王靜 劉侖 楊勇 胡圣 李立芹

（1. 四川農(nóng)業(yè)大學作物科學國家級實驗教學示范中心，成都 611130；2. 四川農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，成都 611130）

植物在非生物脅迫和生物脅迫下會導致細胞活性氧（Reactive oxygen species，ROS）過量的積累，過量的ROS 積累會非特異性的損害細胞組分，包括細胞核、核酸、蛋白質(zhì)以及光合色素等，在生物體內(nèi)抗氧化酶可以清除活性氧，維持細胞內(nèi)ROS 平衡，在抗氧化物酶中POD 起著關鍵的作用［1］。在植物中廣泛存在過氧化物酶，且具有多種功能［2］。過氧化物酶是多基因家族酶類，參與植物多種代謝途徑，如植物的抗旱、抗鹽、抗寒等多種抗逆功能［3-5］。煙草是中國非常重要的經(jīng)濟作物，煙草的產(chǎn)量與品質(zhì)受到鹽堿、冷害以及干旱等非生物脅迫的影響，因此在分子水平上研究POD 對提高煙草非生物脅迫耐逆性具有重要意義。

POD 是廣泛存在于植物中的氧化還原酶，在植物生長發(fā)育和應激反應中發(fā)揮著重要的作用，是植物重要的保護酶類，最常見的是第Ⅲ類分泌過氧化物酶（Secretory peroxidase，POD），其功能是催化去除H2O2，參與木質(zhì)部合成和降解、還原劑氧化和植物形態(tài)的形成，并參與環(huán)境脅迫相應［6-9］。目前，研究表明，POD 家族基因與植物生長發(fā)育有關，如植物木質(zhì)素聚合、栓化作用、細胞壁結構蛋白的交聯(lián)等［10-11］。在許多植物中POD 的作用都有過報道，而最主要的作用是利用H2O2為底物來參加各種還原物質(zhì)的氧化。ROS 是植物在脅迫刺激下產(chǎn)生的，并被POD 還原為H2O 和O2，因此POD 是植物非生物脅迫下清除ROS 的關鍵酶。Sierla 等［12］研究表明，在植物脅迫下，POD 活性增加，且參與了脅迫途徑調(diào)控。Kumar 等［13］和Neill 等［14］研究表明，植物中的ROS 可以被POD 部分清除。目前，植物中POD 基因研究取得了很大進展，在山楂、水稻、小麥等多種植物中成功克隆POD 家族基因［15-17］。但植物中POD 與ROS 具體作用機制仍不明確。

本研究成功克隆到過氧化物酶家族基因NtPOD2，預測NtPOD2編碼蛋白結構與功能，同時運用熒光定量測定NtPOD2在煙草各個組織中表達水平，以及在非生物脅迫處理下的表達模式，為進一步研究POD 基因在煙草中與ROS 作用機制提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

挑選飽滿均一的普通煙草（K326）種子，消毒（75%乙醇和20%NaClO），反復用無菌水清洗，播種于MS 培養(yǎng)基培養(yǎng)2 周，取大小均勻的幼苗進行ABA、H2O2、干旱、低溫、低鉀及高鹽脅迫處理，每項處理設置3 次重復，分別在0、3、6、12 和24 h 共5 個時間點整株取樣。ABA 與H2O2非生物脅迫具體處理方法參照張雪薇等［18］。

1.2 方法

1.2.1NtPOD2的 克 隆 用Primer 5.0 軟 件 設 計NtPOD2引 物NtPOD2-F 和NtPOD2-R（ 表1）。 以煙草葉片為材料，提取RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒步驟進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，將cDNA 稀釋10 倍進行PCR 擴增，PCR 反應程序為95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 3 min，35 個循環(huán)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收目的片段，將其與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化，在含有Kn 的LB 固體培養(yǎng)基進行涂板，過夜培養(yǎng)后，挑取3 個單克隆菌落進行測序。

表1 引物序列

1.2.2 生物信息學分析 參照王靜等［19］方法進行NtPOD2的生物信息學分析。

1.2.3 煙草NtPOD2的表達分析 采用Primer 5.0 設計熒光定量引物，煙草18SrRNA為內(nèi)參，引物序列為18S-F 和18S-R（表1）。每個樣品重復4 次，結果分析參考王靜等［19］方法。

1.2.4 構建過表達載體 重組克隆載體NtPOD2-pMD19-T 與表達載體pBI121 酶切反應，NtPOD2-pMD19-T 進行37℃雙酶切，酶切體系為10×T Buffer、1 μL；XbaⅠ 0.5 μL、SmaⅠ 0.5 μL、載 體3 μL 和ddH2O 5 μL。酶切過后產(chǎn)物與pBI121 載體16℃連接過夜，連接后產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α 大腸桿菌感受態(tài)，在涂有Kn 的LB 培養(yǎng)基平板式上篩選，挑取單克隆菌株搖菌并送去測序公司進行測序，檢測是否構建成功。

