張保青 邵敏 黃玉新

1 黃杏2

1 宋修鵬1，2

陳虎3 王盛2 譚秦亮5

楊麗濤5

李楊瑞1，2

（1. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究所 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甘蔗研究中心 廣西甘蔗遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部廣西甘蔗生物技術(shù)與遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007；2. 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院，南寧 530005；3. 廣西林業(yè)科學(xué)研究院，南寧 530002；4. 南寧市綠化工程管理中心，南寧 530011；5. 廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，南寧 530001）

植物生長過程中難免會遭遇病蟲害、干旱、鹽漬、機(jī)械損傷、高溫、低溫等逆境脅迫。生物或非生物脅迫會使植物產(chǎn)生活性氧物質(zhì)（Reactive oxygen species，ROS），包括超氧陰離子（O2-）、羥自由基（·OH）、單線態(tài)氧和過氧化氫（H2O2）等［1］。活性氧的過量積累會對植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)、DNA 與脂質(zhì)等造成氧化，從而破壞其生物膜的結(jié)構(gòu)和功能，對植物造成一定的傷害［2-3］。為了防御氧化脅迫，植物在長期進(jìn)化過程中形成了相應(yīng)的酶類（SOD、CAT和APXs）和非酶類（谷胱甘肽、生育酚、類胡蘿卜素等小分子物質(zhì)）兩套防御體系來清除有害物質(zhì)?？箟难徇^氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX）是抗氧化系統(tǒng)中與H2O2親和力最強(qiáng)的氧化酶。APX以抗壞血酸為電子供體，催化H2O2分解成H2O 和O2，從而降低氧自由基濃度，減輕對細(xì)胞的傷害，保障植物在逆境環(huán)境中生長，因此，研究APX 應(yīng)對逆境脅迫具有重要意義。

目前，在擬南芥［4］、水稻［5］、小麥［6］、高粱［7］、馬鈴薯［8］、銀杏［9］、棉花［10］、油菜［11］、甘蔗［12-13］等多種植物已克隆出APX。關(guān)于APX在抗逆境方面的作用也進(jìn)行了較多報道，如轉(zhuǎn)豌豆cAPX的轉(zhuǎn)基因番茄過量表達(dá)能夠提高其抗寒和抗鹽能力［14］；過表達(dá)SbpAPX的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯能夠提高鹽和干旱脅迫耐受性［15］；過表達(dá)葉綠體APX的轉(zhuǎn)基因擬南芥可以抵御強(qiáng)光氧化脅迫［16］；高粱抗壞血酸過氧化物酶基因（Sb002G431100）在感蚜突變體RMES1 介導(dǎo)的抗蟲反應(yīng)中發(fā)揮著積極作用［17］；甘蔗抗壞血酸過氧化物酶基因（ScAPX）對SA、MeJA、H2O2、ABA、NaCl 和PEG 的脅迫表現(xiàn)出正響應(yīng)［13］。

甘蔗是重要的糖料作物、能源作物和飼料作物，關(guān)于甘蔗耐寒性與抗壞血酸過氧化物酶關(guān)系的研究報道主要集中在低溫脅迫后植物體內(nèi)SOD、POD、CAT 等酶活性的變化［18-22］，甘蔗抗壞血酸過氧化物酶基因在不同抗性甘蔗品種及其與甘蔗抗寒性之間的機(jī)理研究報道較少。

