張文澤 張艷麗 門彥明 張玉嬌 孫志昕 李文慧 魯國東齊堯堯

（1. 臨沂大學(xué)農(nóng)林科學(xué)學(xué)院，臨沂 276005；2. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002）

由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病常常爆發(fā)成災(zāi)，造成水稻減產(chǎn)高達(dá)50%，每年造成的糧食損失足以養(yǎng)活六千萬人口，嚴(yán)重威脅著全球糧食安全［1］。稻瘟病菌作為研究寄主-病原真菌相互作用、絲狀真菌侵染致病機(jī)理的重要模式生物，其侵染水稻的過程經(jīng)歷了分生孢子的萌發(fā)、芽管的產(chǎn)生、附著胞和侵入栓的形成、以及侵染菌絲的生長和致病等過程［2］，涉及到了復(fù)雜的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。隨著研究的深入，蛋白質(zhì)精氨酸甲基化越來越受到研究者的青睞［3］，且關(guān)于催化其發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（Protein arginine methyltransferases，PRMTs）的研究也越來越多。

PRMTs 普遍存在于真核生物中，主要催化硫代腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）上的甲基轉(zhuǎn)移到靶蛋白精氨酸殘基末的胍基上，進(jìn)而調(diào)控著DNA 修復(fù)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞發(fā)育以及癌癥發(fā)生等過程［3-5］。根據(jù)催化形式的不同，PRMTs可以分為4 種類型：Type I 主要催化形成單甲基化（Monomethylated arginine，MMA）和非對稱二甲基化（Asymmetric dimethylated arginine，ADMA）；Type II 主要催化形成MMA 和對稱二甲基化（Symmetric dimethylated arginine，SDMA）；Type III 只 催 化 形成MMA，而Type IV 則 催 化 形 成δ-MMA［6-7］。到目前為止，報(bào)道最多的是Type I 和Type II 的PRMTs［4，6］，而鑒定出的3 個(gè)Type III PRMTs 分別來自人類（human）［8］、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）［9］和布氏錐蟲（Trypanosoma brucei）［10］，Type IV PRMT 僅在S. cerevisiae［11］中有報(bào)道。

PRMT1 是Type I 中最主要的精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶，在真核生物中是高度保守的。哺乳動(dòng)物中對PRMT1 的研究最為透徹，研究發(fā)現(xiàn)人類中的PRMT1是正常胚胎、細(xì)胞周期進(jìn)程、細(xì)胞移動(dòng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所必需的［4-5，12-13］。植物中對PRMT1 的研究相對較少，其中擬南芥（Arabidopsis thaliana）中初步鑒定出PRMT1 的同源蛋白是AtPRMT1a 和AtPRMT1b，這兩個(gè)蛋白都定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，在體外能催化RNA 甲基轉(zhuǎn)移酶AtFib2、纖維蛋白和組蛋 白H4［14］。 此 外，AtPRMT1b（PRMT11） 能 與MBD7（methyl-DNA-binding protein 7）相互作用，但是AtPRMT1a和AtPRMT1b的單突變體或雙突變體在長日照條件下都沒有任何明顯的表型［15］。水稻中PRMT1 的同源蛋白OsPRMT1 也定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中，且在水稻的各個(gè)組織中都能表達(dá)，其中成熟葉片中表達(dá)量最高，體外具有甲基轉(zhuǎn)移酶的活性［16］。

在真菌中，釀酒酵母（S. cerevisiae）中的Hmt1p是首次報(bào)道的PRMT1 同源蛋白，該蛋白定位于細(xì)胞核中，雖然并不是酵母生長所必需的，但其催化活性卻是Npl3p 和Cbp80（cap-binding protein 80）缺失突變體所必需的［17-19］。此 外Hmt1p 除甲基化組氨酸和非組氨酸蛋白外［17-18，20-22］，還可以甲基化小核糖體蛋白S2（Small ribosomal protein S2，Rps2）［23］。白色念珠菌（Candida albicans）中的CaHmt1 與Hmt1p 功能類似［24］。近幾年絲狀真菌中的PRMT1/Hmt1p 同源蛋白的研究已取得了一些進(jìn)展，例如禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）AMT1基因在菌絲生長、應(yīng)對脅迫反應(yīng)、產(chǎn)生毒素和侵染植物等過程中都發(fā)揮了重要的作用，且該蛋白調(diào)控著FgHrp1 的甲基化和核運(yùn)輸過程［25］；粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中AMT-1基因缺失后導(dǎo)致菌絲伸長速率降低，并增強(qiáng)了對麥角固醇生物合成抑制劑伏立康唑的敏感性［26］。與此不同的是，構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）中RmtA基因缺失后并沒有影響該菌的營養(yǎng)生長、有性孢子和無性孢子的產(chǎn)生，但是會導(dǎo)致氧脅迫條件下生長明顯減慢［27］。此外，黃曲霉（Aspergillus flavus）RmtA 蛋白作為一個(gè)全局調(diào)控因子，既負(fù)調(diào)控著孢子的產(chǎn)生，又促進(jìn)菌核的發(fā)育，正向調(diào)控著次生代謝過程，控制黃曲霉毒素和其他未知代謝物的產(chǎn)生［28］。

