徐田甜，陳 彬，侯是媛，曹 丹，許晨磊，齊 斌，鄭麗雪，王立梅,,*

（1.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.常熟理工學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，江蘇 常熟 215500）

甲殼素又名幾丁質(zhì)，是由β-(1,4)糖苷鍵連接的N-乙酰-D-氨基葡萄糖高分子多聚體，廣泛存在于自然界中，儲量僅次于纖維素[1-2]。甲殼素不溶于水，在甲殼素酶的作用下可分解成水溶性甲殼低聚糖或殼寡糖。甲殼素低聚糖具有抑菌、抗氧化、促進動植物生長發(fā)育等多種功能[3-6]。Ouyang Qianqian等[7]研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)炎癥和氧化應(yīng)激可能導(dǎo)致阿爾茨海默病，而殼聚糖、殼寡糖具有顯著的抗神經(jīng)炎癥以及抗氧化作用，未來可能廣泛應(yīng)用于阿爾茨海默病的治療。Xu Qingsong等[8]研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖具有顯著的抗腫瘤活性，由殼寡糖制備成的高度N-乙?；瘹す烟悄茱@著抑制脂多糖誘導(dǎo)的促炎細胞因子白細胞介素-6和腫瘤壞死因子-α表達。另外甲殼素的分解產(chǎn)物在食品和農(nóng)業(yè)上具有廣泛的應(yīng)用前景[9]。

甲殼素酶主要產(chǎn)自微生物，包括芽孢桿菌、鏈霉菌、黏質(zhì)沙雷氏菌以及假單胞菌等[10-13]。近年來，研究者通過隨機誘變、定點誘變以及改變篩選策略等方法獲得高產(chǎn)或具有特殊性質(zhì)的甲殼素酶菌株，如耐冷、耐熱以及耐酸堿甲殼素酶等[14-17]。麻蝦醬是由產(chǎn)自海洋的麻線蝦加鹽，經(jīng)過自然發(fā)酵制得的富含蛋白質(zhì)、甲殼素的調(diào)味料，是我國及東南亞地區(qū)常見的傳統(tǒng)食品[18-20]。傳統(tǒng)麻蝦醬中微生物多樣性和構(gòu)成非常復(fù)雜[21]，適合用作產(chǎn)甲殼素酶菌株的篩選，目前還鮮見從麻蝦醬中篩選產(chǎn)甲殼素酶菌株的報道。

本實驗以麻蝦醬為原料，篩選高產(chǎn)甲殼素酶的微生物菌株，通過酶聯(lián)免疫吸附實驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法測定其甲殼素酶活，并利用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahigh performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，UPLC-Q-TOF-MS）聯(lián)用技術(shù)對該菌株發(fā)酵液中成分進行檢測，以期篩選到高產(chǎn)甲殼素酶的菌株，為工業(yè)化生產(chǎn)殼寡糖提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麻蝦醬 連云港市海娃食品有限公司；甲殼素與細菌DNA基因組提取盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；甲殼素酶ELISA檢測試劑盒 武漢純度生物科技有限公司；Chitosan標準品 日本Seikagaku公司；其他試劑均為市售分析純。

初篩培養(yǎng)基[22]：A液：K2H P O41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCI 10 g/L、(NH4)2SO420 g/L、瓊脂40 g/L，去離子水1 000 mL，pH 6.5；B液：10 g/L 膠體甲殼素。使用前等體積混合。

復(fù)篩培養(yǎng)基[22]：A液：K2H P O41.4 g/L、KH2PO40.6 g/L、MgSO4·7H2O 1 g/L、NaCl 10 g/L、(NH4)2SO420 g/L，去離子水1 000 mL，pH 6.5；B液：10 g/L 膠體甲殼素，pH 6.5。使用前等體積混合。

種子培養(yǎng)基：PDA。

膠體甲殼素的制備方法參照文獻[23]：將片狀甲殼素粉碎過篩，稱取10 g粉末甲殼素緩緩加入濃鹽酸200 mL，迅速攪拌，待其全部溶解后用玻璃棉過濾除去雜質(zhì)，溶液加入1 000 mL蒸餾水。離心得到沉淀，用蒸餾水洗至中性。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-ZF超凈工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-F280恒溫振蕩培養(yǎng)箱 太倉市華美生化儀器廠；XS105DU電子天平、DYY-6C pH計 瑞士Mettler Toledo公司；legend micro 17R臺式高速冷凍離心機、NanoDrop 2000核酸濃度測定儀 德國Thermo公司；WGL-230B電熱恒溫鼓風干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；My Cycler PCR基因擴增儀、DYCP-31BN瓊脂糖水平電泳槽、Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)、酶標儀 美國Bio-Rad公司；UV-2450紫外-可見分光光度計 日本島津公司；MILI-QADVANT超純水儀 美國Millipore公司；3-30K高速臺式離心機 美國Sigma公司；UPLCQ-TOF-MS儀 美國Waters公司；ZEISS SIGMA熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡 德國卡爾蔡司公司。