本研究利用RT-PCR 克隆甘蔗ScAPX1全長，利用生物信息學(xué)分析該基因的序列特征，通過熒光定量技術(shù)探討在低溫脅迫下甘蔗ScAPX1在甘蔗葉片中的時空表達(dá)模式，初步探明該基因與甘蔗抵御寒害等逆境的關(guān)系，為深入研究甘蔗APX1在低溫脅迫中的功能及甘蔗抗寒育種的分子機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料 試驗(yàn)材料是根據(jù)前期的研究結(jié)果選取甘蔗品種GT28（耐寒）和YL6（不耐寒）。將生長健壯，長勢一致的單芽蔗莖種植于泥沙混合培養(yǎng)基質(zhì)上，待甘蔗長到3 葉時，選取長勢較一致的蔗株移栽到300 mm×350 mm（直徑×高）塑料桶，每桶裝混合土17.5 kg（土∶有機(jī)肥∶沙=60∶20∶20，W/W），隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每桶種植2-3 株甘蔗，為增強(qiáng)透氣性，在桶底打孔。將桶移至大棚，常規(guī)管理。待正常生長10 個月后，甘蔗處于生長后期時，把材料分為2 組：第一組正常管理，為對照組（CK），溫度為25℃，光強(qiáng)為250-300 μmol/m2·s，12 h 光周期，相對濕度60%-70%。；第二組進(jìn)行低溫處理（人工氣候室），溫度設(shè)為0-4℃，光強(qiáng)為250-300 μmol/m2·s，12 h 光周期，相對濕度60%-70%；試驗(yàn)分別于低溫后2、4、6 和8 d 后取樣，于早晨8 點(diǎn)采集+1 葉和莖尖樣品，速凍于液氮中，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試驗(yàn)試劑 TRIzol 總RNA 提取試劑、PCR反應(yīng)2×GoldStarTaqMasterMix 購自北京康為世紀(jì)公司；M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑、PrimeScript? RT Reagent Kit With gDNA Eraser（Perfect Real Time）、PMD18-T vector 及SYBR? Premix Ex TaqTMII 均購自TaKaRa 公司；Biospin Gel Extraction Kit 購自BioFlux公司；引物由TaKaRa 公司和上海生工生物工程有限公司合成。大腸桿菌（E. coli）DH5α 由本實(shí)驗(yàn)室保存；其他常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成 用TRIzol 試劑提取2 個甘蔗品種總RNA，提取步驟按說明書進(jìn)行，使用紫外分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的濃度和完整性。以提取獲得的RNA為模版，按照M-MLV cDNA 第一鏈合成試劑盒說明書合成cDNA 第一鏈。逆轉(zhuǎn)錄引物用Oligo（dT）18 Primer：5′-GGCCACGCGTCGACTAGTACTTTTTTTTT TTTTTTTTT-3′，具體步驟按說明書進(jìn)行。

1.2.2ScAPX的克隆 運(yùn)用BLAST 程序?qū)enBank進(jìn)行搜索，選取與ScAPX同源性較高的高粱核苷酸序列進(jìn)行比對分析并運(yùn)用Primer 軟件設(shè)計(jì)上 游 引 物APX-F：5′-ATGGCGAAG（A/T）（A/G）CTACCCGA-3′，下游引物APX-R：5′-（A/T/C）GCATCAGC（A/G）AACCC（C/T）AGTTC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為10×Buffer 2.0 μL、dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL、cDNA（100 μg/μL）1.0 μL、Taq DNA 聚合酶（200 U/μL）0.16 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL 和ddH2O 19.44 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min；95℃ 40 s，58℃ 50 s，72℃ 2 min，35個循環(huán)；72℃ 10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的條帶，連接pMD18-T，熱激法轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌液PCR 檢測驗(yàn)證后，陽性克隆送由華大上海生物工程公司測序。

1.2.3ScAPX1的生物信息學(xué)分析 用BioXM2.6 預(yù)測基因氨基酸序列；利用NCBI 中BLASTP 工具查找甘蔗ScAPX 蛋白同源氨基酸序列，并用DNAMAN 6.0 軟件多重比對同源氨基酸序列；在線軟件（http：//isoelectric.ovh.org/）分析基因氨基酸序列的蛋白質(zhì)分子量和等電點(diǎn)大小；用MEGA6.0 軟件構(gòu)建甘蔗ScAPX1 氨基酸序列與其他物種APX 氨基酸序列的進(jìn)化樹。

