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        稻瘟病菌精氨酸甲基轉移酶基因MoHMT1 的功能分析

        2019-12-04 09:27:38張文澤張艷麗門彥明張玉嬌孫志昕李文慧魯國東齊堯堯
        生物技術通報 2019年12期
        關鍵詞:同源突變體稻瘟病

        張文澤 張艷麗 門彥明 張玉嬌 孫志昕 李文慧 魯國東齊堯堯

        (1. 臨沂大學農林科學學院,臨沂 276005;2. 福建農林大學植物保護學院,福州 350002)

        由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病常常爆發(fā)成災,造成水稻減產(chǎn)高達50%,每年造成的糧食損失足以養(yǎng)活六千萬人口,嚴重威脅著全球糧食安全[1]。稻瘟病菌作為研究寄主-病原真菌相互作用、絲狀真菌侵染致病機理的重要模式生物,其侵染水稻的過程經(jīng)歷了分生孢子的萌發(fā)、芽管的產(chǎn)生、附著胞和侵入栓的形成、以及侵染菌絲的生長和致病等過程[2],涉及到了復雜的蛋白質翻譯后修飾。隨著研究的深入,蛋白質精氨酸甲基化越來越受到研究者的青睞[3],且關于催化其發(fā)揮作用的蛋白質精氨酸甲基轉移酶(Protein arginine methyltransferases,PRMTs)的研究也越來越多。

        PRMTs 普遍存在于真核生物中,主要催化硫代腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)上的甲基轉移到靶蛋白精氨酸殘基末的胍基上,進而調控著DNA 修復、信號轉導、細胞發(fā)育以及癌癥發(fā)生等過程[3-5]。根據(jù)催化形式的不同,PRMTs可以分為4 種類型:Type I 主要催化形成單甲基化(Monomethylated arginine,MMA)和非對稱二甲基化(Asymmetric dimethylated arginine,ADMA);Type II 主要催化形成MMA 和對稱二甲基化(Symmetric dimethylated arginine,SDMA);Type III 只 催 化 形成MMA,而Type IV 則 催 化 形 成δ-MMA[6-7]。到目前為止,報道最多的是Type I 和Type II 的PRMTs[4,6],而鑒定出的3 個Type III PRMTs 分別來自人類(human)[8]、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)[9]和布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)[10],Type IV PRMT 僅在S. cerevisiae[11]中有報道。

        PRMT1 是Type I 中最主要的精氨酸甲基轉移酶,在真核生物中是高度保守的。哺乳動物中對PRMT1 的研究最為透徹,研究發(fā)現(xiàn)人類中的PRMT1是正常胚胎、細胞周期進程、細胞移動和信號轉導所必需的[4-5,12-13]。植物中對PRMT1 的研究相對較少,其中擬南芥(Arabidopsis thaliana)中初步鑒定出PRMT1 的同源蛋白是AtPRMT1a 和AtPRMT1b,這兩個蛋白都定位于細胞質和細胞核中,在體外能催化RNA 甲基轉移酶AtFib2、纖維蛋白和組蛋 白H4[14]。 此 外,AtPRMT1b(PRMT11) 能 與MBD7(methyl-DNA-binding protein 7)相互作用,但是AtPRMT1a和AtPRMT1b的單突變體或雙突變體在長日照條件下都沒有任何明顯的表型[15]。水稻中PRMT1 的同源蛋白OsPRMT1 也定位于細胞質和細胞核中,且在水稻的各個組織中都能表達,其中成熟葉片中表達量最高,體外具有甲基轉移酶的活性[16]。

        在真菌中,釀酒酵母(S. cerevisiae)中的Hmt1p是首次報道的PRMT1 同源蛋白,該蛋白定位于細胞核中,雖然并不是酵母生長所必需的,但其催化活性卻是Npl3p 和Cbp80(cap-binding protein 80)缺失突變體所必需的[17-19]。此 外Hmt1p 除甲基化組氨酸和非組氨酸蛋白外[17-18,20-22],還可以甲基化小核糖體蛋白S2(Small ribosomal protein S2,Rps2)[23]。白色念珠菌(Candida albicans)中的CaHmt1 與Hmt1p 功能類似[24]。近幾年絲狀真菌中的PRMT1/Hmt1p 同源蛋白的研究已取得了一些進展,例如禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)AMT1基因在菌絲生長、應對脅迫反應、產(chǎn)生毒素和侵染植物等過程中都發(fā)揮了重要的作用,且該蛋白調控著FgHrp1 的甲基化和核運輸過程[25];粗糙脈孢菌(Neurospora crassa)中AMT-1基因缺失后導致菌絲伸長速率降低,并增強了對麥角固醇生物合成抑制劑伏立康唑的敏感性[26]。與此不同的是,構巢曲霉(Aspergillus nidulans)中RmtA基因缺失后并沒有影響該菌的營養(yǎng)生長、有性孢子和無性孢子的產(chǎn)生,但是會導致氧脅迫條件下生長明顯減慢[27]。此外,黃曲霉(Aspergillus flavus)RmtA 蛋白作為一個全局調控因子,既負調控著孢子的產(chǎn)生,又促進菌核的發(fā)育,正向調控著次生代謝過程,控制黃曲霉毒素和其他未知代謝物的產(chǎn)生[28]。

