張華東，韓 經(jīng)，魏曉慶，劉 琳，郭學(xué)武，肖冬光*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457；2.棗莊學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，山東 棗莊 277160）

白酒是世界六大蒸餾酒之一，其獨(dú)特的釀造方式造就了白酒不同的風(fēng)格與特征，其顯著特點(diǎn)是固態(tài)純糧混菌發(fā)酵[1]。在白酒生產(chǎn)過程中，釀酒微生物主要包括霉菌、酵母菌、細(xì)菌三大類[2]。其中乳酸菌貫穿白酒生產(chǎn)的始終，是白酒生產(chǎn)中一類十分重要的微生物，乳酸菌可以促進(jìn)發(fā)酵過程中的美拉德反應(yīng)[3]，有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌對(duì)釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的生長有抑制作用[4-7]，但是乳酸菌可以促進(jìn)釀酒酵母風(fēng)味物質(zhì)的代謝[8-9]。乳酸菌產(chǎn)生的乳酸能使白酒的刺激性氣味減少，增加白酒的風(fēng)味[10]，而且乳酸可以與乙醇酯化形成乳酸乙酯，乳酸乙酯是各種白酒中十分重要的香味物質(zhì)。無論是在制曲還是發(fā)酵過程中，都可以檢測到乳酸菌，乳酸菌中又以乳桿菌居多[11-12]，這和乳桿菌對(duì)高溫、高酒精度和酸度的良好耐性有關(guān)系[13-14]。

我國白酒的生產(chǎn)需要依靠酒曲及環(huán)境中多種微生物的共同作用，其中酵母菌在發(fā)酵過程中起主導(dǎo)作用[15]。酵母菌分為釀酒酵母和非釀酒酵母，在白酒生產(chǎn)過程中，釀酒酵母是負(fù)責(zé)酒精發(fā)酵的主體菌，非釀酒酵母雖然酒精發(fā)酵能力不如釀酒酵母[16]，但大多數(shù)能夠高產(chǎn)乙酸酯類。酵母代謝產(chǎn)生的乙酸乙酯是很多香型白酒的主體香味物質(zhì)，乙酸異戊醇和乙酸異丁酯具有水果的芳香。而高級(jí)醇是酵母酒精發(fā)酵的副產(chǎn)物，常見的高級(jí)醇主要包括正丙醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、苯乙醇，白酒中適量的高級(jí)醇能使酒體豐滿協(xié)調(diào)，給人柔和的香氣，高級(jí)醇含量較低時(shí)就會(huì)導(dǎo)致酒中香氣較淡而且酒體顯得單??；當(dāng)高級(jí)醇含量過高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致酒體中有不愉快的異雜味，并且更容易使人“上頭”[17]。

白酒生產(chǎn)是微生物相互作用的結(jié)果，研究微生物相互作用對(duì)白酒釀造技術(shù)的進(jìn)步有著重要的意義[18]。實(shí)驗(yàn)室前期通過分子生物學(xué)手段構(gòu)建了一株高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15，能夠高產(chǎn)乙酸酯類，且酒精發(fā)酵能力與普通釀酒酵母相當(dāng)。將高產(chǎn)酯釀酒酵母與植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）在高粱汁中混合發(fā)酵，采用同步接種的方法，研究植物乳桿菌對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酯醇代謝的影響，為白酒生產(chǎn)中高產(chǎn)酯釀酒酵母的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)，探明高產(chǎn)酯釀酒酵母與植物乳桿菌協(xié)同發(fā)酵的代謝機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種和原料

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）：本實(shí)驗(yàn)室從老白干酒醅中分離獲得；高產(chǎn)酯釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）MY-15（CGMCC No.5635）：天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。玉米粉：市售；澳洲高粱：北京紅星二鍋頭有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

硫酸鎂、硫酸銨、磷酸氫二鉀（均為分析純）：天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠；牛肉膏、酵母膏、蛋白胨（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；一水葡萄糖（分析純）：天津光復(fù)精細(xì)化工有限公司；耐高溫α-淀粉酶（酶活1×105U/mL）、糖化酶（酶活2.9×105U/mL）、酸性蛋白酶（酶活5×104U/mL）：諾維信（中國）生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