1.2.4ScAPX1的實(shí)時熒光定量表達(dá)分析 根據(jù)獲得的ScAPX1全長序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR 特異性引物；以GAPDH（NCBI 登錄號為EF189713）作為內(nèi)參基因， 設(shè)計(jì)內(nèi)參引物GAPDHF：5′-AAGGGTGGTGCCAAGAAGG-3′，GAPDH R ：5′-CAAGGGGAGCAAGGCAGTT-3′。熒 光 定 量PCR反 應(yīng) 在LightCycler 480II（RoChe）real-time PCR 儀上進(jìn)行，數(shù)據(jù)用qBASE plus 軟件進(jìn)行分析。反應(yīng) 體 系 為SYBR?PremixExTaqTMII（2×）10 μL、PCR Forward/Reverse Primer（10 μmol/L）各0.8 μL、cDNA 模 板（50 ng/μL）2.0 μL， 加ddH2O 補(bǔ) 至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝惠喎磻?yīng)95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 20 s，45 個循環(huán)；第二輪反應(yīng)95℃ 1 s，65℃15 s，95℃ Continuous，1 個循環(huán)，40℃ 30 s。樣本基因和內(nèi)參基因分別設(shè)定3 個重復(fù)，以0 d 材料作為對照。反應(yīng)完成后進(jìn)行融解曲線檢驗(yàn)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 總RNA和cDNA質(zhì)量的檢測

甘蔗總RNA（TRIzol 試劑盒提?。┙?jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。從圖1 可以看出，RNA 帶型完整清晰，18 S 和28 S 兩條帶比較完整且較亮，5 S 則隱約可見，并無雜質(zhì)污染，說明所提取的甘蔗RNA 質(zhì)量較好?？俁NA 逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，可以看出，逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在100-2 000 bp 均勻彌散狀的帶，說明逆轉(zhuǎn)錄質(zhì)量較好。

2.2 抗壞血酸過氧化物酶（ScAPX1）基因全長cDNA克隆

以2 個甘蔗品種經(jīng)不同低溫處理的葉片等量混合的cDNA 為模板，利用上游引物APX-F 和下游引物APX-R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得一段約750 bp 的條帶（圖2），經(jīng)測序和比對，發(fā)現(xiàn)為甘蔗抗壞血酸過氧化物酶基因完整開放閱讀框（ORF）全長，命名為ScAPX1，基因登錄號為KC794939。ScAPX1的cDNA 全長包含一個759 bp 的ORF（圖3），編碼252 個氨基酸。

圖1 甘蔗葉片總RNA 和cDNA 瓊脂糖檢測

圖2 甘蔗ScAPX1 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖3 ScAPX1 編碼區(qū)核苷酸序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列

2.3 ScAPX1生物信息學(xué)分析

軟件預(yù)測ScAPX1編碼的氨基酸序列蛋白分子量大小為27.40 kD，等電點(diǎn)為5.78。在氨基酸序列組成中，Leu、Ala、Gly、Glu、Lys 出現(xiàn)頻率較高，分別占11.6%、11.2%、9.2%、7.6% 和7.2%，Sec、Trp、Cys、Met、Asn 出現(xiàn)頻率較低，僅占0.0%、0.8%、1.2%、1.6% 和2.0%。WoLF PSORT 軟 件 顯示ScAPX1 亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)；該基因不含信號肽，是一個可溶性蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)；ScAPX1編碼的氨基酸疏水性在-4.5-4.5。SOPMA 軟件二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明：α-螺旋92 個（36.5%）；隨機(jī)卷曲111個（44.1%）；延伸鏈28 個（11.1%）；β-轉(zhuǎn)角21 個（8.3%）。ScAPX1 沒有糖基化位點(diǎn)，含有磷酸化位點(diǎn)Ser 4 個，Thr 4 個，Tyr 2 個。

ScAPX1 蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析顯示：在54-59、69-74 和177-182 位氨基酸為N-肉豆蔻酰化位點(diǎn)，50-52、59-61 和207-209 位為蛋白激酶C 磷酸化位點(diǎn)，155-165 位為抗壞血酸過氧化物酶近端血紅素配體結(jié)構(gòu)序列，33-44 位為抗壞血酸過氧化物酶近端活性位點(diǎn)，90-252 位為非動物抗壞血酸過氧化物酶位點(diǎn)，1-252 位為抗壞血酸過氧化物酶家族區(qū)域，231-252 位為伸展蛋白重復(fù)序列，117-124 位為八肽重復(fù)區(qū)。根據(jù)克隆的ScAPX1所編碼的氨基酸序列與其他物種比對發(fā)現(xiàn)，APX 在不同物種之間是非常保守的（圖4）。

