路雪純，張根生，張 凱，呂云雄

（哈爾濱商業(yè)大學 食品工程學院，黑龍江 哈爾濱 150076）

速凍面制品主要是以饅頭、花卷、面條、水餃等為主，其生產過程主要是基于冷凍面團的原理[1]。冷凍面團技術起源于1950年，是指利用速凍技術加工包子、面條、水餃等食品，使其預先冷藏一段時間后再取出解凍進行后續(xù)加工，直到得到成品為止[2]。冷凍面團技術可將面團分為冷凍和加工兩個環(huán)節(jié)，既節(jié)約了人力資源和時間，又降低了制作成本[3]。傳統(tǒng)的“現做現賣”的面制品生產和消費形式，在方便性、衛(wèi)生性、流通性等方面都不能完全滿足消費者的需求[4]，而速凍面制品中的酵母菌耐冷凍能力較差，抗凍性較弱，速凍面制品感官和風味較差，所以篩選性能優(yōu)良的耐凍藏酵母菌，實現速凍面制品主食的工業(yè)化生產已成為當今食品產業(yè)的重要課題。

酵母是制作冷凍面團的重要原料。由于酵母和面團需要同時進行冷凍和冷藏，因此存活率也是一個重要因素[5]。無論是在基礎研究還是在發(fā)展研究中，關于酵母在面食中的耐受機制的研究一直是酵母研究人員的重要課題之一[6]，并且耐凍藏酵母是冷凍生胚加工的關鍵。耐凍藏酵母必須在經過冷凍、解凍后仍然保持活力，以保證焙烤（或蒸制）產品的大小、形狀和口感等產品質量[7]。近年來，國內外許多研究者在利用自然篩選、誘變篩選、雜交等手段，馴化出了更多的抗凍性良好的酵母菌株[8]，但是將其應用到冷凍面制品中的研究還較少。

本研究以冷凍老面為原料，通過對老面中酵母菌的分離、鑒定及性能研究，以期篩選出一株性能優(yōu)良的耐凍藏酵母菌，改善冷凍面制品的風味，提高冷凍面制品的品質，為耐凍藏的冷凍面制品工業(yè)化生產提供一定的理論依據，促進冷凍面制品的工業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

冷凍老面：-18 ℃冰箱中冷凍60 d的老面。

1.1.2 化學試劑

麥芽浸粉、酵母膏、蛋白胨、瓊脂、糖發(fā)酵基礎液（均為生化試劑）：蘇州瑞測技術有限公司；葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖、棉籽糖、D-果糖、海藻糖等（均為分析純）：蘇州泰安生化有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母膏胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨，2%葡萄糖，2%瓊脂粉，pH 5.0，121 ℃滅菌20 min。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar，PDA）：2%葡萄糖，2%瓊脂粉，0.6%馬鈴薯浸粉，pH 5.6，115 ℃滅菌20 min。

麥芽汁培養(yǎng)基：麥芽浸粉13%，氯霉素0.01%，pH 5.6，121 ℃滅菌20 min。

無碳基礎培養(yǎng)基：1%蛋白胨，0.5%NaCl，pH 7.6，121 ℃滅菌20 min。

無氮合成培養(yǎng)基：酵母膏0.1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L，（NH4）2SO45 g，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

SCH-103電熱恒溫干燥箱、UJGT-70電熱恒溫培養(yǎng)箱、ESJI80-4電子天平、TYH2電熱恒溫水浴鍋：哈爾濱順城不銹鋼設備有限公司；SG-400高壓滅菌鍋、WS-600R振蕩培養(yǎng)箱、TG16-WS高速離心機：上海巴玖實業(yè)有限公司；UV-5200紫外分光光度儀：上海元析儀器有限公司；PHS-300酸度計：江蘇盛奧華環(huán)?？萍加邢薰荆籔roFlex聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增儀：上海山富科學儀器有限公司；

1.3 方法

1.3.1 耐凍藏酵母菌的篩選

將-18 ℃冰箱中冷凍60 d的老面，放在30 ℃的恒溫箱中發(fā)酵約1 h，用電子天平準確稱取1 g（精確至0.01 g）老面，加入9 mL無菌水中充分混勻，梯度稀釋（取10-4～10-7CFU/mL）至合適濃度后涂布于YPD培養(yǎng)基上，參照滕超等[9]的方法進行試驗。

1.3.2 耐凍藏酵母菌的鑒定

（1）菌落形態(tài)鑒定

菌落形態(tài)觀察[10]：觀察固體培養(yǎng)基中單菌落的菌落形態(tài)、顏色、大小等，并做好記錄。

（2）生理生化鑒定

碳源同化試驗：將活化1～2 d的酵母菌分別接種到蜜二糖、葡萄糖、纖維二糖等18種碳源的微量生理生化管中，30℃下培養(yǎng)1～2d，根據顏色的變化判斷哪種碳源可以同化。