釀酒酵母種子培養(yǎng)基（玉米水解液）：玉米粉與水按照料液比1∶4（g∶mL）混合，添加耐高溫α-淀粉酶（10 U/g原料）90 ℃水浴作用1 h，然后繼續(xù)加熱煮沸30 min，之后補(bǔ)水至原體積，立即降溫到60 ℃，添加糖化酶（250 U/g原料）在60 ℃水浴作用4 h，然后用4層紗布過濾，調(diào)節(jié)糖度為12°Bx，添加硫酸銨6 g/L，硫酸鎂1.2 g/L，磷酸氫二鉀2.4 g/L，115 ℃高溫滅菌20 min，備用。

釀酒酵母發(fā)酵培養(yǎng)基：高粱粉與水按照料水比1∶3（g∶mL）混合，液化糖化步驟同玉米粉水解液，糖化完成后降溫到40 ℃，添加酸性蛋白酶（30 U/g原料），水浴作用4 h，然后用4層紗布過濾，得澄清高粱汁，調(diào)節(jié)到所需糖度，115℃高溫滅菌20 min，備用。

乳酸菌種子培養(yǎng)基：MRS培養(yǎng)基[19]。

乳酸菌發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的MRS培養(yǎng)基。

1.2 儀器與設(shè)備

MS204S電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；1200系列高效液相色譜儀、7890B型氣相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；XMTB型電熱恒溫水浴鍋：天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)器材有限公司；H1650-W型高速冷凍離心機(jī)：湖南湘儀科技有限公司；BX43型生物顯微鏡：日本OLYMPUS會(huì)社。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 植物乳桿菌的培養(yǎng)

植物乳桿菌的活化：取一環(huán)保藏于斜面上的植物乳桿菌接種于裝有5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

植物乳桿菌種子液的制備：將活化植物乳桿菌培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝液量為100 mL/250 mL MRS液體培養(yǎng)基中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

將植物乳桿菌種子液按10%（V/V）的接種量轉(zhuǎn)接于裝有葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的MRS培養(yǎng)基三角瓶中，裝液量為100 mL/250 mL，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)3 d，得植物乳桿菌發(fā)酵液。

1.3.2 高產(chǎn)酯釀酒酵母種子液的培養(yǎng)

高產(chǎn)酯釀酒酵母的活化：取一環(huán)保藏于斜面上的高產(chǎn)酯釀酒酵母接種于裝有5 mL玉米水解液的試管中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)24 h。

高產(chǎn)酯釀酒酵母種子液的制備：將活化好的釀酒酵母培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接于裝液量為100 mL/250 mL玉米水解液中，30 ℃條件下靜置培養(yǎng)16 h。

1.3.3 植物乳桿菌菌懸液對(duì)釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

取植物乳桿菌二級(jí)種子培養(yǎng)液150mL，于4℃、7000r/min條件下離心5 min，棄上清液，向沉淀中加入16°Bx高粱汁至總體積150 mL，振蕩混勻，制成植物乳桿菌菌懸液。然后將植物乳桿菌菌懸液按照4.0%、8.0%、12.0%、16.0%的接種量接種到裝有高粱汁培養(yǎng)基的三角瓶中，高產(chǎn)酯釀酒酵母種子液接種量均為8.0%，裝液量為130 mL/250 mL，30 ℃靜置發(fā)酵72 h。

1.3.4 植物乳桿菌種子培養(yǎng)液對(duì)釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

將培養(yǎng)好植物乳桿菌種子液按照4.0%、8.0%、12.0%、16.0%的接種量接種到裝有高粱汁培養(yǎng)基的三角瓶中，高產(chǎn)酯釀酒酵母種子液接種量均為8.0%，裝液量為130 mL/250 mL，30 ℃靜置發(fā)酵72 h。

1.3.5 不同乳酸質(zhì)量濃度對(duì)釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

取培養(yǎng)好的植物乳桿菌發(fā)酵液300 mL，4 ℃、7 000 r/min離心5 min取上清液，用上清液配制成不同乳酸含量的高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基（見表1），高產(chǎn)酯釀酒酵母種子液接種量均為8.0%，裝液量為130 mL/250 mL，30 ℃靜置發(fā)酵72 h。