2 結果

2.1 NtPOD2的克隆

以煙草葉片cDNA 為模板進行PCR 擴增，獲得一條大小為750-1 000 bp 條帶。經(jīng)回收和測序，片段大小為897 bp（圖1）。

2.2 NtPOD2-pBI121過表達載體的構建

通過對NtPOD2-pMD19-T 質(zhì)粒進行雙酶切和測序，結果一致，目的片段大小為897 bp（圖2）。

2.3 NtPOD2蛋白序列生物學分析

圖1 NtPOD2 的克隆

圖2 NtPOD2-pBI121 重組質(zhì)粒酶切

對NtPOD2 蛋白進行生物學分析，理化性質(zhì)分析結果表明，NtPOD2 蛋白分子量為32.55 kD，等電點為5.78，不穩(wěn)定系數(shù)為37.72。疏水性分析結果顯示該蛋白屬于親水性蛋白（圖3）。NCBI 在線分析NtPOD2 蛋白保守功能域（圖4），該蛋白屬于Class Ⅲ型分泌性過氧化物酶。采用SMART 和Scan Prosite 分析NtPOD2 蛋白理化性質(zhì)，結果為NtPOD2 蛋白含有6 個蛋白激酶C 磷酸化位點（67-69 SeK；70-72 TaR；77-79 SaR；183-185 TfR；200-202 SqR；235-237 SkK）、1 個N-糖基化位點（75-78 NNSA）、5 個酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點（89-92 SevD；101-104 ScaD；183-186 TfrD；192-195 TniD；209-212 SggD）、1 個氨基化位點（126-129 lGRR）、1 個依賴于cAMP 和cGMP 的蛋白激酶磷酸化位點（128-131 RRdS）。NtPOD2 蛋白信號肽預測結果顯示，NtPOD2 蛋白不存在信號肽，定位在細胞質(zhì)中的概率最大（0.65）。二級結構分析表明，NtPOD 蛋白二級結構的最大元件為α-螺旋，最小元件為β-轉(zhuǎn)角（圖5-A）。三級結構分析結果表明，6個半胱氨酸殘基48-53、102-294 和181-206 分別形成3 個保守的二硫鍵橋（圖5-B）。

圖3 疏水性分析

圖4 保守結構域分析

圖5 NtPOD2 編碼蛋白的結構預測

2.4 NtPOD2同源性分析

把NtPOD2編碼氨基酸序列與絨毛狀煙草、美花煙草、番茄、馬鈴薯以及胡楊POD2通過Dnaman多重序列比對（圖6-A），發(fā)現(xiàn)NtPOD2 蛋白具有POD 家族典型的結構特征，在N 端都包含peroxidase活性位點GAslLRLhFHDC。把NtPOD2編碼氨基酸序列通過Blast 比對，選擇不同物種POD2 氨基酸序列下載，通過MEGA5 構建系統(tǒng)進化樹（圖6-B），結果表明，NtPOD2 蛋白序列與絨毛狀煙草POD2 以及美花葉煙草POD2 蛋白序列有較高同源性，分別為99%和94.65%。

2.5 NtPOD2的組織表達分析

采用qRT-PCR 對煙草K326 各個組織進行表達分析，發(fā)現(xiàn)NtPOD2在根、莖、葉、花中均有表達，在根中表達量明顯高于莖、葉、花（圖7-A）。

2.6 NtPOD2在信號分子處理下的表達分析

煙草K326 幼苗上在培養(yǎng)皿上用ABA 和H2O2處理，對處理后煙草幼苗NtPOD2表達分析表明，在12 h 之前，ABA 處理下NtPOD2的表達受到抑制，24 h 時受到顯著誘導，為對照的3.14 倍（圖7-B）；H2O2處理的早期，NtPOD2的表達受到強烈誘導，12 h 時上升至最大，為對照的120.67 倍（圖7-C）。以上結果表明NtPOD2能夠響應逆境脅迫相關的信號分子調(diào)控。

圖6 NtPOD2 同源性分析

2.7 NtPOD2在逆境脅迫下表達分析

PEG 和低溫處理后，該基因分別在12 h 和6 h 時達到最大值，分別為對照的2.48 倍（圖8-A）、8.60 倍（圖8-B）。低鉀處理下，NtPOD2表達量上升，NaCl 處理下該基因下調(diào)（圖8-C-D）。結果表明，NtPOD2可能參與了PEG、低溫等非生物脅迫。

3 討論

生物信息學分析表明，NtPOD2 蛋白含有3 個二硫鍵，屬于分泌蛋白，含有活性位點（GAslLRLhFHDC），屬于典型的Class Ⅲ型分泌性過氧化物酶。信號肽預測顯示NtPOD2 蛋白定位在細胞質(zhì)中，因此該基因可能在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)加工成熟，進而通過高爾基體運輸?shù)郊毎|(zhì)。該蛋白與其他物種Class Ⅲ型分泌性過氧化物酶相比含有相似的保守結構域（6A）以及二硫鍵橋［20］。該蛋白含有最大元件為α-螺旋，最小元件為β-轉(zhuǎn)角。NtPOD2蛋白以Asp47、Val50、Gly52、Asp54 和Ser56 為中心的Ca2+結合位點構成遠端的氧供體結構域，而Thr175、Asp219、Thr221 和Asp226 為 中 心 的Ca2+結合位點構成近端的氧供體結構域，位于這兩個結構域中間的血紅素則由Fe2+與His46 和His174 形成共價鍵，構成活性中心。蛋白質(zhì)空間結構影響其功能，NtPOD2 蛋白特定的空間結構為其發(fā)揮功能奠定了基礎。同源性分析表明，NtPOD2 蛋白與其他植物POD 蛋白含有較高同源性，其中與美花煙草POD2同源性為99%，可能與美花煙草POD2是POD 家族的同一成員。通過對NtPOD2生物學分析，旨在為研究POD 基因家族奠定基礎。