        稻瘟病菌(M. oryzae)中含有4 個PRMT 基因(MoPRMT 1-4),生物信息學分析發(fā)現(xiàn)它們均含有保守的甲基轉移酶結構域,在絲狀真菌中是高度保守的[29],其中MoPRMT1 與MoPRMT2、MoPRMT3、MoPRMT4 的序列相似性分別為43%、44%和34%,表達譜分析結果表明MoPRMT1 在侵染后24 h 表達量達到最高峰,而其他階段表達水平基本一致[29],然而該基因在稻瘟病菌侵染循環(huán)過程中發(fā)揮的具體作用尚未報道。根據(jù)真菌基因的命名規(guī)律,參照酵母中同源基因的名稱,本研究將編碼PRMT1 蛋白的基因MGG_04584 重新命名為MoHMT1(hnRNP arginine N-methyltransferase),并利用同源重組的基因敲除技術,分析其在稻瘟病菌生長發(fā)育和侵染致病過程中的作用,為進一步揭示稻瘟病菌MoHMT1的生物學功能及其參與的信號途徑提供基礎,也有利于進一步闡明稻瘟病菌的致病分子機理。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        稻瘟病菌菌株Ku80由美國普渡大學許金榮博士惠贈;大腸桿菌(Escherichia coli)DH5α、水稻品種CO39 均為本實驗室所保存;PCR 試劑、限制性內切酶、T4 DNA 連接酶等均購于大連寶生物公司;其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純;引物合成(表1)及DNA 測序分析均由華大基因完成。

        1.2 方法

        1.2.1MoHMT1基因的敲除 根據(jù)同源重組的原理,以稻瘟病菌菌株Ku80基因組DNA 為模板,通過MoHMT1的上下游引物(表1)分別擴增其上下游片段A 和B,然后分別與潮霉素磷酸轉移酶基因H 片段混合作為模板,利用SOE-PCR 技術擴增獲得AH 和HB 片段,進行原生質體的轉化[30]。挑選具有潮霉素抗性的轉化子,利用PCR 的方法篩選基因敲除的陽性轉化子。

        1.2.2Mohmt1敲除突變體菌落形態(tài)觀察和生長速率測定 將生長活力大致相同的野生型菌株Ku80、敲除突變體ΔMohmt1-14菌株、ΔMohmt1-19菌株和異位整合突變體Mohmt1-Ect菌株分別挑取大小相等的菌絲塊,接種于淀粉酵母固體培養(yǎng)基(15 cm 培養(yǎng)皿)的中央,26℃ 倒置培養(yǎng),并于接種后的3 d、5 d、7 d、9 d 測量菌落直徑,第9 天對菌落進行拍照。每個樣品重復3 皿,進行3 次獨立實驗,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

        1.2.3Mohmt1敲除突變體產(chǎn)孢量的統(tǒng)計及形態(tài)觀察 將野生型及突變體相關菌株接種到米糠培養(yǎng)基上直至菌絲長滿培養(yǎng)皿(9 cm),然后刮去表面的氣生菌絲,26℃ 開蓋光照產(chǎn)孢2 d,用無菌水沖洗收集所有孢子。將孢子懸浮液于三層濾紙過濾后,用血球計數(shù)板對孢子數(shù)量進行統(tǒng)計。每個樣品重復3皿,進行3 次獨立實驗,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

        1.2.4Mohmt1敲除突變體孢子的萌發(fā)實驗 將上述獲得的野生型及突變體菌株的孢子懸浮液定容至濃度為1×104- 2×104個/mL,吸取12 μL 滴至Gelbond film 疏水表面上,26℃ 保濕培養(yǎng),并于培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、8 h、12 h 后統(tǒng)計孢子的萌發(fā)率。每個樣品重復5 滴,在觀察時間段每滴觀察3 個視野,并進行3 次獨立實驗,對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析。

