班 磊， 張 婷

（1.榆林職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西榆林719000；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州310053）

近年來， 全球每年有數(shù)百萬的人死于水源性細(xì)菌引起的感染性疾病，因此，快速地檢測和準(zhǔn)確地識別水中致病菌對于全球公共安全和人類健康至關(guān)重要。而在各種水源性致病菌中，大腸桿菌的識別對于飲用水的微生物安全檢測意義重大（Zhao 等，2017）。 傳統(tǒng)的微生物檢測方法包括選擇性培養(yǎng)、 生物化學(xué)和血清學(xué)鑒定等 （Yin 等，2017；Martinez 等，2008），耗費(fèi)人力物力且觀察周期較長； 而分子檢測手段如酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）（Steiner 等，2010）、 側(cè) 流 免 疫 分 析 法（LFA）（Fraden 等，2016） 以及聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）（Ortiz 等，2011） 等， 這些方法雖然檢測快速、靈敏，但需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術(shù)人員。這些因素都限制了以上方法的推廣使用。

目前，β-半乳糖苷酶（β-GAL）是一種常見的特異性酶，通常用于酶比色法。 通過β-半乳糖苷酶與氯苯酚紅β-半乳糖苷（CPRG）發(fā)生特異性的酶-底物顯色反應(yīng)，由黃色變?yōu)樽霞t色，并進(jìn)行可視化的檢測與分析（Su 等，2013）。 納米技術(shù)的快速發(fā)展有助于開發(fā)新型的檢測裝置用于快速靈敏地檢測病原體。 針對現(xiàn)場即時快速檢測的設(shè)計應(yīng)考慮兩個關(guān)鍵問題。首先，在環(huán)境測試或臨床應(yīng)用中所需的檢測限（LOD）；其次，讀取數(shù)據(jù)時不需要使用昂貴的儀器。為了解決這些問題，本實(shí)驗(yàn)研究了一種基于酶與納米顆粒材料復(fù)合而成的比色生物傳感器， 旨在建立一種即時快速檢測水溶液中致病菌的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 β-半乳糖苷酶（大于500 U/mg）、氯苯酚紅β-半乳糖苷（CPRG）購自Sigma 公司；納米金顆粒（AuNPs）由實(shí)驗(yàn)室提供；實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)試劑均為分析純。 JEOL 100CX 電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Malvern Zetasizer Nano ZS 納米粒度電位儀 （英國馬爾文儀器有限公司）；8452A二極管陣列分光光度計 （中國惠普有限公司）；Bcn136O 型生物超凈工作臺（上海安亭科學(xué)儀器廠）；Delta320 pH 計 （上海三申醫(yī)療器械有限公司）； 超純水的制備采用Milli-Q 凈水系統(tǒng)；MicrofugeR16 離心機(jī)（美國貝爾曼庫爾特有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)原理 本研究設(shè)計的檢測方法主要由三個部分組成：（1）β-半乳糖苷酶：一種負(fù)離子酶（PI 4.6），用于信號放大；（2）氯酚紅β-D-半乳糖苷：一種顯色底物，用于比色反應(yīng)；（3）納米顆粒（NPs）：一種陽離子，能夠可逆地與β-GAL 結(jié)合，在不變性的情況下可以抑制該特異性酶。 當(dāng)菌體存在時，會與AuNPs 結(jié)合從而釋放β-GAL，β-半乳糖苷酶能水解其黃色的特異性酶底物CPRG，釋放糖苷配基氯酚紅形成紅色的顯色基團(tuán)。 本實(shí)驗(yàn)使用的AuNPs 已被季銨鹽配體所功能化，以提供高穩(wěn)定性、 生物相容性和可調(diào)節(jié)表面相互作用的頭， 所有這些都是穩(wěn)定和靈敏的比色生物傳感器所需的關(guān)鍵條件。 陰離子表面的菌體與陽離子顆粒表面結(jié)合從而取代了β-GAL，并伴隨著酶活性的恢復(fù)。

1.2.2 AuNPs 的制備 通過將3 μL 稀釋的陽離子金納米顆粒水溶液（AuNPs，5 μM）沉積到300目經(jīng)碳涂覆的銅網(wǎng)上來制備透射電子顯微鏡（TEM）所需的樣品。 在室溫下將樣品在空氣中干燥，在100 keV 的條件下獲得TEM 圖像，并使用Image J 圖像軟件進(jìn)行分析。 將200 多個AuNPs作為目標(biāo)樣品，以計算其平均直徑和尺寸分布。分別測量ZP、DLS 和AuNPs 的濃度，且每個樣品掃描6 次并計算平均值。

