劉少寧，李有志，王艷芬，李淑花，王燕，徐恩民

(山東省獸藥質(zhì)量檢驗(yàn)所，山東省畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250022)

多拉菌素(Doramectin)是新一代大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥物，屬伊維菌素的衍生物。主要用于治療胃腸道蛔蟲(chóng)，肺蠕蟲(chóng)，眼絲蟲(chóng)，虱和疥螨等引起的寄生蟲(chóng)病[1-2]。固相萃取技術(shù)(solid phase extraction，SPE)是近年發(fā)展起來(lái)的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，其原理是利用組分與吸附劑(固定相)間選擇性吸附與選擇性洗脫的過(guò)程，達(dá)到提取分離、凈化和富集的目的。當(dāng)應(yīng)用于性狀為油狀的獸藥產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)，其分離效果較好。多拉菌素注射液性狀為無(wú)色或微黃色的油狀液體，收載在2017版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)品卷，標(biāo)準(zhǔn)【含量測(cè)定】中標(biāo)注的LC-Si固相萃取柱(4.6×150 mm，5 μm)難以購(gòu)買(mǎi)，且不適合常用固相萃取裝置，給檢測(cè)單位和企業(yè)帶來(lái)麻煩。本研究依據(jù)現(xiàn)行的多拉菌素注射液標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)含量測(cè)定中適用的固相萃取柱進(jìn)行考察試驗(yàn)，完善了多拉菌素注射液含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)[3]。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent1260型高效液相色譜儀；Waters Alliance E2695型高效液相色譜儀；色譜柱Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，150 mm×4.6 mm)；電子天平(型號(hào) BT125D)購(gòu)自德國(guó)賽托里斯公司。

1.2 試藥與試劑 多拉菌素對(duì)照品(批號(hào)為K0461411，標(biāo)識(shí)含量為95.6%)來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；多拉菌素注射液(批號(hào)：1812002 規(guī)格：50 mL：0.5 g)來(lái)源于山東魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)有限公司高新區(qū)分公司；多拉菌素注射液(批號(hào)：1812001 規(guī)格：100 mL：1 g)來(lái)源于齊魯動(dòng)物保健品有限公司；多拉菌素注射液(批號(hào)：PS185-1902001規(guī)格：50 mL：0.5 g)來(lái)源于艾美科健(中國(guó))生物醫(yī)藥有限公司；多拉菌素注射液(批號(hào)：D801SICN 規(guī)格：50 mL：0.5 g)來(lái)源于施維雅(青島)生物制藥有限公司。固相萃取小柱SupelcleanTM LC-Si 6 mL(500 mg)SPE Tubes購(gòu)自美國(guó)Supelco公司；固相萃取小柱Sep-Pak Vac 6cc(500 mg)Silica Cartridges購(gòu)自美國(guó)Waters公司；甲醇為色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)；水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 流動(dòng)相：甲醇-乙腈-水(67：15：18)；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)245 nm；柱溫：室溫；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取多拉菌素對(duì)照品10 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中，加甲醇70 mL溶解，加水5 mL，混勻，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取1812002批樣品(50 mL∶0.5 g)1 mL至10 mL容量瓶中，加二氯甲烷9 mL稀釋制成每1 mL中約含1 mg的溶液，精密量取2.5 mL，過(guò)LC-Si固相萃取柱(500 mg/6 mL)，依次用正己烷6.25 mL，二氯甲烷12.5 mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5 mL洗脫，洗脫液收集于25 mL量瓶中，加水1.25 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.2.3 空白溶液的制備 精密量取輔料溶液1 mL至10 mL容量瓶中，加二氯甲烷9 mL定容。精密量取2.5 mL，過(guò)LC-Si固相萃取柱(500 mg/6 mL)，依次用正己烷6.25 mL，二氯甲烷12.5 mL，洗脫，棄去洗脫液，再用甲醇5 mL洗脫，洗脫液收集于25 mL量瓶中，加水1.25 mL，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。

