何斌，吳利軍，陳夏冰，楊文海，邵志勇， 陳潔，金爾光，周華,李杰，劉志偉

(1.武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，武漢 430208；2.武漢市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，武漢 430000)

牛蒡子的主要有效成分為木脂素類(lèi)化合物，包括牛蒡苷和牛蒡苷元等，牛蒡苷在胃腸道微生物作用下轉(zhuǎn)化為牛蒡苷元發(fā)揮藥理作用，即牛蒡苷元為牛蒡子的直接有效成分[1-2]。牛蒡苷元具有抗炎[3]、抗病毒[4]、抗菌[5]、抗腫瘤[6]、抗糖尿病[7]等眾多藥理作用，具有良好的研發(fā)和應(yīng)用前景；試驗(yàn)研究了靜脈注射牛蒡甘元在仔豬體內(nèi)的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特征，為新獸藥的研發(fā)和臨床用藥提供理論依據(jù)和參考，為中獸藥現(xiàn)代化進(jìn)行有意義的探索。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及配制 牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：160509)含量≥98.1%，由上海融禾醫(yī)藥科技有限公司生產(chǎn)；準(zhǔn)確稱(chēng)取牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解加水定容，制備含牛蒡苷元1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備液；準(zhǔn)確稱(chēng)取牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品，丙二醇溶解加水定容，制備含牛蒡苷元10.0 mg/mL的注射液。乙腈、甲醇色譜級(jí)，購(gòu)自美國(guó) Themo公司；二氯甲烷、丙二醇等分析純，購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 儀器 1200型高效液相色譜儀，自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器，美國(guó)AgiLent公司；D3024R 高速離心機(jī)，SCILO-GEX公司；電子天平(±0.0001 g)，德國(guó)賽多利斯公司；N-EVAPTM111型氮吹儀，美國(guó)路易公司。

1.1.3 動(dòng)物 杜×長(zhǎng)×大三元仔豬8頭，雌雄各半，編號(hào)1-8號(hào)，體重：30.0±5.0 kg；購(gòu)于武漢博牧生物科技有限公司。試驗(yàn)前正常飼養(yǎng)觀察1周，自由飲水和采食，飼料為不含任何藥物的全價(jià)日糧。

1.2 方法

1.2.1 藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)設(shè)計(jì) 給藥前12.0 h 禁食，對(duì)每頭仔豬進(jìn)行稱(chēng)重，并采集血樣作為空白對(duì)照。1～8號(hào)仔豬以2.0 mg/kg.bw的牛蒡甘元耳靜脈注射給藥。靜脈注射給藥后，每頭仔豬于0.167、0.333、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0、12.0 h采血5.0 mL左右；所采集血樣置于已加肝素鈉的聚丙烯離心管中，以3000 r/min離心15.0 min分離血漿，取上清液于-20 ℃冷凍保存，待測(cè)定[12]。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為AgiLent SB-C18柱 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流動(dòng)相為甲醇：乙腈：水(31∶20∶49 V∶V∶V)；流速為0.8 mL/min；進(jìn)樣量為30 μL；柱溫為(30±0.1)℃[8-9]。

1.2.3 血漿樣品處理 將血漿樣品從-20 ℃冰箱中取出，室溫下自然解凍，準(zhǔn)確吸取0.5 mL于5.0 mL離心管中，加入2.0 mL二氯甲烷，渦旋振蕩60 s后以10 000 r/min離心10.0 min吸取二氯甲烷層，同法提取兩次，合并兩次二氯甲烷層，置于15.0 mL離心管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，殘?jiān)?00 μL流動(dòng)相溶解，10 000 r/min離心10.0 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后以30 μL進(jìn)樣分析，記錄色譜圖[10-11]。