氮源同化試驗[11]：將活化的酵母在無氮液體培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)3 d后，將無氮培養(yǎng)基中的菌在不同氮源的固體培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)，看是否長出菌。

糖發(fā)酵試驗[12]：選取葡萄糖、乳糖、海藻糖等8種糖，分別用無菌水配成質量分數12%的母液。按照每管4 mL無碳基礎培養(yǎng)液，1 mL母液，1 mL菌懸液的添加量，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，期間每天觀察杜氏小管內產氣量以及大試管內產酸情況。

1.3.3 耐凍藏酵母菌的性能測定

參照郭勇等[13-14]的方法進行產氣性能測試、耐酒精能力測試和耐酸能力測試；參照國標GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》中的方法[15]進行酵母菌的發(fā)酵能力測試；參照李春慧[16]的方法并略作修改進行耐凍藏能力測定：酵母菌AY003、AY005、AY007和AY026的菌液在-18 ℃的冰箱中保存60 d，每10 d取一次樣，并對活酵母菌計數，挑選30～300個之間的菌落數，然后計算單位活菌數（CFU/mL），以存活率表示酵母的耐凍藏能力。

1.3.4 菌種的分子生物學鑒定

按照肖新云等[17-18]的方法進行基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）的提取，使用18S rDNA通用引物（NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC；NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA）進行PCR擴增。擴增產物經電泳檢測，PCR產物經過純化后，送交測序公司進行測序。

將菌株的測序結果與美國生物技術信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）中的GenBank數據庫進行基本局部比對搜索工具（basic localalignmentsearch tool，BLAST）相似性分析，選擇近源菌種的18S rDNA序列進行比對，最后采用MEGA5.2軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析鑒定菌株與已知菌株的同源性[19]。

1.3.5 生長曲線的測定

參照耿瑞玲[20]的方法并稍作更改。挑選分離的單個菌落接種于裝液量為300 mL/1 000 mL的馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min搖床培養(yǎng)，每2 h取5 mL發(fā)酵液，用無菌蒸餾水稀釋3倍，于波長600 nm條件下以初始發(fā)酵液作為空白對照測定吸光度值（OD600nm值），繪制酵母菌的生長曲線。

2 結果與分析

2.1 耐凍藏酵母菌的篩選

表1 酵母菌的菌落及細胞形態(tài)特征Table 1 Colony and cell morphological characteristics of yeasts

根據酵母菌的個體形態(tài)、出芽方式和其他形態(tài)特征，參考滕超等[9]的方法從冰箱的冷凍面團中分離出酵母菌AY003、AY005、AY007、AY022、AY026、QY003，其菌落及細胞形態(tài)特征見表1。由表1可知，6株酵母菌的菌落均為乳白色，有光澤，不透明，邊緣形狀規(guī)則，菌落大小為1～6 mm之間，細胞形態(tài)特征為卵圓形或橢圓形，菌株AY005、AY007表面干燥，為周邊出芽，其余菌株表面濕潤，為單端出芽。

2.2 酵母菌的生理生化鑒定結果

2.2.1 碳源同化結果

碳源物質可以提供酵母菌生長所需的能量，也是組成其酵母菌結構的物質。不同的酵母菌對碳源的利用能力不同，將在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)好的菌株AY003、AY005、AY007、AY022、AY026、QY003種子液分別接入碳源發(fā)酵微量生理生化管內，30 ℃培養(yǎng)48 h，測試菌株對不同碳源同化能力，結果見表2。

表2 酵母菌的碳源同化試驗結果Table 2 Results of carbon source assimilation tests of yeasts

由表2可知，酵母AY005、AY007對碳源具有良好的同化能力，菌株AY005不能同化檸檬酸、甘油、肌醇、山梨糖醇；菌株AY007不能同化乳糖、D-木糖、肌醇、山梨糖醇；對碳源同化效果次之的是菌株AY022，剩下的酵母菌株AY003、AY026、QY003碳源同化能力較差。

2.2.2 氮源同化結果

酵母菌只能利用一些簡單的蛋白質的含氮化合物。將活化的酵母接種在無氮液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，將無氮培養(yǎng)3 d的菌株分別于含有不同氮源硝酸鉀、硫酸銨和亞硝酸鈉的固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，放在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，結果見表3。

表3 酵母菌的氮源同化試驗結果Table 3 Results of nitrogen source assimilation tests of yeasts

由表3可知，酵母菌AY003、AY005、AY007、AY022、AY026、QY003對氮源的同化能力比較相近，都可以利用硝酸鉀和硫酸銨這兩種氮源，不能利用亞硝酸鉀這種氮源。