        表1 本研究所用的引物序列

        1.2.5Mohmt1敲除突變體洋蔥表皮侵染實驗 撕取約 4 mm×4 mm 大小的洋蔥表皮第3 層(從外到內)內表皮,置于每孔含有2 mL 蒸餾水的24 孔培養(yǎng)板孔洞內。調整野生型及突變體菌株的孢子懸浮液的濃度至4×104個/mL,吸取10 μL 孢子懸浮液滴至洋蔥表皮上,26℃ 培養(yǎng),分別于培養(yǎng)24 h 和48 h后觀察侵染情況。

        1.2.6Mohmt1敲除突變體活體接種實驗 調整野生型及突變體菌株的孢子懸浮液濃度為1×105個/mL(含 0.02% Tween),噴霧接種于水稻品種CO39(三葉期)上,于溫室內黑暗保濕處理24 h 后光照培養(yǎng)5 d,觀察葉片的致病情況,其中葉瘟分級的具體分級標準參考 Valent 等[31]的方法。本實驗獨立重復3 次。

        2 結果

        2.1 稻瘟病菌MoHmt1敲除突變體的篩選與鑒定

        為了明確MoHMT1基因的生物學功能,本研究根據(jù)同源重組的原理對MoHMT1基因進行敲除,利用潮霉素磷酸轉移酶基因(HPH)重組替換MoHMT1基因完整的ORF 片段,并將潮霉素作為篩選標記獲得若干候選轉化子。首先利用PCR 技術對候選的轉化子進行DNA 水平驗證,如圖1-A 所示,凡是ORF(表1MoHMT1OF/R)無陽性擴增(約632 bp)且UAH(表1MoHMT1UAF/R)有陽性擴增(約1 450 bp)的轉化子即為Mohmt1敲除突變體菌株,本研究將其命名為ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19,而ORF 有陽性擴增而UAH 無陽性擴增的轉化子即為異位整合突變體,命名為Mohmt1-Ect。

        其次,為了確認敲除突變體的可靠性,本研究進一步通過RT-PCR 技術對獲得的兩個敲除突變體和異位整合突變體進行了驗證。結果如圖1-B 所示,在ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19兩個敲除突變體中,幾乎檢測不到MoHMT1的表達;而陽性對照和異位整合突變體中檢測到MoHMT1的表達。

        2.2 MoHMT1基因的缺失導致稻瘟病菌菌絲體生長明顯減慢

        圖1 Mohmt1 敲除突變體的篩選鑒定

        為了明確MoHMT1基因在稻瘟病菌營養(yǎng)生長過程中的作用,本研究對Mohmt1相關突變體進行了分析。結果如圖2 所示,在淀粉酵母培養(yǎng)基上,與野生型菌株Ku80 相比,ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19突變體菌落明顯變?。▓D2-A),生長速率明顯減慢(圖2-B),且表面的氣生菌絲量明顯減少變?。▓D2-C),而Mohmt1-Ect 則與野生型相比無明顯變化。

        圖2 Mohmt1 敲除突變體的菌落形態(tài)和生長速率

        2.3 MoHMT1基因的缺失導致稻瘟病菌產(chǎn)孢明顯減少但不影響孢子的萌發(fā)

        本研究繼而對Mohmt1相關突變體的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率進行了統(tǒng)計分析。結果如圖3-A 所示, 與 野 生 型 菌 株Ku80 相 比,ΔMoHmt1-14和ΔMoHmt1-19的產(chǎn)孢量明顯減少,僅為野生型的20%左右,暗示了ΔMoHmt1-14和ΔMoHmt1-19突變體在產(chǎn)孢量方面存在明顯缺陷。然而,盡管產(chǎn)孢量顯著下降,但是在4 h 時孢子萌發(fā)率幾乎達到100%,接近野生型的水平(圖3-B),說明突變體的孢子能進行正常地萌發(fā)。MoHmt1-Ect則在產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率方面與野生型相比無明顯變化。