表1 含有不同乳酸含量的高粱汁發(fā)酵培養(yǎng)基配方Table 1 Formula of sorghum juice fermentation medium with different lactic acid contents

1.3.6 分析方法

乳酸檢測：采用高效液相色譜法。其色譜條件如下：HPX-87H色譜柱（300 mm×7.8 mm×9 μm），紫外（ultra violet，UV）檢測器，流動(dòng)相為5 mmol/L的稀硫酸溶液，柱溫60 ℃，流速為0.6 mL/min，檢測波長210 nm，檢測時(shí)間23 min，進(jìn)樣量20 μL。

高級(jí)醇、乙酸酯檢測：采用氣相色譜法。其色譜條件如下：氫火焰離子檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID），載氣為高純氮?dú)猓∟2），LZP930白酒分析專用毛細(xì)管柱（50 m×0.32 mm×0.25 μm），進(jìn)樣量1 μL，分流比10∶1，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測器溫度230 ℃，氫氣流量40 mL/min，空氣流量300 mL/min，柱流量0.8 mL/min。程序升溫，50 ℃保持8 min，然后以5 ℃/min速率升溫至200 ℃保持5 min。

殘?zhí)橇康臏y定：菲林試劑法[20]；酵母菌數(shù)：血球計(jì)數(shù)板法[21-22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

植物乳桿菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15生長和酒精發(fā)酵的影響結(jié)果見表2。由表2可知，不同植物乳桿菌菌懸液添加量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母發(fā)酵過程的酵母細(xì)胞數(shù)、最終乙醇產(chǎn)量和發(fā)酵殘?zhí)橇繘]有明顯差異，乙醇含量在73.77～74.20 g/L，殘?zhí)橇吭?.01～4.21 g/L，說明植物乳桿菌對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母的生長及酒精發(fā)酵沒有直接影響。

表2 不同植物乳桿菌菌懸液添加量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母生長和酒精發(fā)酵的影響Table 2 Effects of different suspension addition of Lactobacillus plantarum on the growth of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae and alcoholic fermentation

植物乳桿菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15主要風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，植物乳桿菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15酯代謝有一定影響，與對(duì)照（植物乳桿菌菌懸液接種量為0時(shí)）相比，植物乳桿菌菌懸液接種量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%，乙酸乙酯分別減少了4.45%、15.83%、12.94%、15.31%；乙酸異戊酯分別減少了10.12%、17.74%、8.41%、15.54%；植物乳桿菌菌懸液各接種量下乙酸異丁酯的影響不明顯，乙酸異丁酯含量在11.32～12.11 mg/L?？赡茉蚺c其含量相對(duì)較低有關(guān)。植物乳桿菌菌懸液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15高級(jí)醇代謝的影響各有不同，這與各高級(jí)醇不同的代謝途徑有關(guān)。其中對(duì)苯乙醇和活性戊醇的影響最為明顯，與對(duì)照（植物乳桿菌菌懸液接種量為0時(shí)）相比，植物乳桿菌菌懸液接種量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%時(shí)，苯乙醇含量分別下降了34.58%、36.78%、39.45%、42.17%，活性戊醇含量分別下降了21.58%、23.52%、26.97%、34.83%；對(duì)正丙醇和異丁醇含量的影響相對(duì)較低，植物乳桿菌菌懸液接種量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%時(shí)，正丙醇分別下降了14.89%、21.77%、17.16%、14.76%，異丁醇分別下降了9.34%、14.55%、19.52%、17.15%；各添加量對(duì)異戊醇的影響不明顯。

圖1 不同植物乳桿菌菌懸液添加量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母主要風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.1 Effects of different suspension addition of Lactobacillus plantarum on major flavor substances of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae

2.2 植物乳桿菌種子液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

植物乳桿菌種子培養(yǎng)液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母生長和酒精發(fā)酵的影響結(jié)果見表3。由表3可知，發(fā)酵12 h時(shí)，添加植物乳桿菌種子培養(yǎng)液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母的生長有所抑制，酵母數(shù)分別下降20%、20%、30%、33%；而發(fā)酵到24 h時(shí)，即使添加了植物乳桿菌種子培養(yǎng)液，酵母數(shù)量與對(duì)照（植物乳桿菌種子液接種量為0時(shí)）相比也無顯著差異，酵母數(shù)量在（1.90～2.10）×109CFU/mL，說明添加植物乳桿菌種子培養(yǎng)液后，前12 h高產(chǎn)酯釀酒酵母生長緩慢，這和植物乳桿菌與酵母競爭營養(yǎng)物質(zhì)有關(guān)，而在發(fā)酵12～24 h時(shí)，高產(chǎn)酯釀酒酵母逐漸成為優(yōu)勢菌群，進(jìn)入了生長旺盛期。添加植物乳桿菌種子液對(duì)發(fā)酵結(jié)束高產(chǎn)酯釀酒酵母乙醇產(chǎn)量有略微提高，相應(yīng)的發(fā)酵結(jié)束后的殘?zhí)橇坑兴档停谥参锶闂U菌種子液接種量為0時(shí)，釀酒酵母乙醇產(chǎn)量為74.08 g/L；在植物乳桿菌種子液接種量為16.0%時(shí)，釀酒酵母乙醇產(chǎn)量為76.77 g/L。

表3 不同植物乳桿菌種子液添加量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母生長和酒精發(fā)酵的影響Table 3 Effects of different seed solution addition of Lactobacillus plantarum on the growth of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae and alcoholic fermentation

植物乳桿菌種子液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15主要風(fēng)味物質(zhì)的影響結(jié)果見圖2。

圖2 不同植物乳桿菌種子液添加量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母主要風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.2 Effects of different seed solution addition of Lactobacillus plantarum on major flavor substances of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae

由圖2可知，植物乳桿菌種子液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15酯代謝有一定影響，當(dāng)植物乳桿菌種子液添加量為16.0%時(shí)，乙酸乙酯含量變化最大，增加了39.82%。在植物乳桿菌種子液各添加量下對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母乙酸異丁酯和乙酸異戊酯的產(chǎn)量影響不大。植物乳桿菌種子培養(yǎng)液對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15高級(jí)醇代謝的影響各有不同，正丙醇隨著植物乳桿菌種子培養(yǎng)液添加量的增加而增加，在植物乳桿菌種子液添加量為16.0%時(shí)，正丙醇含量增加31.67%；異丁醇和異戊醇含量在植物乳桿菌種子液接種量為16.0%時(shí)稍有下降，下降了8.4%；活性戊醇和苯乙醇含量都是隨著植物乳桿菌種子培養(yǎng)液添加量的增加而減少，在植物乳桿菌種子培養(yǎng)液添加量為4.0%、8.0%、12.0%、16.0%時(shí)，與對(duì)照（植物乳桿菌種子液接種量為0）相比，苯乙醇含量分別下降了30.34%、49.3%、59.24%、65.92%；活性戊醇含量分別下降了18.85%、29.96%、36.26%、46.03%。

2.3 不同乳酸含量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響

培養(yǎng)基內(nèi)不同乳酸含量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15生長及酒精發(fā)酵的影響結(jié)果見表4。由表4可知，發(fā)酵12 h和24 h時(shí)，培養(yǎng)基內(nèi)乳酸質(zhì)量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時(shí)，釀酒酵母數(shù)量下降明顯，酵母數(shù)量下降明顯，與對(duì)照相比，發(fā)酵12 h時(shí)，酵母數(shù)分別下降19.21%和27.81%；發(fā)酵24 h時(shí)，酵母數(shù)分別下降9.47%和13.61%，說明在培養(yǎng)基內(nèi)乳酸質(zhì)量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時(shí)對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母前24 h的生長有所抑制。與對(duì)照相比，培養(yǎng)基內(nèi)乳酸質(zhì)量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時(shí)釀酒酵母乙醇產(chǎn)量有所提高，分別提高了1.56%和5.64%。

表4 不同乳酸含量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母生長和酒精發(fā)酵的影響Table 4 Effects of different lactic acid contents on the growth of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae and alcoholic fermentation