1.2.3 納米顆粒抑制作用的研究 分別使用NP1-NP4 進(jìn)行β-GAL 催化水解CPRG 底物的活性滴定。 研究使用0.5 nM β-GAL 進(jìn)行，該濃度為比色法提供了合理的反應(yīng)時間（約10 min）。 在實(shí)驗(yàn)中，將磷酸鹽緩沖溶液（5 mM，pH 7.4）中的β-GAL 與各種濃度的NP1-NP4 一同溫育15 min，然后將1.5 mM CPRG（最大值= 595 nm）加入到NP-酶復(fù)合物中，從而進(jìn)行抑制作用的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，選擇最佳的NP 配體。

1.2.4 溶液體系中細(xì)菌的檢測 在比色裝置的研究初期，使用大腸桿菌（XL1）作為模型分析物。 在初步的液體反應(yīng)條件研究中， 可以區(qū)分菌體濃度水平低至102CFU/mL （每個樣本平行樣為3 個，且進(jìn)行了3 次重復(fù)實(shí)驗(yàn)）。每個濃度不僅可以通過強(qiáng)度曲線和Vmax直方圖來識別， 還可以通過肉眼可見的顏色變化來識別，在顯色反應(yīng)（10 min）后立即拍攝的圖像顯示了這一色度效果。 隨后用革蘭氏陽性菌灰色鏈霉菌和枯草芽孢桿菌觀察到Vmax的類似變化。

1.2.5 微斑試紙條的制備 首先， 需要確定添加β-半乳糖苷酶與顯色底物CPRG 的最適含量。 在磷酸鈉緩沖液（5 mM，pH 7.4）中制備了納米顆粒和β-GAL 溶液。在活性測定中，β-GAL（0.5 nM)與不同濃度的NP1-NP4 孵育30 min， 加入1.5 mM的顯色底物， 并對β-GAL 的酶活性進(jìn)行了檢測。在200 μL β-GAL/AuNPs 溶 液 中 加 入5 μL 的CPRG（PB 緩沖液1.5 mm，5 μL），在預(yù)先確定的時間內(nèi)進(jìn)行相關(guān)的抑制研究。通過活性/抑制研究，得到了β-GAL/ AuNP 配合物的最佳濃度， 確定了β-GAL/AuNP 復(fù)合物的不同抑制特性后， 用β-GAL 和NP1-NP4 的化學(xué)計量比對細(xì)菌進(jìn)行測定。

1.2.6 微斑試紙條的性能測試 為了測試本研究在試紙條上的性能， 在pH 7.4 的GF/B 濾紙上添加了3 μL 的CPRG （25 mM）、 復(fù)合溶液和含有108～103CFU/mL 的大腸桿菌（XL1）菌液。 10 min后，用掃描儀進(jìn)行顯色圖像的獲取。 并用Image J圖像軟件進(jìn)行RGB 通道的平均灰度值的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs 的特性分析 計算ζ-勢（ZP）和動態(tài)光散射（DLS），結(jié)果用于表征納米顆粒和蛋白質(zhì)的電荷與流體動力學(xué)直徑DH （Zhang 等，2013；Zheng 等，2012；Zhang 等，2010）。將陽離子金納米顆粒溶解在磷酸鹽緩沖液（5 mM，pH 7.4）中以制備5 μM 的溶液。 用透射電子顯微鏡從200 粒納米粒子中測定了金屬核的平均尺寸， 用“平均直徑±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。 在pH 7.4、5 mM 磷酸鹽緩沖液中測定Zeta 電位。NP1-NP4 相關(guān)的表征數(shù)據(jù)測量結(jié)果如表1 所示。

表1 4 種納米顆粒的表征測量結(jié)果

2.2 納米顆粒抑制作用的分析 將標(biāo)準(zhǔn)化的一級生色底物水解速率（Vmax）相對于NP/β-GAL 摩爾比進(jìn)行作圖，以NP2 為例，在加入NP 后明顯降低（圖1）。 在活性/抑制研究中，得到了β-Gal/AuNP配合物的最佳濃度β-GAL=0.5 nM 時，納米粒子最適匹配量分別為NP1： 12 nM；NP2： 6 nM；NP3： 9 nM；NP4： 35 nM。 最終選擇NP2 作為最高親和力的酶抑制劑， 因?yàn)槠湓诜浅５偷臐舛认录纯梢种痞?GAL 活性并提供最低的LOD（圖2）。