稻瘟病菌（M. oryzae）中含有4 個(gè)PRMT 基因（MoPRMT 1-4），生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)它們均含有保守的甲基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域，在絲狀真菌中是高度保守的［29］，其中MoPRMT1 與MoPRMT2、MoPRMT3、MoPRMT4 的序列相似性分別為43%、44%和34%，表達(dá)譜分析結(jié)果表明MoPRMT1 在侵染后24 h 表達(dá)量達(dá)到最高峰，而其他階段表達(dá)水平基本一致［29］，然而該基因在稻瘟病菌侵染循環(huán)過程中發(fā)揮的具體作用尚未報(bào)道。根據(jù)真菌基因的命名規(guī)律，參照酵母中同源基因的名稱，本研究將編碼PRMT1 蛋白的基因MGG_04584 重新命名為MoHMT1（hnRNP arginine N-methyltransferase），并利用同源重組的基因敲除技術(shù)，分析其在稻瘟病菌生長發(fā)育和侵染致病過程中的作用，為進(jìn)一步揭示稻瘟病菌MoHMT1的生物學(xué)功能及其參與的信號途徑提供基礎(chǔ)，也有利于進(jìn)一步闡明稻瘟病菌的致病分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

稻瘟病菌菌株Ku80由美國普渡大學(xué)許金榮博士惠贈(zèng)；大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、水稻品種CO39 均為本實(shí)驗(yàn)室所保存；PCR 試劑、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶等均購于大連寶生物公司；其他常規(guī)生化試劑均為國產(chǎn)分析純；引物合成（表1）及DNA 測序分析均由華大基因完成。

1.2 方法

1.2.1MoHMT1基因的敲除 根據(jù)同源重組的原理，以稻瘟病菌菌株Ku80基因組DNA 為模板，通過MoHMT1的上下游引物（表1）分別擴(kuò)增其上下游片段A 和B，然后分別與潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因H 片段混合作為模板，利用SOE-PCR 技術(shù)擴(kuò)增獲得AH 和HB 片段，進(jìn)行原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化［30］。挑選具有潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，利用PCR 的方法篩選基因敲除的陽性轉(zhuǎn)化子。

1.2.2Mohmt1敲除突變體菌落形態(tài)觀察和生長速率測定 將生長活力大致相同的野生型菌株Ku80、敲除突變體ΔMohmt1-14菌株、ΔMohmt1-19菌株和異位整合突變體Mohmt1-Ect菌株分別挑取大小相等的菌絲塊，接種于淀粉酵母固體培養(yǎng)基（15 cm 培養(yǎng)皿）的中央，26℃ 倒置培養(yǎng)，并于接種后的3 d、5 d、7 d、9 d 測量菌落直徑，第9 天對菌落進(jìn)行拍照。每個(gè)樣品重復(fù)3 皿，進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.3Mohmt1敲除突變體產(chǎn)孢量的統(tǒng)計(jì)及形態(tài)觀察 將野生型及突變體相關(guān)菌株接種到米糠培養(yǎng)基上直至菌絲長滿培養(yǎng)皿（9 cm），然后刮去表面的氣生菌絲，26℃ 開蓋光照產(chǎn)孢2 d，用無菌水沖洗收集所有孢子。將孢子懸浮液于三層濾紙過濾后，用血球計(jì)數(shù)板對孢子數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。每個(gè)樣品重復(fù)3皿，進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

1.2.4Mohmt1敲除突變體孢子的萌發(fā)實(shí)驗(yàn) 將上述獲得的野生型及突變體菌株的孢子懸浮液定容至濃度為1×104- 2×104個(gè)/mL，吸取12 μL 滴至Gelbond film 疏水表面上，26℃ 保濕培養(yǎng)，并于培養(yǎng)1 h、2 h、4 h、8 h、12 h 后統(tǒng)計(jì)孢子的萌發(fā)率。每個(gè)樣品重復(fù)5 滴，在觀察時(shí)間段每滴觀察3 個(gè)視野，并進(jìn)行3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。