1.3 方法

1.3.1 初篩

稱取25 g蝦醬與225 mL生理鹽水制備菌懸液，同時將其質(zhì)量濃度稀釋至10-1、10-2、10-3g/mL和10-4g/mL。將原液和上述稀釋的菌液涂布于初篩培養(yǎng)基上，37 ℃生長1～7 d后挑取生長良好的單一菌落在初篩培養(yǎng)基上劃線分離。

1.3.2 復(fù)篩

挑取初篩培養(yǎng)基上生產(chǎn)的周圍有明顯透明圈的單一菌落接種到液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)1～7 d。

1.3.3 ELISA法酶活測定

將發(fā)酵液3 000 r/min離心10 min，取上清液為待測樣品。往預(yù)先包被甲殼素酶抗體的包被微孔中，依次加入待測樣品、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的檢測抗體，經(jīng)過37 ℃溫育1 h并徹底洗滌。用底物3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺顯色，在HRP催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化為最終的黃色。用酶標儀在450 nm波長處測定OD值，通過標準曲線計算樣品活性。標準品為純甲殼素酶配制的酶活性為0、1.5、3、6、12、24 U/L酶溶液。酶活定義為：37 ℃條件下，每毫克蛋白每小時分解甲殼素產(chǎn)生1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位U。具體操作步驟參考說明書。

1.3.4 菌種鑒定

1.3.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

平板劃線、革蘭氏染色和電鏡觀察法觀察菌落和菌體形態(tài)。參照文獻[24]，采用簡便快速的插片法制樣，直接噴金后進行掃描電鏡觀察。

1.3.4.2 生理生化鑒定

根據(jù)文獻[25-27]進行生理生化鑒定。

1.3.4.3 分子生物學(xué)鑒定

以16S rDNA細菌通用引物擴增，將擴增片段送至生工生物工程（上海）股份有限測序，將測序得到的基因序列在NCBI上進行BLAST比對，利用軟件MEGA5.1構(gòu)建N-J系統(tǒng)進化樹。

1.3.5 發(fā)酵液可溶性糖成分分析

1.3.5.1 Chitosan標準品溶液配制

稱取標準品殼二糖3.8 mg、殼三糖4.9 mg、殼四糖4.3 mg、殼五糖7.0 mg和殼六糖7.0 mg溶于10 mL容量瓶中。

1.3.5.2 UPLC條件

采用BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）柱，柱溫45 ℃，進樣量2 μL。流動相A：體積分數(shù)80%乙腈和體積分數(shù)0.1%氨水，流動相B：體積分數(shù)30%乙腈和體積分數(shù)0.1%氨水。流動相梯度稀釋見表1。

表1 流動相梯度稀釋Table 1 Mobile phase gradient elution program

1.3.5.3 質(zhì)譜條件

采用電噴霧電離源，在正離子電離模式下進行質(zhì)譜分析。毛細管電壓3.5 kV，錐孔電壓20 V。離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度400 ℃，脫溶劑流速700 L/h，錐孔反吹氣流量50 L/h，碰撞室能量6 V，四極桿掃描范圍m/z200～2 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

圖1 X1菌株形態(tài)學(xué)鑒定圖Fig. 1 Morphological identification of strain X1

經(jīng)過初篩復(fù)篩后，篩選到1 株X1菌株。由圖1可見，30 ℃培養(yǎng)5～7 d后，X1菌株在以甲殼素為唯一碳源的初篩培養(yǎng)基上長出透明圈（圖1A）。菌落呈圓型，干燥，粗糙，凸起，粉末狀，較易挑起，無色素，有明顯的土霉氣味。挑取菌落，經(jīng)革蘭氏染色后顯微鏡觀察（圖1B），該菌為革蘭氏陽性菌。由1C、D電鏡觀察圖可知，X1菌株孢子表面光滑，為卵圓形，孢子鏈為直行或卷曲。

2.2 生理生化鑒定

2.2.1 生理生化實驗結(jié)果

表2 X1菌株的生理生化實驗Table 2 Physiological and biochemical properties of strain X1

由表2可見，該菌具有纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、過氧化氫酶活性，同時能使牛奶緩慢胨化，其VP、MR實驗結(jié)果為陰性。X1菌株在30 ℃、pH 6.5條件下生長良好。

2.2.2 碳源利用實驗結(jié)果

表3 X1菌株碳源利用實驗Table 3 Carbon source utilization ability of strain X1

由表3可見，除木糖、果糖和山梨糖外，該菌可利用其他10 種碳源，其可分解甲殼素、殼聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖，可初步推斷該菌所產(chǎn)甲殼素酶為酶系，可能包含甲殼素酶、甲殼素脫乙酰酶、殼聚糖酶等。