1.2.4 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立 向7支5.0 mL聚丙烯離心管中各加入500 μL空白血漿，然后依次加入一系列已稀釋好的牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)工作液，得到藥物濃度依次為0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL的血漿樣品。分別按照血漿樣品處理方法處理，進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖。以測(cè)得的牛蒡苷元峰面積(x)為橫坐標(biāo)，濃度(y)為縱坐標(biāo)，建立血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，擬合回歸方程，求出相關(guān)系數(shù)(r)。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證 取空白血漿500 μL置于5.0 mL聚丙烯離心管中，然后依次加入已稀釋好的牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)工作液高、中、低三個(gè)濃度，充分混合均勻，配制成含牛蒡苷元濃度分別為5.0、1.0、0.1 μg/mL的血漿樣品，按照血漿處理方法進(jìn)行處理，進(jìn)行HPLC檢測(cè)分析，每個(gè)濃度一天內(nèi)設(shè)置5個(gè)平行進(jìn)行檢測(cè)，以考察日內(nèi)變異系數(shù)；連續(xù)重復(fù)檢測(cè)5 d，以測(cè)定日間變異系數(shù)。并計(jì)算方法的回收率、準(zhǔn)確度、精密度以及靈敏度。

1.2.6 豬血漿中藥物濃度的測(cè)定 將給藥后不同時(shí)間點(diǎn)獲得的血漿，按“血漿樣品的處理”方法處理后進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算牛蒡苷元的峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程，計(jì)算出血漿中牛蒡苷元的濃度。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 采用ExceL軟件分析處理方法學(xué)數(shù)據(jù)并繪制血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)及藥-時(shí)曲線(xiàn)圖；藥物動(dòng)力學(xué)模型擬合及參數(shù)計(jì)算均采用中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)專(zhuān)業(yè)委員會(huì)編制的3p97藥物動(dòng)力學(xué)軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛蒡苷元在血漿中的色譜行為 在本研究所建立的方法下，牛蒡苷元保留時(shí)間為14.0 min，峰形對(duì)稱(chēng)性良好，基線(xiàn)平穩(wěn)，與雜質(zhì)峰分離良好，檢測(cè)效率高?？瞻籽獫{色譜圖如圖1，空白血漿添加牛蒡苷元(1.0 μg/mL)色譜圖如圖2，樣品(0.55 μg/mL)血漿色譜圖如圖3。

圖1 空白血漿色譜圖Fig 1 Chromatogram of blank plasma

圖2 空白血漿中添加牛蒡苷元(1.0 μg/mL)色譜圖Fig 2 Chromatogram of plasma with arctigenin (1.0 μ g/mL)

圖3 給藥后血漿中牛蒡苷元(0.55μg/mL)色譜圖Fig 3 Chromatogram of arctigenin in plasma (0.55 μg/mL) after administration

2.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn) 由圖4可知，牛蒡苷元標(biāo)準(zhǔn)品在0.05～10.0 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=0.9998，線(xiàn)性方程為y=0.0265x-0.0328(x表示牛蒡苷元的峰面積；y表示牛蒡苷元在血漿中的濃度)。

圖4 牛蒡苷元在血漿中標(biāo)準(zhǔn)工作曲線(xiàn)Fig 4 Calibration curve of arctigenin in piglet plasma

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果 由表1和表2可知，牛蒡苷元在仔豬血漿中的最低檢測(cè)限為0.025 μg/mL，最低定量限為0.05 μg/mL。牛蒡苷元在0.05～5.0 μg/mL范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好，回歸方程為y=0.0264x-0.0295，相關(guān)系數(shù)為r=0.9998。該方法回收率大于83.35%，日內(nèi)變異系數(shù)均在3.51%以?xún)?nèi)，日間變異系數(shù)均在5.90%以?xún)?nèi)

表1 仔豬空白血漿中添加ACT的回收率和 日內(nèi)變異系數(shù)考察結(jié)果(n=5)Tab 1 Intra-day recovery and precision vaLues for the determination of ACT in pig plasma(n=5)

表2 仔豬空白血漿中添加ACT的回收率和 日間變異系數(shù)考察結(jié)果(n=5)Tab 2 Inter-day recovery and precision values for the determination of ACT in pig plasma(n=5)

2.4 藥物動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)結(jié)果 單劑量靜脈注射牛蒡苷元(2.0 mg/kg.bw)后，在仔豬體內(nèi)的血藥濃度如表3，主要藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表4，血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)如圖5。

表3 靜脈注射牛蒡苷元(2.0 mg/kg.bw)后在仔豬體內(nèi)的血藥濃度Tab 3 Blood concentration of arctigenin in piglets after intravenous injection (2.0 mg/kg.bw)