表1 本研究所用的引物序列

1.2.5Mohmt1敲除突變體洋蔥表皮侵染實(shí)驗(yàn) 撕取約 4 mm×4 mm 大小的洋蔥表皮第3 層（從外到內(nèi)）內(nèi)表皮，置于每孔含有2 mL 蒸餾水的24 孔培養(yǎng)板孔洞內(nèi)。調(diào)整野生型及突變體菌株的孢子懸浮液的濃度至4×104個(gè)/mL，吸取10 μL 孢子懸浮液滴至洋蔥表皮上，26℃ 培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)24 h 和48 h后觀察侵染情況。

1.2.6Mohmt1敲除突變體活體接種實(shí)驗(yàn) 調(diào)整野生型及突變體菌株的孢子懸浮液濃度為1×105個(gè)/mL（含 0.02% Tween），噴霧接種于水稻品種CO39（三葉期）上，于溫室內(nèi)黑暗保濕處理24 h 后光照培養(yǎng)5 d，觀察葉片的致病情況，其中葉瘟分級的具體分級標(biāo)準(zhǔn)參考 Valent 等［31］的方法。本實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3 次。

2 結(jié)果

2.1 稻瘟病菌MoHmt1敲除突變體的篩選與鑒定

為了明確MoHMT1基因的生物學(xué)功能，本研究根據(jù)同源重組的原理對MoHMT1基因進(jìn)行敲除，利用潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（HPH）重組替換MoHMT1基因完整的ORF 片段，并將潮霉素作為篩選標(biāo)記獲得若干候選轉(zhuǎn)化子。首先利用PCR 技術(shù)對候選的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行DNA 水平驗(yàn)證，如圖1-A 所示，凡是ORF（表1MoHMT1OF/R）無陽性擴(kuò)增（約632 bp）且UAH（表1MoHMT1UAF/R）有陽性擴(kuò)增（約1 450 bp）的轉(zhuǎn)化子即為Mohmt1敲除突變體菌株，本研究將其命名為ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19，而ORF 有陽性擴(kuò)增而UAH 無陽性擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化子即為異位整合突變體，命名為Mohmt1-Ect。

其次，為了確認(rèn)敲除突變體的可靠性，本研究進(jìn)一步通過RT-PCR 技術(shù)對獲得的兩個(gè)敲除突變體和異位整合突變體進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果如圖1-B 所示，在ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19兩個(gè)敲除突變體中，幾乎檢測不到MoHMT1的表達(dá)；而陽性對照和異位整合突變體中檢測到MoHMT1的表達(dá)。

2.2 MoHMT1基因的缺失導(dǎo)致稻瘟病菌菌絲體生長明顯減慢

圖1 Mohmt1 敲除突變體的篩選鑒定

為了明確MoHMT1基因在稻瘟病菌營養(yǎng)生長過程中的作用，本研究對Mohmt1相關(guān)突變體進(jìn)行了分析。結(jié)果如圖2 所示，在淀粉酵母培養(yǎng)基上，與野生型菌株Ku80 相比，ΔMohmt1-14和ΔMohmt1-19突變體菌落明顯變?。▓D2-A），生長速率明顯減慢（圖2-B），且表面的氣生菌絲量明顯減少變?。▓D2-C），而Mohmt1-Ect 則與野生型相比無明顯變化。

圖2 Mohmt1 敲除突變體的菌落形態(tài)和生長速率

2.3 MoHMT1基因的缺失導(dǎo)致稻瘟病菌產(chǎn)孢明顯減少但不影響孢子的萌發(fā)

本研究繼而對Mohmt1相關(guān)突變體的產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果如圖3-A 所示， 與 野 生 型 菌 株Ku80 相 比，ΔMoHmt1-14和ΔMoHmt1-19的產(chǎn)孢量明顯減少，僅為野生型的20%左右，暗示了ΔMoHmt1-14和ΔMoHmt1-19突變體在產(chǎn)孢量方面存在明顯缺陷。然而，盡管產(chǎn)孢量顯著下降，但是在4 h 時(shí)孢子萌發(fā)率幾乎達(dá)到100%，接近野生型的水平（圖3-B），說明突變體的孢子能進(jìn)行正常地萌發(fā)。MoHmt1-Ect則在產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)率方面與野生型相比無明顯變化。

圖3 Mohmt1 敲除突變體的產(chǎn)孢量和萌發(fā)率統(tǒng)計(jì)

2.4 MoHMT1基因的缺失導(dǎo)致對稻瘟病菌的致病性明顯減弱

為了明確MoHmt1缺失突變體在稻瘟病菌侵染過程中發(fā)揮的作用，本研究首先進(jìn)行了洋蔥表皮侵染實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4-A 所示，在接種到洋蔥表皮48 h 后，與野生型和異位整合突變體相比，盡管Mohmt1缺失突變體產(chǎn)生的次生菌絲略微減少，但是能成功擴(kuò)展侵入到鄰近的細(xì)胞中，暗示了Mohmt1缺失突變體在疏水表面能夠進(jìn)行正常的侵染和擴(kuò)展。