2.2.3 糖發(fā)酵試驗結果

不同酵母菌會對糖類的利用有所差異，這可以用來鑒別酵母菌的一個方法。根據《酵母菌特征與鑒定手冊》[12]進行糖發(fā)酵試驗（D-果糖、乳糖、D-半乳糖、海藻糖、蔗糖、棉籽糖等），結果見表4。

表4 酵母菌糖發(fā)酵試驗結果Table 4 Results of sugar fermentation tests of yeasts

由表4可知，所有菌株對海藻糖和乳糖沒有作用；當菌株AY005使用蔗糖或麥芽糖作為碳源時，比其他碳源產氣產酸效果更好；菌株AY022以蔗糖、棉籽糖為碳源時，產氣產酸較強，相比于其他碳源發(fā)酵效果較好；菌株AY026、QY003對蔗糖、棉籽糖、葡萄糖和麥芽糖的發(fā)酵效果一般；菌株AY003對蔗糖無產氣現象；菌株AY007對棉子糖無產氣現象。

2.3 耐凍藏酵母菌性能測試結果

2.3.1 產氣性能測試結果

對分離到的6株菌株進行產氣性能測試，結果見表5。

表5 杜氏小管的產氣性能測試結果Table 5 Results of gas production performance tests of Duchenne tubules

由表5可知，有4株酵母菌株能產氣達到滿體積，說明AY003、AY005、AY007、AY026這4株菌的起酵能力比較強，產氣能力好，具有很高的發(fā)酵程度。選擇產氣效果較好的AY003、AY005、AY007、AY026菌株進行以下實驗。

2.3.2 耐酒精能力測試結果

對酵母菌株AY003、AY005、AY007、AY026進行為期7 d的耐酒精能力測試，“+”代表培養(yǎng)基菌落較少，“++”代表培養(yǎng)基有1/2菌落，“+++”代表培養(yǎng)基有2/3菌落，“-”代表培養(yǎng)基無菌落，耐酒精能力結果見表6。

表6 酵母菌耐酒精能力測試結果Table 6 Results of alcohol tolerance tests of yeasts

由表6可知，在酒精體積分數為8%、10%、12%的培養(yǎng)基中，AY003、AY005、AY007、AY026酵母菌均可以旺盛生長。然而，可以清楚地看出，當酒精體積分數增加至14%時，菌株AY003的耐受性差，停止生長。當酒精體積分數達到16%時，菌株AY005仍然維持正常生長，說明菌株AY005有較好的酒精耐受性，而菌株AY007的酒精耐受能力相比于菌株AY005來說略差。菌株AY026在酒精體積分數16%時停止生長。當酒精體積分數為18%時，4株菌株都停止生長。因此對于酒精的耐受性菌株AY005最好，菌株AY003最差。與陳勝等[21]高產耐酒精酵母的研究結果一致。

2.3.3 耐酸能力測試結果

在醒發(fā)面團的過程中，由于各種細菌（如醋酸菌和乳酸菌）的聯合作用通常伴隨著乳酸菌發(fā)酵、丁酸發(fā)酵等過程，所以面團的酸度會隨時間的增長不斷上升，pH值不斷下降，會直接抑制酵母菌的逐步生長[22]，使其發(fā)酵力降低。四株酵母AY003、AY005、AY007和AY026的耐酸能力測試結果見圖1。

圖1 酵母菌耐酸能力測試結果Fig.1 Results of acid tolerance tests of yeasts

由圖1可知，菌株AY003、AY005、AY007、AY026在pH 4.0～6.5的范圍內均能保持較好的生長趨勢（與接種于正常YPD培養(yǎng)基上的菌株的OD600nm值做比較），因此，這四株酵母菌在酸性環(huán)境中良好繁殖。當pH值降至2.5時，這四株菌株的生長繁殖受到顯著抑制，且AY003和AY007對pH值的變化較敏感。然而當pH為3.0時，四株菌株測定的OD600nm值仍＞0.5，推測這四株酵母可以更有利于面制品的醒發(fā)。

2.3.4 發(fā)酵力測試結果

酵母菌可以利用水解后的糖進行發(fā)酵，并產生大量的CO2、乙醛以及乙醇，使面制品產生獨特風味，大量的CO2可使面團膨脹，膨脹速率和產氣量通常被用作為酵母菌發(fā)酵能力的指標[23]。通過國標GB/T 20886—2007《食品加工用酵母》方法，測定菌株AY003、AY005、AY007和AY026的發(fā)酵力，結果見圖2。

