，噬菌體的免疫活性在克羅恩病的病理過程中起一定作用［42］。

另外有人認為，一些噬菌體可以攜帶“二級”粘附蛋白，這些黏附蛋白與觸發(fā)DNA 注入的裝置并沒有直接聯(lián)系。許多假定的二級粘連蛋白含有免疫球蛋白樣結構域，這些結構域暴露在噬菌體頭部表面、尾部可收縮的覆蓋物或噬菌體衣殼的末端［43］。在實驗室條件下，這些結構是否能影響噬菌體生長的數據仍然缺失，但在諸如動物體內，乳腺或者腸道中的生態(tài)情況下，它們可能具有很大的作用［44］。這些粘附蛋白，可以通過增加噬菌體粒子與感受性宿主細胞相遇后可逆吸收的可能性來實現，從而增加噬菌體的感染率。一方面可以提高噬菌體對宿主菌的侵染效率，從而快速的殺滅病原菌［45］，另一方面，也可能會引發(fā)機體一定的免疫反應，在開發(fā)治療性噬菌體制劑時，應縱橫考慮這些想法，并找到一個平衡點［46］。然而，到目前為止，還沒有實驗數據來描述天然病毒與免疫系統(tǒng)的相互作用。

迄今為止，噬菌體治療的嚴重不良事件還沒有任何報道，這證明了噬菌體治療可以預防耐藥細菌感染［47］。與抗生素相反，噬菌體是自我給藥和自我限制的，因而耐藥性的形成通常較低［48-49］。目前為止，在超過一百年的時間里，沒有報告過由噬菌體治療引起的嚴重不良事件［50］。然而，仍然需要制定或采取措施來減輕潛在的安全問題。其中一個挑戰(zhàn)是噬菌體制劑中必然含有一定量的內毒素或其他有害的細菌成分。而這個問題可以通過使用高純度的噬菌體制劑來解決［49］。另一個安全問題是細菌溶解可能導致內毒素快速釋放［51］。為避免這種情況發(fā)生，可以通過基因工程設計非復制噬菌體，使宿主細菌失活而不溶解它們［52］。然而，最近的一項研究發(fā)現，噬菌體比β-內酰胺類抗生素能夠更快地殺死致病性大腸桿菌，同時，噬菌體釋放的內毒素也更少［53］。

對于噬菌體的使用，常見的反對意見之一，是可能出現嚴重的不良免疫反應（如過敏反應）。但目前的文獻中并無描述，使用“噬菌體”和“過敏反應”這兩個術語搜索出版物數據庫及其變化，并沒有發(fā)現任何一個病例報告。從大量關于噬菌體使用的歷史報告來看，無論給藥途徑如何，噬菌體治療后的過敏反應似乎并不常見［54］?！笆删w”在某些情況下是一種安全有效的抗生素替代品［55］。

4 結論

結合本實驗結果，鑒于噬菌體治療會導致一些輕微的炎癥反應，以及噬菌體自身數量的下調，可以考慮使用噬菌體和抗生素聯(lián)合使用的治療方案。這樣不但可以減緩噬菌體可能導致的不良反應，而且還能夠降低抗生素的最小使用劑量，從而達到更好的治療效果。有報道稱噬菌體在提高多重耐藥細菌對抗生素的敏感性方面有著顯著的效果［56］。Chaudhry 等［57］的一項研究，報道了噬菌體和抗生素治療銅綠假單胞菌生物膜的不同策略，同時證明這兩種試劑的給藥順序對生物膜根除的結果產生了嚴重影響。由此可見，利用噬菌體增強抗生素作用的價值是不可低估的。同時，噬菌體的生長優(yōu)化和純化也是亟待解決的問題［7］。

如果噬菌體的繁殖率高于其擴散和失活的速率，那么噬菌體將能夠有效抑制宿主菌的生長，這被稱為噬菌體主動治療。而在另外一些案例中，為了抑制細菌生長，必須通過人工多次引入大量噬菌體，以保持噬菌體的濃度。例如，在慢性病治療期間，這種情況被稱為噬菌體被動治療。在治療穩(wěn)定的慢性感染過程中，將主動和被動噬菌體療法進行結合是最可能的方案。這種治療需要更長的時間，也能夠更大概率地治愈患者［58-59］。

目前國內外在噬菌體治療方面的研究已經如火如荼，但采用轉錄組測序技術研究噬菌體對動物的影響極少。本實驗首次采用轉錄組測序技術，對噬菌體灌注后的小鼠乳腺組織進行安全性分析，發(fā)現實驗后小鼠會有輕微炎癥反應，但其生命體征未受影響。在未來的實驗中，可以考慮抗生素和噬菌體的聯(lián)合使用，以期達到更好的治療效果。本實驗為噬菌體安全性治療和噬菌體制劑的發(fā)展提供了重要的實驗依據，為噬菌體替代或者輔助抗生素的使用奠定了實驗基礎。