進(jìn)一步將Mohmt1相關(guān)突變體的孢子懸浮液噴霧接種到水稻葉片上觀察其致病性，結(jié)果如圖4-B所示，野生型和異位整合突變體形成的病斑幾乎連接成片，且葉片枯黃，多為4-5 級病斑，而Mohmt1缺失突變體僅僅形成零星的褐色針眼狀病斑，病斑數(shù)目明顯減少，多為1 級病斑，偶爾見2 級病斑，表明稻瘟病菌Mohmt1缺失突變體對水稻的致病性明顯減弱。上述實(shí)驗(yàn)表明，MoHMT1基因缺失后盡管孢子能夠正常侵入到水稻葉片并進(jìn)行擴(kuò)展，但是其對稻瘟病菌的致病性卻明顯減弱，暗示MoHMT1基因可能在稻瘟病菌的致病過程中發(fā)揮了重要的作用。

圖4 Mohmt1 敲除突變體的洋蔥表皮和水稻葉片侵染

3 討論

精氨酸的甲基化是真核生物中普遍存在的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，其作為轉(zhuǎn)錄表觀調(diào)控因子在premRNA 剪接、DNA 修復(fù)、mRNA 轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞信號等過程扮演了重要的角色［3］，該修飾過程受到PRMTs的調(diào)控。研究表明該家族中最保守的成員PRMT1，在不同絲狀真菌中的功能既有保守性又有特異性，例如，禾谷鐮刀菌（F. graminearum）和黃曲霉（A.flavus）中AMT1/RmtA 參與真菌的生長發(fā)育和侵染致病過程，并調(diào)控著毒素和其他未知代謝物的產(chǎn)生［25，28］。而構(gòu)巢曲霉（A. nidulans）中的RmtA 卻并不是真菌生長發(fā)育和侵染致病所必需的［27］，這與釀酒酵母（S. cerevisiae）和白色念珠菌（C. albicans）的研究結(jié)果一致［17，24］。另外，禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中RmtA基因缺失后對氧脅迫超級敏感［25］，而黃曲霉（A. flavus）中RmtA基因缺失后則增強(qiáng)了對氧脅迫的耐受力［28］。這些研究結(jié)果為研究稻瘟病菌中MoHmt1（PRMT1 的同源蛋白）的功能指明了方向。

鑒于此，本研究根據(jù)同源重組的原理獲得Mohmt1缺失突變體，并對相關(guān)突變體進(jìn)行表型分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MoHMT1缺失后減慢了菌絲生長發(fā)育減慢、孢子量降低、對水稻葉片的致病性減弱，然而其具體的調(diào)控機(jī)制尚未明確，其功能的發(fā)揮是否與其催化活性密切相關(guān)有待于進(jìn)一步地研究。

在 釀 酒 酵 母（S. cerevisiae）中，Hmt1p 能 夠甲基化Hrp1/Nab2/Npl3 等底物蛋白，從而促進(jìn)其從細(xì)胞核中運(yùn)輸出來［18-19，32］，而禾谷鐮刀菌（F.graminearum）中AMT1僅僅是核運(yùn)輸FgHrp1 而不是FgNab2 所必需的［25］，暗示了甲基化作用位點(diǎn)在不同的真菌中存在差異。因此稻瘟病中MoHmt1 的底物蛋白及其作用位點(diǎn)有哪些，也有待于今后進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

從稻瘟病菌（M. oryzae）中鑒定出PRMT1 的同源蛋白MoHmt1，根據(jù)同源重組的原理獲得Mohmt1缺失突變體，對其進(jìn)行生物學(xué)功能分析發(fā)現(xiàn)，與野生型相比，Mohmt1缺失突變體的菌落明顯變小，生長速率明顯減慢，且表面的氣生菌絲量明顯減少變薄；MoHMT1的缺失也導(dǎo)致產(chǎn)孢量明顯下降，僅為野生型的20%左右，但是這些孢子能夠正常萌發(fā)形成附著胞，并能在洋蔥表皮細(xì)胞中成功地定殖和擴(kuò)展；進(jìn)一步對水稻葉片進(jìn)行接種發(fā)現(xiàn)，Mohmt1缺失突變體的病斑數(shù)量明顯少于野生型，病情指數(shù)下降，致病性減弱。綜上所述，MoHmt1 蛋白可能在稻瘟病菌的生長發(fā)育和致病過程中發(fā)揮了重要的作用。