圖2 不同酵母菌對發(fā)酵面團體積的影響Fig.2 Effect of different yeasts on fermented dough volume

由圖2可知，在發(fā)酵前30 min，酵母菌AY003、AY005、AY007和AY026的發(fā)酵面團體積膨脹程度較小，之后，曲線的斜率逐漸變大，體積增長速率相對穩(wěn)定，并且在發(fā)酵過程中體積相對平穩(wěn)地增加，這個結果與胡麗花等[23]的研究結果一致。因此，通過判斷認為篩選獲得的四株酵母菌株均具有良好的穩(wěn)定性。但是，菌株AY005的發(fā)酵力相比于其他3株菌株的發(fā)酵力較好，面團膨脹體積最大可至250 mL，發(fā)酵性能最優(yōu)。

2.3.5 耐凍藏能力測試結果

酵母菌AY003、AY005、AY007和AY026分別在-18 ℃保存10 d、20 d、30 d、40 d、50 d、60 d的活酵母菌數結果見圖3。

圖3 -18 ℃下保存時間對酵母菌生長的影響Fig.3 Effect of storage time on yeasts growth at -18 ℃

由圖3可知，4株菌的活酵母菌數隨貯藏時間的延長逐漸減少。0～40 d期間，4株菌的活酵母菌數都隨著時間的增加逐漸下降，40 d后活酵母菌數變化較少。菌株AY003的存活率由100%下降到50.6%；菌株AY007的存活率下降到51.3%；菌株AY026存活率下降到54.3%；菌株AY005的存活率由100%下降到62.5%，隨后酵母菌活力不變，活酵母菌數維持在5.03×107CFU/mL不再下降。相關研究表明，酵母通常不會在0 ℃以下或47 ℃以上增殖[15]。說明，菌株AY005相比其他3株菌株，在-18 ℃環(huán)境下儲存60 d，酵母菌存活率高，具有比較不錯的發(fā)酵活力，耐冷凍能力較高。因此，選擇菌株AY005為目標菌株。

2.4 分子生物學鑒定

通過雙向測序確定菌株AY005的18S rDNA D1/D2區(qū)域的序列。用Sequencher軟件拼接測得的DNA序列，將所獲得的序列通過BLAST在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列的搜索及相關信息的檢索，結果見圖4。

用MEGA5.2 Tree軟件構建18S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹，結果見圖4。

圖4 菌株AY005基于18S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree of strain AY005 based on 18S rDNA sequences

由圖4可知，菌株AY005與Saccharomyces cerevisiaeJCABSC23菌株為一支，同源性最近，結合兩者D1/D2序列一致性為100%，結合形態(tài)學觀察及生理生化試驗，菌株AY005被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

2.5 酵母菌生長曲線的繪制

多數酵母菌的生長包含四個階段：滯后期，對數生長期，穩(wěn)定生長期和衰變期。然而，每個階段的時間和酵母菌的種類有關。釀酒酵母AY005在30 ℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)，每2 h取5 mL菌液，用無菌蒸餾水稀釋3倍后，測量OD600nm值[24]。酵母菌AY005的生長曲線見圖5。

圖5 酵母AY005的生長曲線Fig.5 Growth curve of yeast AY005

由圖5可知，前4 h是釀酒酵母AY005的延滯期，是因為酵母處于新的生長環(huán)境中并且需要一些酶，輔酶和一些中間代謝物，為了適應新環(huán)境，為細胞分裂做準備[25]。在對滯后期進行短暫調整后，培養(yǎng)時間為4～16 h酵母進入快速分裂和繁殖階段的對數生長期，可將處于對數生長期的酵母做成干酵母應用于工業(yè)生產，具有一定的工業(yè)應用前景。培養(yǎng)時間為16～28 h是釀酒酵母AY005的穩(wěn)定期，新傳代的酵母幾乎與酵母菌死亡達到動態(tài)平衡。隨之，死亡酵母菌的數量逐漸超過新生酵母的數量，并且種群中的活細菌數量減少，并且曲線下降，培養(yǎng)時間為28～48 h是釀酒酵母AY005的衰亡期[19]。

3 結論

本實驗從冷凍的老面中篩選得到一株耐凍藏酵母菌AY005，產氣效果好，發(fā)酵力佳，面團膨大體積最大達到250 mL，在-18 ℃環(huán)境下儲存60 d存活率為62.5%，表現出較好的耐凍藏能力，經形態(tài)學、生理生化和18S rDNA序列分析被鑒定為釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），發(fā)現4～16 h為其對數生長期，可將處于對數生長期的酵母做成干酵母應用于工業(yè)生產，具有一定的工業(yè)應用前景。本實驗對耐凍藏酵母菌AY005在冷凍面制品的應用提供了一定的理論基礎，其抗凍機理還有待進一步研究。