培養(yǎng)基內(nèi)不同初始乳酸含量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母主要風(fēng)味物質(zhì)代謝的影響見圖3。由圖3可知，培養(yǎng)基內(nèi)不同初始乳酸含量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母MY-15酯代謝有一定影響，與對(duì)照相比，當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)乳酸質(zhì)量濃度為5.3 g/L和7.1 g/L時(shí)，釀酒酵母乙酸乙酯含量增加了39.51%和39.49%。乙酸異戊酯隨著培養(yǎng)基內(nèi)乳酸含量的增加而減少，與對(duì)照相比，培養(yǎng)基內(nèi)初始乳酸含量為1.8 g/L、3.5 g/L、5.3 g/L、7.1 g/L時(shí)釀酒酵母乙酸異戊酯分別減少了21.27%、25.89%、30.65%、39.97%。培養(yǎng)基內(nèi)不同初始乳酸含量對(duì)釀酒酵母MY-15高級(jí)醇代謝的影響各有不同，正丙醇隨著培養(yǎng)基內(nèi)植物乳桿菌發(fā)酵液的增多而增多，在培養(yǎng)基內(nèi)初始乳酸質(zhì)量濃度為1.8 g/L、3.5 g/L、5.3 g/L、7.1 g/L時(shí)，與對(duì)照相比，正丙醇含量增加了20.28%、40.11%、50.21%、70.33%。釀酒酵母異丁醇含量在培養(yǎng)基內(nèi)初始乳酸濃度為1.8 g/L、3.5g/L時(shí)，與對(duì)照相比有所增加，分別增加了11.23%和8.79%，而當(dāng)培養(yǎng)基內(nèi)初始乳酸質(zhì)量濃度為5.3 g/L、7.1 g/L時(shí)，釀酒酵母異丁醇含量與對(duì)照相比分別降低了14.23%和19.5%。釀酒酵母異戊醇和苯乙醇含量隨著培養(yǎng)基內(nèi)乳酸質(zhì)量濃度的增加而逐漸降低，與對(duì)照相比，異戊醇含量分別下降了16.67%、33.33%、41.67%、75.01%；苯乙醇含量分別下降了25.05%、48.65%、62.35%、75.64%，這可能與培養(yǎng)基內(nèi)酸濃度的增高及培養(yǎng)基中各氨基酸的含量不同有關(guān)系。

圖3 不同乳酸含量對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母主要風(fēng)味物質(zhì)的影響Fig.3 Effects of different lactic acid contents on major flavor substances of high-yield ester Saccharomyces cerevisiae

3 結(jié)論

該研究在高粱汁培養(yǎng)基內(nèi)同時(shí)接種植物乳桿菌（Lac tobacillusplantarum）和高產(chǎn)酯釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae），探究植物乳桿菌及其代謝產(chǎn)物對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵及酯醇代謝的影響。結(jié)果表明，植物乳桿菌菌懸液及種子液各接種量下對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母生長及酒精發(fā)酵的影響不大，發(fā)酵72 h后殘?zhí)橇慷荚? g/L以內(nèi)，乙醇產(chǎn)量為74～78 g/L，但植物乳桿菌菌懸液及種子液使高產(chǎn)酯釀酒酵母乙酸酯和高級(jí)醇產(chǎn)量降低。培養(yǎng)基內(nèi)含有少量乳酸（質(zhì)量濃度1.8～7.1 g/L）能夠使高產(chǎn)酯釀酒酵母乙酸酯產(chǎn)量提高，并且降低高級(jí)醇的產(chǎn)量，尤其是苯乙醇的產(chǎn)量下降明顯。

白酒生產(chǎn)是多菌群混合發(fā)酵，發(fā)酵過程中參與的微生物種類繁多，而且不同的微生物對(duì)釀酒酵母的影響各有不同，本實(shí)驗(yàn)研究了植物乳桿菌對(duì)高產(chǎn)酯釀酒酵母酒精發(fā)酵、乙酸酯及高級(jí)醇代謝的影響，為高產(chǎn)酯釀酒酵母的實(shí)際應(yīng)用提供了理論依據(jù)，但想要透徹了解相互作用機(jī)理，還需從轉(zhuǎn)錄組學(xué)及分子生物學(xué)進(jìn)行更深層次的研究。