根據(jù)NCBI BLAST 檢索，獲得與甘蔗ScAPX1同源的其他10 種植物APX 的氨基酸序列，用MEDA4.0 軟件構(gòu)建APX 進(jìn)化樹（圖5）。通過在線分析可知，甘蔗ScAPX1 與高粱的氨基酸序列同源性最高，聚為一類，其同源性為98%；其次是玉米，為96%；與蘋果、芥菜的同源性較低，為80%。

2.4 甘蔗ScAPX1低溫脅迫下的表達(dá)分析

由圖6 可知，低溫脅迫過程中，2 個甘蔗品種ScAPX1表達(dá)先升高后降低，都是在低溫脅迫4 d 時達(dá)到最大，此時GT28 和YL6 分別為處理0 d 時的2.25 倍和1.14 倍，之后出現(xiàn)下降趨勢?？购詮?qiáng)的GT28 品種ScAPX1表達(dá)量上升速度要比不抗寒品種YL6 快；低溫脅迫8 d 時，ScAPX1在GT28 品種中的表達(dá)量仍高于對照，而不抗寒品種YL6 在低溫處理6 d 時已低于對照水平。

3 討論

圖4 7 種植物ScAPX 氨基酸序列多重比對

圖5 甘蔗ScAPX1 與其他物種APX 的氨基酸序列同源性分析

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是一類廣泛存在于高等植物、藻類和少數(shù)藍(lán)細(xì)菌中的亞鐵血紅素蛋白，其中，在高等植物中已報道有4 種不同細(xì)胞定位的APX 同工酶：葉綠體中的基質(zhì)APX（sAPX）、類囊體APX（tAPX）、微 體APX（mbAPX）和胞質(zhì)APX（cAPX）［23］，其在抗氧化防御系統(tǒng)中清除H2O2，降低植物體內(nèi)活性氧的含量，提高植物應(yīng)對逆境脅迫等方面發(fā)揮著重要作用。前人研究顯示，APX 編碼蛋白相對分子質(zhì)量大約為30 kD，多數(shù)以單體或二聚體形式存在［24］。本研究從甘蔗葉片中克隆得到甘蔗ScAPX1，該基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，其相對分子質(zhì)量為27.40 kD，這與前人從高粱中推導(dǎo)的APX 蛋白相對分子質(zhì)量（27.1 kD）相似［7］。本研究氨基酸序列同源比對結(jié)果顯示，甘蔗ScAPX1與高粱的氨基酸序列同源性最高，達(dá)98%；陳國強(qiáng)等［7］有關(guān)高粱APX 蛋白序列結(jié)構(gòu)分析表明，其不含信號肽，疏水性弱，屬于親水蛋白，定位于細(xì)胞質(zhì)概率大，第33-34 位氨基酸序列是其酶活區(qū)域，第155-165 位氨基酸序列是其亞鐵血紅素配基結(jié)合區(qū)域，二級及三級結(jié)構(gòu)預(yù)測含有較多的不規(guī)則卷曲和α 螺旋，三級結(jié)構(gòu)上呈橢球體。黃菲等［12］參考水稻OsAPX2序列，運(yùn)用電子克隆的方法獲得甘蔗抗壞血酸過氧化物酶基因S-APX2，氨基酸結(jié)構(gòu)預(yù)測中兩者的等電點(diǎn)、分子量等均不同，且其為疏水性蛋白，具有信號肽，為分泌蛋白，無跨膜結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位線粒體。王竹青等［13］克隆得到的甘蔗抗壞血酸過氧化物酶基因（ScAPX）為親水性蛋白，無信號肽，不存在跨膜螺旋區(qū)，為非分泌蛋白，亞細(xì)胞定位在線粒體基質(zhì)和葉綠體基質(zhì)的概率比較高。而本研究中，生物信息學(xué)預(yù)測分析顯示ScAPX1 是一個可溶性蛋白，不含信號肽序列，無跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞質(zhì)，這與已報道的高粱過氧化物酶（APX）基因，其ORF 為753 bp，編碼250 個氨基酸，無信號肽，屬于親水蛋白，推測其定位于細(xì)胞質(zhì)的結(jié)論非常相似，均屬于胞質(zhì)型APX，推測與黃菲等［12］和王竹青等［13］克隆得到的S-APX2和ScAPX屬于APX 家族的不同成員。本研究中，二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明，第33-44 位氨基酸序列為抗壞血酸過氧化物酶近端活性位點(diǎn)，第155-165 位氨基酸序列為抗壞血酸過氧化物酶近端血紅素配體結(jié)構(gòu)序列，進(jìn)一步為甘蔗ScAPX1和高粱APX具高度同源性提供了佐證，也為進(jìn)一步研究該基因的功能提供一定基礎(chǔ)性資料。