2.3 系統(tǒng)適用性和專(zhuān)屬性試驗(yàn) 精密量取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液各20 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定，理論塔板數(shù)結(jié)果為6454，供試品溶液色譜圖中多拉菌素峰與對(duì)照品溶液色譜保留時(shí)間一致(圖1)。結(jié)果表明，系統(tǒng)適用性可以滿足檢測(cè)要求，供試品中其他成分對(duì)多拉菌素定量檢測(cè)無(wú)干擾，專(zhuān)屬性能滿足檢測(cè)要求。

圖1 專(zhuān)屬性試驗(yàn)色譜圖(A、B、C分別為多拉菌素對(duì)照品、 魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)多拉菌素注射液供試品、 魯抗舍里樂(lè)藥業(yè)多拉菌素注射液輔料)Fig 1 HPLC chromatograms of specific test

2.4 線性關(guān)系考察 取多拉菌素對(duì)照品貯備液(濃度約1 mg/mL)，分別精密吸取適量，配制濃度約0.01、0.03、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/mL的系列溶液，按上述色譜條件，分別進(jìn)樣20 μL，測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)(X)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y= 4E+07x+ 56549(R2=1)，結(jié)果表明進(jìn)樣濃度在0.01～0.8 mg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.5 準(zhǔn)確度 采用加標(biāo)回收的方法，在空白輔料溶液中，按工藝加入一定質(zhì)量的多拉菌素對(duì)照品，分別配制80%、100%、120%濃度的多拉菌素注射液，分別制備3份。按2.1項(xiàng)色譜條件測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率及RSD(表1)。結(jié)果表明：在三個(gè)濃度水平下，多拉菌素注射液回收率為100.2%，符合注射液回收率98%～101%的范圍要求，證實(shí)了該方法具有良好的準(zhǔn)確度。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Result of recovery test

2.6 精密度

2.6.1 儀器精密度 取2.2.1項(xiàng)對(duì)照品溶液，精密量取20 μL，按2.1項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)得多拉菌素峰面積RSD為0.2%，表明儀器有良好的精密度。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 儀器精密度試驗(yàn)Tab 2 Result of instrument precision test

2.6.2 重復(fù)性 取供試品(批號(hào)為1812002)注射液，按2.2.2項(xiàng)方法配制6份樣品溶液，按2.1項(xiàng)色譜條件，每份樣品進(jìn)樣2次，結(jié)果含量平均值為104.6%，RSD為0.9%。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)Tab 3 Result of repeatability test

2.6.3 中間精密度 取供試品(批號(hào)為1812002)注射液，換由另一位操作者按2.2.2項(xiàng)方法配制6份樣品溶液，選用Waters Alliance E2695液相色譜儀，Waters X-bridge C18色譜柱按2.1項(xiàng)色譜條件，每份樣品進(jìn)樣2次，結(jié)果含量平均值為103.8%，RSD為0.6%。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 中間精密度試驗(yàn)Tab 4 Result of intermediate precision test

2.7 耐用性

2.7.1 不同品牌固相萃取小柱耐用性試驗(yàn) 取供試品溶液按照2.2.2項(xiàng)方法考察市面上在售的兩款固相萃取小柱：①SupelcleanTMLC-Si 6 mL(500 mg)SPE Tubes；②Waters Sep-Pak Vac 6cc(500 mg)Silica Cartridges。測(cè)定結(jié)果詳見(jiàn)表5。由表5可見(jiàn)，兩個(gè)廠家的固相萃取柱對(duì)含量測(cè)定的結(jié)果差異不顯著。市售的這兩款固相萃取柱均能滿足實(shí)驗(yàn)要求。

表5 不同固相萃取柱測(cè)定多拉菌素含量Tab 5 Determination of Doramectin content by different SPE columns