圖1 加入NP2 后，對β-GAL 的抑制作用

圖2 不同納米顆粒NP 對LOD值的影響

本研究中， 含AuNP 的溶液各實(shí)驗(yàn)前均新鮮制備酶復(fù)合物， 在實(shí)驗(yàn)過程中和實(shí)驗(yàn)后均未觀察到明顯的沉淀或顏色變化。作為對照組，實(shí)驗(yàn)研究了經(jīng)過中性納米粒子NPTEG和負(fù)納米粒子NPCO2所功能化后對酶的抑制作用， 未見抑制作用的發(fā)生（圖3）。幾種酶-納米復(fù)合傳感器（β-GAL/NP2）對不同細(xì)菌濃度孵育的動力學(xué)吸光度的變化。 在嵌入體中，NPCO2和NPTEG是負(fù)的和中性的納米粒子，沒有觀察到相互作用。 以細(xì)菌（E.coli XL1）以及β-GAL 與底物進(jìn)行對照， 可觀察到溶液中顏色的變化。為作對照實(shí)驗(yàn)，又研究了NPCO2和NPTEG納米粒子、 細(xì)菌和α-GAL 在CPRG 溶液中的作用，并與NP2 作比較，沒有觀察到任何活性或顯色反應(yīng)， 說明此檢測方法只是由于酶對底物的水解所致。由圖4 可知，溶液相中革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的比色反應(yīng)顯示出， 三種致病菌濃度的變化率變化過程相似。 所以該檢測方法具有一定的廣譜性。

圖3 不同納米顆粒對細(xì)菌抑制作用

圖4 廣譜性分析

2.3 試紙條的制備與優(yōu)化 為了可在現(xiàn)場即時快速檢測，實(shí)驗(yàn)繼而進(jìn)行了微斑試紙條的制備。 這種檢測手段的關(guān)鍵問題是怎樣能夠產(chǎn)生快速且可重復(fù)操作。 而不同材料的紙張對于不同檢測方法的作用是不同的。 因此，實(shí)驗(yàn)廣泛試用了各種可用材料， 以保證酶的活性和效率不變以及酶的抑制和活性恢復(fù)過程的有效進(jìn)行。 在測試材料中，最終確定選用GF/B 無粘結(jié)微纖維濾紙作為檢測裝置的載體，具有濕強(qiáng)度高、承載能力強(qiáng)、響應(yīng)快等特點(diǎn)。 經(jīng)過相關(guān)的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)， 確定了在比色試紙條中分別滴加25 mM CPRG 和15 nM β-GAL，可在10 min內(nèi)發(fā)生顯色反應(yīng)。 隨后在相關(guān)抑制作用的研究中NPTEG和NPCO2作為對照，未觀察到抑制作用。 最終確定將β-GAL（15 nM）與NP2（80 nM）混合，使復(fù)合材料干燥15 min，最終生成NP2 配合物。在檢測裝置內(nèi)分別滴加25 mM CPRG 和15 nM β-GAL，使反應(yīng)以適當(dāng)?shù)乃俣冗M(jìn)行， 使底物的顏色在預(yù)定的時間內(nèi)（即10 min）由黃色變?yōu)榘导t色。

圖5 大腸桿菌的可視化檢測

2.4 水中大腸桿菌的可視化檢測 以大腸桿菌XL1 為例，進(jìn)行實(shí)際樣品的可視化測試實(shí)驗(yàn)。 如圖5 所示， 在103CFU/mL 濃度范圍內(nèi)可以觀察到明顯的視覺差異。為了對微斑試紙進(jìn)行定量評價， 對圖像的RGB 譜圖進(jìn)行了分析。 圖5 中的RGB 比色通道圖（n=4）確定了顯色反應(yīng)的有效性， 通過不同顏色通道下平均灰度值的計算，得到不同趨勢的分析結(jié)果，但都可分別進(jìn)行相關(guān)的定量分析。 最終確定該方法可檢測出103CFU/mL 的菌體濃度。

3 結(jié)論

基于酶-納米顆粒結(jié)合，提供快速、靈敏的致病菌比色試紙條。 通過NP 的優(yōu)化最終確定了NP2 為配體頭基， 該系統(tǒng)不僅可以在溶液體系內(nèi)反應(yīng)， 實(shí)驗(yàn)又將這一方法轉(zhuǎn)換成可視化微斑測試條模式， 為現(xiàn)場即時快速檢測提供了一種潛在的分析手段。 目前，針對大腸桿菌（XL1）模型進(jìn)行檢測，其靈敏度為103CFU/mL，但不同致病菌的檢測靈敏度可能因種而異。 未來將向多重快速檢測的方向發(fā)展， 以期在提高裝置靈敏度的同時可進(jìn)行多種致病菌的同時檢測并可定量分析。