ND表示未檢出

表4 靜脈注射牛蒡苷元(2.0 mg/kg.bw) 后在仔豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)參數(shù)Tab 4 Pharmacokinetic parameters of arctigenin (2.0 mg/kg.bw) in piglets after intravenous injection

圖5 靜脈注射牛蒡苷元(2mg/kg)后在 仔豬體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間曲線(xiàn)Fig 5 Blood concentration-time curve of arctigenin in piglets after intravenous injection (2.0 mg/kg)

靜脈注射牛蒡苷元后，牛蒡苷元仔豬體內(nèi)的分布半衰期(t1/2α)為0.166±0.022 h、消除半衰期t1/2β為3.161±0.296 h，表觀分布容積(Vd)為0.231±0.033 L/kg，藥時(shí)曲線(xiàn)下面積(AUC)1.189±0.057μg·h·mL-1。

3 討論與結(jié)論

牛蒡苷元的色譜條件目前報(bào)道不多。在檢測(cè)波長(zhǎng)方面，選擇280 nm作為紫外檢測(cè)波長(zhǎng)。關(guān)于流動(dòng)相的選擇文獻(xiàn)報(bào)道的主要有以下幾種：乙腈：水(V∶V，32∶68)[8]；甲醇 ∶乙腈∶0.025 mol/L磷酸(V∶V∶V，40∶20∶40)[13]；甲醇 ∶0.5%磷酸水(V∶V，48∶52)[14]；甲醇 ∶乙腈 ∶水(V∶V∶V，40∶20∶40)[10]；甲醇 ∶水(V∶V，55∶45)[9]。在試驗(yàn)過(guò)程中，對(duì)以上流動(dòng)相均進(jìn)行了試驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)V(甲醇)∶V(水)=55∶45作為流動(dòng)相，牛蒡苷元的出峰時(shí)間較理想、峰型較好且與雜質(zhì)峰分離良好，但有時(shí)存在基線(xiàn)不穩(wěn)的情況；分析可能是甲醇和水在40%～60%的范圍內(nèi)由儀器自動(dòng)混合時(shí)極易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致基線(xiàn)不穩(wěn)，故對(duì)流動(dòng)相稍作更改，在流動(dòng)相中加入乙腈，并不斷調(diào)整各流動(dòng)相的比例，最終確定流動(dòng)相為甲醇 ∶乙腈 ∶水=31∶20∶49(V∶V∶V)時(shí)出峰時(shí)間理想，峰形較好，且與雜質(zhì)峰良好分離。

給仔豬靜脈注射牛蒡苷元后，牛蒡苷元仔豬體內(nèi)的血藥濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)符合無(wú)吸收二室模型，與呂佳報(bào)道[10]的家兔靜注牛蒡苷元無(wú)吸收單室模型有一定的差異；在仔豬體內(nèi)的分布半衰期t1/2α(0.166±0.022 h)較短，表觀分布容積Vd(0.307±0.033 L/kg)相對(duì)較小，表明靜注后牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)分布極為迅速，但分布組織相對(duì)較少，可能主要分布在主要分布在血液和細(xì)胞外液中[12]；消除半衰期t1/2β(3.161±0.296 h)相對(duì)較短，較家兔靜注牛蒡苷元0.87 h的消除半衰期長(zhǎng)，可能與動(dòng)物種屬有一定關(guān)系，表明牛蒡苷元靜脈注射后在仔豬體內(nèi)消除代謝也相對(duì)較快，與其分布組織較少有一定關(guān)系。

研究采用HLPC建立了仔豬血漿中牛蒡苷元的定量分析方法，該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、檢測(cè)時(shí)間短等特點(diǎn)，可應(yīng)用于牛蒡苷元新獸藥的臨床前藥物動(dòng)力學(xué)研究。研究了牛蒡苷元在仔豬體內(nèi)的藥物動(dòng)力學(xué)特征。結(jié)果表明：靜脈注射牛蒡苷元后，其在仔豬體內(nèi)的為無(wú)吸收二室模型，在仔豬組織中分布較少，半衰期短、能迅速?gòu)淖胸i血液中清除，發(fā)揮藥物作用時(shí)間較短，建議臨床使用時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加用藥次數(shù)。