莫顯蘭 史列琴 陸秋利 王小敏 任振新

（玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院，玉林 537000）

果實(shí)成熟軟化一直是采后生物學(xué)領(lǐng)域備受關(guān)注的熱點(diǎn)科學(xué)問題，其包括細(xì)胞壁的降解、內(nèi)含物的變化、呼吸速率以及其他的代謝變化等非常復(fù)雜的發(fā)育調(diào)控過程。目前，對果實(shí)成熟軟化的機(jī)制仍不清楚。番茄（Solanum lycopersicum）在我國南北方的種植面積廣泛，是茄科作物（番茄、辣椒、茄子、馬鈴薯等）的重要代表作物，屬于典型的呼吸躍變型果實(shí)，也是研究果實(shí)發(fā)育、成熟調(diào)控及產(chǎn)后果實(shí)品質(zhì)的理想模式作物［1］。開展番茄果實(shí)成熟軟化的分子機(jī)理研究，找出關(guān)鍵的影響因子，并對其作用及分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，不僅豐富了果實(shí)采后軟化理論研究，而且可為通過生物技術(shù)手段來改善果實(shí)軟化提供技術(shù)手段，具有潛在的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值［2］。

MicroRNAs（miRNAs）幾乎參與所有的生物學(xué)過程［3-7］。目前，與果實(shí)成熟軟化相關(guān)的大量miRNAs 被 發(fā) 現(xiàn)［8-9］。如：番 茄miR161、miR173、miR393、miR397、miR398和miR414只有在綠熟期果實(shí)中表達(dá)量增加；miR159表達(dá)量在破色期果實(shí)中下降，到紅熟期增加；miR156和miR394在成熟期表達(dá)量下降，miR396在破色期表達(dá)量明顯增加；miR828和miR1917表達(dá)在紅熟期下降［8］。miRNAs不僅在果實(shí)成熟各個(gè)時(shí)期表現(xiàn)出差異表達(dá)模式，而且其中一些miRNAs 的表達(dá)受到乙烯調(diào)控，如：番茄miR394、miR414和miR1917的表達(dá)受乙烯負(fù)調(diào)控，而miR156、miR159、miR396、miR482和miRZ6027則 為 乙 烯 誘 導(dǎo) 表 達(dá)［8-9］。香 蕉miR156、miR162、miR171、miR393和miR172等受乙烯誘導(dǎo)表達(dá)［10］。上述結(jié)果預(yù)示miRNAs 參與果實(shí)成熟過程，但相關(guān)的功能研究卻鮮有報(bào)道。

反向遺傳學(xué)主要通過超表達(dá)或者沉默表達(dá)方法實(shí)現(xiàn)對基因功能的研究。利用超表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，從而提高miRNA 在體內(nèi)的表達(dá)量的方法是一種已被廣泛應(yīng)用于植物miRNA 功能研究的成熟方法［11］。由于miRNA 小，對miRNA 功能沉默的方法一直不能取得令人滿意的效果。近年來，短串聯(lián)靶標(biāo)模擬技術(shù)（STTM）的發(fā)現(xiàn)揭示了一種全新的miRNA 沉默調(diào)控機(jī)制，并在miRNA 的功能研究中得到應(yīng)用。STTM 是在靶標(biāo)模擬技術(shù)（Target mimic，TM）基礎(chǔ)上開發(fā)的一種miRNA 沉默技術(shù)。目前，STTM 技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于多個(gè)番茄miRNA 功能的研究中，被證明是一種高效的番茄miRNA 沉默技術(shù)［12-13］，但該方法尚未在番茄果實(shí)成熟和軟化相關(guān)研究中得到應(yīng)用。