圖7 NtPOD2 的不同組織及信號分子處理下的表達模式

圖8 NtPOD2 在非生物逆境脅迫下的表達模式

煙草Ntpx在花中表達量最高，銀杏GbPOD1和小桐子JcPOD73莖中表達量最高［21-22］。郭媖等［23］從陸地棉中克隆的GhPOD1和GhPOD2，兩者相似性達99%，但表達模式相差很大。作為多基因家族的POD基因，具有功能多樣性的特點。本研究表明NtPOD2在組織中都有表達，但根中表達最高，而莖、葉、花表達量相對較少，不同植物中POD 基因在不同部位表達模式不同，說明POD 家族基因表達存在特異性。NtPOD2在ABA 處理下，表達量在3 h 先下降，20 h 又上升至最大，約為對照的3.14 倍（圖5-B），說明NtPOD2受ABA 誘導。Gao 等［1］研究表明檉柳ThPODs參與非生物脅迫反應（PEG、ABA、NaCl 等），并依賴ABA 信號轉(zhuǎn)導途徑。鐘新榕等［24］用不同濃度的ABA 處理黃瓜幼苗，POD 活性在短時間內(nèi)可以提高。Anderberg 等［25］研究結果表明低溫脅迫、鹽脅迫以及干旱脅迫下，能較短時間內(nèi)增加植物體內(nèi)ABA 含量，進而誘導ABA 調(diào)控相關基因的表達。司叢叢等［26］研究表明，煙草Ntpx在5%PEG6000脅迫下，Ntpx在最初無明顯變化，在6 h 后表達量上調(diào)在ABA 和干旱脅迫下，表達量上調(diào)。本研究采用10 mmol/L H2O2處理煙草幼苗，NtPOD2的表達受到強烈誘導，12 h 時上升至最大，為對照的120.67 倍。蘇亞春等［27］用100 μmol/L ABA 處理甘蔗，結果表明，ScPOD02表達量在3 h 顯著增加，500 mmol/L H2O2處理下隨著時間的延長，ScPOD02表達量基本不變。而這與蘇亞春等在ABA、H2O2處理甘蔗后，ScPOD02表達模式不同，這可能是不同的濃度ABA、H2O2造成的。由此說明NtPOD2可能受干旱、ABA、NaCl、H2O2脅迫誘導，并依賴ABA 信號轉(zhuǎn)導途徑進而參加植物生長發(fā)育。

在200 mmol/L NaCl 處理下NtPOD2表達量呈現(xiàn)先下降后上升又下降的表達模式，在12 h 表達量達到最大，約為對照1.12 倍。蘇亞春等［27］用250 mmol/L 的NaCL 處理下ScPOD02表達量先在6 h 下降，而在12 h 表達量又上升，約為對照的1.91 倍。與蘇亞春用NaCl 處理甘蔗后ScPOD02表達模式一致，在6 h 前表達量下降，在12 h 時表達量上升為最大，之后又下降。程華等［21］用200 mmol/L NaCl噴灑銀杏幼苗后，POD1表達量降低。Bae 等［11］用200 mmol/L NaCl 處理白楊后PoPOD1基因表達水平下調(diào)。低鉀脅迫下，NtPOD2受到強烈誘導，NtPOD2表達量上調(diào)。王偉等［28］研究表明，大豆在低鉀脅迫下，細胞內(nèi)氧負離子O2-增加，超氧化物歧化酶催化O2-發(fā)生歧化反應生成H2O2-含量增加，進而引起過氧化物酶活性上升。在低溫脅迫下，NtPOD2在6 h 表達量達到最大，在12 h 后又降低。Guo 等［29］在4℃條件下處理檉柳葉和根，葉中ThPOD1表達量在6 h 強烈誘導后又逐漸下降，根ThPOD16 h 強烈誘導后在24 h 達最大值后又下降。外源基因的表達增加宿主細胞的耐受性，植物受到生物脅迫以及非生物脅迫下，可以引起活性氧產(chǎn)生，進而破壞細胞穩(wěn)態(tài)以及防御機制［30-31］。由此說明煙草NtPOD2，在不同脅迫下表達模式發(fā)生改變，以上均說明該基因在生物脅迫以及非生物脅迫中發(fā)揮著重要作用，由此推測，NtPOD2參與生物脅迫與非生物脅迫，可能引起活性氧的改變，進而參與植物生理調(diào)控與防御機制。

4 結論

NtPOD2可能通過ABA 信號通路來參與生物脅迫以及非生物脅迫。