2.7.2 方法耐用性試驗(yàn) 取1812002批樣品(50 mL∶0.5 g)，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，將色譜條件微小變動(dòng)進(jìn)行測(cè)試，考察方法的耐用性。結(jié)果表明該方法能夠耐受不同色譜柱、柱溫、流速等因素的小范圍變化，測(cè)得多拉菌素注射液中多拉菌素的含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明耐用性良好，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品(批號(hào)為1812002)的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，立即測(cè)定，再在2、4、8、12、16、20、24 h的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定，所測(cè)峰面積均與0 h比較，12 h內(nèi)相對(duì)偏差小于1%，提示樣品應(yīng)在12 h內(nèi)完成檢測(cè)。結(jié)果詳見(jiàn)表7。

表6 色譜條件微小變動(dòng)后的結(jié)果Tab 6 Results of minor changes in chromatographic conditions

表7 穩(wěn)定性試驗(yàn)Tab 7 Stability test

2.9 樣品含量測(cè)定 取不同廠家的樣品，按2.2項(xiàng)下方法制成供試品溶液，精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL，上機(jī)測(cè)定峰面積，通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算多拉菌素的含量，多拉菌素均在標(biāo)示量的90.0%～110%。結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 不同廠家樣品測(cè)定結(jié)果Tab 8 Results of samples from different manufacturers

3 討論與結(jié)論

3.1 色譜條件的選擇與確定 研究過(guò)程中對(duì)樣品的溶劑及色譜條件中流動(dòng)相、檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流速進(jìn)行了嚴(yán)格的選擇性考察。研究表明，甲醇-乙腈-水(67：15：18)作為流動(dòng)相，1.0 mL/min的流速在245 nm波長(zhǎng)下色譜峰分離效果好，峰形較好[4-6]。

3.2 樣品前處理方法的選擇 多拉菌素注射液性狀為無(wú)色或微黃色澄明油狀液體，是一類(lèi)抗寄生蟲(chóng)藥[7-9]。參考2017版《獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》化學(xué)品卷多拉菌素注射液含量測(cè)定項(xiàng)下前處理方法，本研究采用固相萃取小柱進(jìn)行樣品的前處理，降低了樣品的基質(zhì)背景，凈化和富集了目標(biāo)化合物，提高了樣品分析結(jié)果的可靠性和靈敏度[10-11]。結(jié)果證明該方法能夠較為完全地提取出多拉菌素注射液中的多拉菌素，并且方法的準(zhǔn)確度、精密度、穩(wěn)定性和耐用性均能達(dá)到檢測(cè)的要求[12-13]。

3.3 固相萃取小柱的選擇與啟示 固相萃取技術(shù)與傳統(tǒng)的液液萃取法相比，可提高藥物回收率，能更加有效的將藥物與干擾組分分離。商品化的固相萃取小柱(SPE柱)能夠?qū)崿F(xiàn)多樣品的平行處理，大大提高檢測(cè)的靈敏度。當(dāng)液體樣品溶液通過(guò)固相吸附層時(shí)，被測(cè)物被富集，再選用適當(dāng)強(qiáng)度溶劑沖去雜質(zhì)，然后用少量溶劑迅速洗脫被測(cè)物質(zhì)，從而達(dá)到快速分離凈化與濃縮的目的。需要注意的是：在選擇固相萃取柱時(shí)，要考慮固相吸附層的吸附能力，避免實(shí)際操作時(shí)出現(xiàn)過(guò)載現(xiàn)象。SPE柱應(yīng)用于多拉菌素注射液等油性獸藥產(chǎn)品時(shí)，能夠有效的將有效成分與雜質(zhì)進(jìn)行分離，并且重現(xiàn)性較高[14]。以往的研究中SPE柱多用于獸藥殘留的檢測(cè)，本試驗(yàn)對(duì)于其他分離效果不理想的獸藥產(chǎn)品的檢測(cè)提供了新的思路。

用高效液相色譜法測(cè)定多拉菌素注射液中多拉菌素的含量時(shí)，采用固相萃取小柱進(jìn)行前處理，方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確，回收率高，可有效控制該制劑中多拉菌素的含量。