本研究利用生物信息學(xué)分析，分離鑒定出SlmiR482前體序列并設(shè)計(jì)寡核苷酸片段，構(gòu)建STTM載體，從而為深入闡明Sl-miR482在番茄果實(shí)成熟軟化中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體 大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105、植物表達(dá)載體pcamiba-35S 來源于玉林師范學(xué)院分子生物實(shí)驗(yàn)室，克隆載體PEASY- Blunt Clong Kit 購于TRANSGENE 公司。Heinz 和LA1589番茄材料種植于玉林師范學(xué)院溫室中。

1.1.2 試驗(yàn)試劑及試劑盒 DNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶（KpnⅠ、Bamh Ⅰ）、T4 連接酶購于Thermo Fisher Scientific 公司。質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購于Omega 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 定量PCR 采用莖環(huán)反轉(zhuǎn)錄法合成成熟miRNA 的cDNA，在 成 熟miRNA 的3′ 端 設(shè) 計(jì) 一條50 nt 可自行折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的特異性RT 引物，miR482a_SLR：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGA GGTATTCGCACTGGATACGACTAGGAA-3′（下 劃 線表示與成熟miRNA3′端反相互補(bǔ)的6 個(gè)堿基）。設(shè)計(jì)定量PCR 引物（miR482a_SLR_F：5′-GCGGCGTTccaaTTccacccaT-3′，SLR_R：5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′），以cDNA 為模板，應(yīng)用SYBR 染料法，對Sl-miR482采用實(shí)時(shí)定量檢測。以U6為內(nèi)參，U6RT 引物及定量PCR 引物序列如下：Universal Reverseprimer：5′-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3′，U6-F：5′-AGACAATTGATGCGTGCGATC-3′，U6-R：5′-GCTGCAACTGCACTACCAAC-3′。 按 照2-ΔΔCt方法計(jì)算基因表達(dá)量。

1.2.2Sl-miR482啟動子分析從https：//www.solgenomics.net/網(wǎng)站中比對出Sl-miR482序列，選取轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp 核苷酸序列，利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）對該區(qū)域存在的順式作用元件進(jìn)行分析。

1.2.3 靶基因預(yù)測 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站（http：//plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/）對Sl-miR482靶基因進(jìn)行預(yù)測。利用DNAMAN 軟件進(jìn)行靶基因同源家族氨基酸序列比對。

1.2.4STTM-482載體的構(gòu)建 根據(jù)Sl-miR482序列，分別設(shè)計(jì)合成寡核苷酸序列（表1），以Linker-STTM 為模板，進(jìn)行STTM-482的克隆。進(jìn)而構(gòu)建中間載體pEasy-STTM-482。然后以含有35S 啟動子的pCambia-1300-35S 載體作為整體支架，使用KpnⅠ和Bamh Ⅰ雙 酶 切pEasy-STTM-482 和pCambia-1300-35S，分別回收目的片段，用T4 連接酶將目的基因∶載體=3∶1 進(jìn)行連接，經(jīng)生工生物（上海）有限公司測序驗(yàn)證正確，命名為pCambia-35SSTTM-482。

表1 寡核苷酸序列

2 結(jié)果

2.1 miR482在番茄果實(shí)成熟階段的表達(dá)分析

利用Sl-miR482特異性引物對番茄Heinz 和LA1589 果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期中Sl-miR482表達(dá)量進(jìn)行檢測，定量PCR 結(jié)果表明，盡管Heinz 和LA1589番茄果實(shí)在成熟期長短存在差異，但Sl-miR482的表達(dá)量在2 種番茄開花期都逐漸上升，到未成熟綠期達(dá)到最高峰，隨后急劇下降（圖1）。植物基因的時(shí)空特異性表達(dá)模式，往往預(yù)示該基因在特殊的組織或時(shí)間內(nèi)發(fā)揮作用。因此，Sl-miR482在果實(shí)成熟不同時(shí)期的動態(tài)表達(dá)模式，表明它可能參與調(diào)節(jié)果實(shí)成熟過程，其具體作用及機(jī)制有待于進(jìn)一步闡明。