圖6 甘蔗ScAPX1 在低溫脅迫下的表達(dá)分析

本研究通過qRT-PCR 分析ScAPX1在2 個不同抗寒性的甘蔗品種葉片中的表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)其表達(dá)均呈先上升后下降趨勢，這與前人在不同的植物逆境系統(tǒng)如丹參［24］、毛白楊［25］、蓬萊［26］中研究APX的表達(dá)結(jié)果相似，王利軍等［27］用SA 對葡萄處理，蔣明等［28］用SA 對青花菜處理以及王竹青等［13］接種黑粉菌對抗、感基因型甘蔗處理，APX的表達(dá)量均有不同程度上升。但表達(dá)量存在差異，抗寒強(qiáng)的品種GT28 在低溫脅迫過程中，ScAPX1的表達(dá)量隨著脅迫時間延長而增加，持續(xù)脅迫其表達(dá)量下降，但達(dá)到重度脅迫時ScAPX1表達(dá)量仍高于對照；而不抗寒品種YL6 在脅迫6 d 時其含量已低于對照，說明ScAPX1的表達(dá)與低溫脅迫存在明顯的關(guān)系，并且ScAPX1的誘導(dǎo)表達(dá)還與甘蔗品種本身的抗寒性密切相關(guān)，在整個脅迫過程中抗寒性強(qiáng)的品種該基因的表達(dá)量始終高于抗寒性較弱的品種。曾秀存等［11］研究表明，在低溫脅迫下APX的表達(dá)量和酶活性均提高，超強(qiáng)抗寒性品種隴油7 號APX表達(dá)量及酶活性高于抗寒性弱的耐寒品種天油4。有研究表明甘蔗在黑穗病菌脅迫下，抗黑穗病品種崖城05-179 的酶活性全程明顯高于對黑穗病敏感的柳城03-182［13］。楊樹在遭真菌性潰瘍病菌侵染后體內(nèi)APX 酶活性的變化也得出相似的結(jié)論［29］，即APX酶活性在抗病品種中明顯高于感病品種。由此推測，ScAPX1與其他APX的功能相似，在生物或非生物逆境脅迫中均發(fā)揮積極的作用。

目前，APX 在植物抗逆中的作用已經(jīng)引起越來越多的關(guān)注。本研究只探討了ScAPX1低溫脅迫下的表達(dá)模式，下一步將深入研究甘蔗ScAPX1在不同組織、不同逆境條件下的實(shí)時表達(dá)、揭示其表達(dá)強(qiáng)度與抗逆相關(guān)性，了解ScAPX1逆境應(yīng)答的機(jī)理。

4 結(jié)論

克隆獲得ScAPX1（GenBank 登錄號為KC7949 39），其包含一個759 bp 的完整開放閱讀框，編碼252 個氨基酸。ScAPX1 無跨膜結(jié)構(gòu)，與高粱氨基酸的同源性為98%，推測其為胞質(zhì)型抗壞血酸過氧化物酶基因。ScAPX1能夠積極響應(yīng)低溫等逆境脅迫，在甘蔗抗寒脅迫過程中起到增強(qiáng)甘蔗抗寒性的作用。