        圖3 Mohmt1 敲除突變體的產(chǎn)孢量和萌發(fā)率統(tǒng)計

        2.4 MoHMT1基因的缺失導致對稻瘟病菌的致病性明顯減弱

        為了明確MoHmt1缺失突變體在稻瘟病菌侵染過程中發(fā)揮的作用,本研究首先進行了洋蔥表皮侵染實驗。結果如圖4-A 所示,在接種到洋蔥表皮48 h 后,與野生型和異位整合突變體相比,盡管Mohmt1缺失突變體產(chǎn)生的次生菌絲略微減少,但是能成功擴展侵入到鄰近的細胞中,暗示了Mohmt1缺失突變體在疏水表面能夠進行正常的侵染和擴展。

        進一步將Mohmt1相關突變體的孢子懸浮液噴霧接種到水稻葉片上觀察其致病性,結果如圖4-B所示,野生型和異位整合突變體形成的病斑幾乎連接成片,且葉片枯黃,多為4-5 級病斑,而Mohmt1缺失突變體僅僅形成零星的褐色針眼狀病斑,病斑數(shù)目明顯減少,多為1 級病斑,偶爾見2 級病斑,表明稻瘟病菌Mohmt1缺失突變體對水稻的致病性明顯減弱。上述實驗表明,MoHMT1基因缺失后盡管孢子能夠正常侵入到水稻葉片并進行擴展,但是其對稻瘟病菌的致病性卻明顯減弱,暗示MoHMT1基因可能在稻瘟病菌的致病過程中發(fā)揮了重要的作用。

        圖4 Mohmt1 敲除突變體的洋蔥表皮和水稻葉片侵染

        3 討論

        精氨酸的甲基化是真核生物中普遍存在的蛋白質翻譯后修飾,其作為轉錄表觀調控因子在premRNA 剪接、DNA 修復、mRNA 轉錄、細胞信號等過程扮演了重要的角色[3],該修飾過程受到PRMTs的調控。研究表明該家族中最保守的成員PRMT1,在不同絲狀真菌中的功能既有保守性又有特異性,例如,禾谷鐮刀菌(F. graminearum)和黃曲霉(A.flavus)中AMT1/RmtA 參與真菌的生長發(fā)育和侵染致病過程,并調控著毒素和其他未知代謝物的產(chǎn)生[25,28]。而構巢曲霉(A. nidulans)中的RmtA 卻并不是真菌生長發(fā)育和侵染致病所必需的[27],這與釀酒酵母(S. cerevisiae)和白色念珠菌(C. albicans)的研究結果一致[17,24]。另外,禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中RmtA基因缺失后對氧脅迫超級敏感[25],而黃曲霉(A. flavus)中RmtA基因缺失后則增強了對氧脅迫的耐受力[28]。這些研究結果為研究稻瘟病菌中MoHmt1(PRMT1 的同源蛋白)的功能指明了方向。

        鑒于此,本研究根據(jù)同源重組的原理獲得Mohmt1缺失突變體,并對相關突變體進行表型分析,結果發(fā)現(xiàn)MoHMT1缺失后減慢了菌絲生長發(fā)育減慢、孢子量降低、對水稻葉片的致病性減弱,然而其具體的調控機制尚未明確,其功能的發(fā)揮是否與其催化活性密切相關有待于進一步地研究。

        在 釀 酒 酵 母(S. cerevisiae)中,Hmt1p 能 夠甲基化Hrp1/Nab2/Npl3 等底物蛋白,從而促進其從細胞核中運輸出來[18-19,32],而禾谷鐮刀菌(F.graminearum)中AMT1僅僅是核運輸FgHrp1 而不是FgNab2 所必需的[25],暗示了甲基化作用位點在不同的真菌中存在差異。因此稻瘟病中MoHmt1 的底物蛋白及其作用位點有哪些,也有待于今后進一步研究。

        4 結論

        從稻瘟病菌(M. oryzae)中鑒定出PRMT1 的同源蛋白MoHmt1,根據(jù)同源重組的原理獲得Mohmt1缺失突變體,對其進行生物學功能分析發(fā)現(xiàn),與野生型相比,Mohmt1缺失突變體的菌落明顯變小,生長速率明顯減慢,且表面的氣生菌絲量明顯減少變??;MoHMT1的缺失也導致產(chǎn)孢量明顯下降,僅為野生型的20%左右,但是這些孢子能夠正常萌發(fā)形成附著胞,并能在洋蔥表皮細胞中成功地定殖和擴展;進一步對水稻葉片進行接種發(fā)現(xiàn),Mohmt1缺失突變體的病斑數(shù)量明顯少于野生型,病情指數(shù)下降,致病性減弱。綜上所述,MoHmt1 蛋白可能在稻瘟病菌的生長發(fā)育和致病過程中發(fā)揮了重要的作用。

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