2.2 miR482的靶基因預(yù)測及靶基因同源序列分析

圖1 Sl-miR482 分別在Heinz 和LA1589 番茄果實(shí)發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)模式

利用靶基因預(yù)測網(wǎng)站（http：//plantgrn.noble.org/v1_psRNATarget/）對Sl-miR482靶基因進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明（圖2-A），番茄Solyc11g008140（一種果膠裂解酶基因家族成員，將其命名為Sl-PL13）為其潛在的靶基因。進(jìn)一步定量PCR 結(jié)果（圖2-B）表明，在番茄果實(shí)發(fā)育不同時(shí)期，Sl-PL13的表達(dá)量在綠熟期后逐漸升高，在破色期達(dá)到最高值。此外，在番茄果實(shí)成熟階段，Sl-PL13與Sl-miR482的表達(dá)模式呈現(xiàn)一定的此消彼長的反比關(guān)系。上述結(jié)果預(yù)示Sl-miR482可能通過調(diào)節(jié)Sl-PL13的表達(dá)量從而實(shí)現(xiàn)對番茄果實(shí)成熟的控制。

圖2 Sl-miR482 靶基因預(yù)測及靶基因表達(dá)分析

Sl-PL（Solyc03g111690）是一種調(diào)節(jié)番茄果實(shí)軟化的果膠裂解酶基因［2，14］。蛋白序列比對結(jié)果表明，Sl-PL13 與Sl-PL 蛋白序列同源性為55.88%（圖3）。根據(jù)Sl-PL 蛋白序列信息，本研究利用生物信息學(xué)分析從番茄基因組數(shù)據(jù)庫（http：//solgenomics.net/）中篩選出10 種番茄果膠裂解酶基因家族成員，包括Sl-PL 和Sl-PL13 在內(nèi)的所有家族成員都具有3個(gè)序列保守的功能區(qū)Motif Ⅰ、Motif Ⅱ、Motif Ⅲ（圖4），表明Sl-miR482可能通過果膠裂解酶的活性參與對番茄果實(shí)成熟軟化的調(diào)節(jié)。

2.3 miR482啟動子分析

選擇Sl-miR482轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游2 000 bp 的DNA 序列，通過PlantCARE 數(shù)據(jù)庫，對該區(qū)域進(jìn)行基因啟動子元件分析。結(jié)果（圖5）表明，SlmiR482啟動子中有與過程成熟相關(guān)的應(yīng)答元件［15］，包括：6 個(gè)乙烯應(yīng)答原件（ERE）、1 個(gè)茉莉酸甲酯（TGACG-motif）和3 個(gè)水楊酸等應(yīng)答原件（TCAelement），表明Sl-miR482在果實(shí)成熟過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。

2.4 植物沉默表達(dá)載體的構(gòu)建

通過接頭序列l(wèi)inker-STTM 將寡核苷酸片段F-STTM482 及R-STTM482 連接，得到131 bp 長度的STTM-482 序列（圖6-A），回收片段，連入pEasyblunt 載體，經(jīng)菌落PCR 及測序驗(yàn)證后，pEasyblunt-STTM 載體構(gòu)建成功（圖6-B 和圖6-C）。利用KpnⅠ和Bamh Ⅰ酶切pCambia-35S 及重組質(zhì)粒pEasy-blunt-STTM，連接后轉(zhuǎn)化，通過菌落PCR 驗(yàn)證及酶切驗(yàn)證，pCambia-35S-STTM-482 植物表達(dá)載體構(gòu)建成功（圖7-8）。