2.3 分子生物學(xué)鑒定

2.3.1 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

圖2 PCR擴增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoretogram of PCR amplification products

由圖2可知，以X1菌株DNA為模板，利用細菌通用引物菌株的16S rDNA基因，將PCR產(chǎn)物進行質(zhì)量分數(shù)1%的瓊脂糖凝膠電泳，獲得1 500 bp左右擴增片段，并將1 500 bp左右的條帶切膠回收后送sanger法測序。

2.3.2 系統(tǒng)進化發(fā)育樹

圖3 X1菌株系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of strain X1

經(jīng)NCBI上BLAST比對后，系統(tǒng)進化樹（圖3）顯示該菌可確定為鏈霉菌屬，且與淀粉酶鏈霉菌同源性較高，高達99%以上。結(jié)合菌落的特征、形態(tài)學(xué)、生理生化實驗和16S rDNA基因序列分析，可確認本實驗所篩選到的菌株屬于淀粉酶鏈霉菌亞種，命名為S. diastaticus strain CS 1801。在最適條件（30 ℃、pH 6.5）培養(yǎng)7 d后，發(fā)酵液中甲殼素酶活力可達117.4 U/L。

2.4 UPLC-Q-TOF-MS分析

2.4.1 UPLC分析

圖4 標準品（A）與發(fā)酵液（B）UPLC圖Fig. 4 Ultra-high performance liquid chromatograms of standard (A)and fermentation broth (B)

由圖4A可知，殼寡糖標準溶液具有殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖5 種不同分子質(zhì)量的寡糖成分，在5.09、6.82、8.29、9.59、10.60 min分別出現(xiàn)吸收峰，對應(yīng)的應(yīng)為分子質(zhì)量由小到大的殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。

由圖4B可知，發(fā)酵7 d后的發(fā)酵液樣品，在5.15、6.78、8.29、9.56、10.58 min出現(xiàn)吸收峰，與標準品的出峰時間基本一致，由此發(fā)酵液中很有可能含有殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。

2.4.2 質(zhì)譜分析

圖5 標準品與發(fā)酵液質(zhì)譜分析Fig. 5 Mass spectra of standard and fermentation broth

由圖5A可知，殼寡糖標準品UPLC 5 個峰對應(yīng)的質(zhì)譜主要分子離子峰為m/z 341.2、502.2、663.3、824.4、985.5，其m/z值依次相差約161，這與氨基葡萄糖的殘基吻合，其依次屬于殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖的[M＋H]＋峰[28-31]。由圖5B可見，發(fā)酵液的UPLC的5 個峰對應(yīng)的主要分子離子峰也為m/z 341.2、502.3、663.4、824.5、985.6。這與殼寡糖標準品的質(zhì)譜圖結(jié)果高度一致。

結(jié)合UPLC-Q-TOF-MS結(jié)果可以判定，甲殼素酶發(fā)酵液中含有5 種不同聚合度的殼寡糖，分別為殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。

3 結(jié) 論

本實驗以甲殼素為唯一碳源從麻蝦醬中篩選到1 株產(chǎn)甲殼素酶的菌株，經(jīng)鑒定為淀粉酶鏈霉菌，除甲殼素酶外還產(chǎn)脂肪酶、淀粉酶等多種工業(yè)酶，同時實驗還研究了發(fā)酵液中可溶性糖的成分。本實驗得出兩個結(jié)論：1）篩選到1 株產(chǎn)甲殼素酶的菌株，鑒定后為淀粉酶鏈霉菌，復(fù)篩培養(yǎng)基發(fā)酵7 d后酶活力為117.4 U/L。2）經(jīng)技術(shù)檢測證實，發(fā)酵液中產(chǎn)殼二糖、殼三糖、殼四糖、殼五糖和殼六糖。發(fā)酵液中5 種糖分子質(zhì)量分別為 341.2、502.3、663.4、824.5、985.6 Da，與標準品高度吻合。

目前，殼寡糖因其抑菌、抗腫瘤、降血脂等生物活性已被廣泛應(yīng)用于食品、生物醫(yī)學(xué)和制藥領(lǐng)域。與甲殼素和殼聚糖不同，殼寡糖具有良好的溶解性[32-34]。因此，低聚合度的殼寡糖的生產(chǎn)越來越受到人們的重視。而我國目前對酶法發(fā)酵產(chǎn)低聚合度殼寡糖的研究還相對較少，因此本研究為酶法工業(yè)化產(chǎn)低聚合度的殼寡糖提供了良好的參考依據(jù)，將大大推動其工業(yè)化發(fā)展進程。