3 討論

圖3 番茄中SlPL13 與SlPL 氨基酸序列比對

圖4 番茄中SlPL 家族成員氨基酸序列比對結(jié)果

圖5 Sl-miR482 啟動子順式作用元件分析

圖6 pEasy-blunt-STTM 重組子菌落PCR 鑒定及測序結(jié)果

圖7 重組子pCambia-35S-STTM-482 的菌落PCR 和酶切驗(yàn)證

圖8 STTM-482 沉默載體的結(jié)構(gòu)示意圖

豌豆miR482能夠明顯增加豌豆結(jié)節(jié)數(shù)目［16］；棉花miR482能調(diào)節(jié)靶基因NBS-LRR的表達(dá)影響真菌病原菌感染棉花［17］。2012 年，Zuo 等［8］發(fā)現(xiàn)SlmiR482在番茄果實(shí)成熟軟化過程中顯示出差異的表達(dá)模式，而且Sl-miR482的表達(dá)受到乙烯的調(diào)節(jié)。上述結(jié)果表明，miR482不僅參與調(diào)控植物生長發(fā)育、抗病性等過程，而且在果實(shí)成熟軟化過程也發(fā)揮著重要的作用。此外，茉莉酸甲酯和水楊酸都是果實(shí)成熟過程中重要的植物激素，作為應(yīng)激激素廣泛參與調(diào)控植物生長發(fā)育過程，與果實(shí)的成熟衰老有著密切的聯(lián)系［15］。Sl-miR482啟動子中存在茉莉酸甲酯、水楊酸應(yīng)答元件，進(jìn)一步表明Sl-miR482參與番茄果實(shí)成熟軟化過程的調(diào)節(jié)。

靶基因預(yù)測結(jié)果顯示，在眾多可能的靶基因中，由于Sl-PL13與Sl-miR482二者在果實(shí)發(fā)育期中的表達(dá)呈現(xiàn)此消彼長的反比關(guān)系。因此，我們認(rèn)為番茄果膠裂解酶Sl-PL13是Sl-miR482的靶基因，二者的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系還有待進(jìn)一步深入探究。果膠裂解酶別名為果膠酸反式消除酶，已有的研究證實(shí)，抑制一種番茄Sl-PL（Solyc03g111690）基因表達(dá)，導(dǎo)致果實(shí)軟化速度明顯變慢，但沒有影響果實(shí)顏色和呈味物質(zhì)的積累（如酸、糖和香氣）［2，14］。最近幾年，PLs（果膠裂解酶基因家族）成為果實(shí)成熟軟化機(jī)制研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。在呼吸躍變型果實(shí)和非呼吸躍變型果實(shí)中，部分果膠裂解酶基因在成熟果實(shí)中表達(dá)量達(dá)到最高峰，隨后逐漸衰減［2，18-23］。此外，有些PLs 基因表達(dá)受到內(nèi)源及外源乙烯的誘導(dǎo)。PLs 基因在果實(shí)成熟中特異性表達(dá)及乙烯誘導(dǎo)表達(dá)模式表明，該基因家族在果實(shí)成熟過程中促進(jìn)果肉細(xì)胞壁中果膠物質(zhì)的分解，進(jìn)而增加聚半乳糖醛酸的溶解性，最終導(dǎo)致果實(shí)軟化，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步深入闡明。

為探究Sl-miR482對番茄果實(shí)成熟軟化的功能及調(diào)控機(jī)制，本研究檢測了Sl-miR482在番茄果實(shí)發(fā)育不同階段的表達(dá)，分析了啟動子中順式作用元件，預(yù)測其靶基因?yàn)橐环N果膠酸裂解酶Sl-PL13，并通過STTM 技術(shù)構(gòu)建能在植物中表達(dá)的pcambia1300-STTM- miR482 沉默表達(dá)載體，為進(jìn)一步探索SlmiR482的功能奠定基礎(chǔ)，同時(shí)為利用生物技術(shù)改善番茄果實(shí)成熟提供了候選基因資源。

4 結(jié)論

篩選出番茄果實(shí)成熟軟化相關(guān)的Sl-miR482，SlmiR482可能通過抑制果膠酸裂解酶Sl-PL13 的活性實(shí)現(xiàn)對番茄果實(shí)成熟軟化的調(diào)節(jié)。