班 磊， 張 婷

（1.榆林職業(yè)技術學院，陜西榆林719000；2.浙江中醫(yī)藥大學，浙江杭州310053）

近年來， 全球每年有數(shù)百萬的人死于水源性細菌引起的感染性疾病，因此，快速地檢測和準確地識別水中致病菌對于全球公共安全和人類健康至關重要。而在各種水源性致病菌中，大腸桿菌的識別對于飲用水的微生物安全檢測意義重大（Zhao 等，2017）。 傳統(tǒng)的微生物檢測方法包括選擇性培養(yǎng)、 生物化學和血清學鑒定等 （Yin 等，2017；Martinez 等，2008），耗費人力物力且觀察周期較長； 而分子檢測手段如酶聯(lián)免疫吸附分析法（ELISA）（Steiner 等，2010）、 側(cè) 流 免 疫 分 析 法（LFA）（Fraden 等，2016） 以及聚合酶鏈式反應（PCR）（Ortiz 等，2011） 等， 這些方法雖然檢測快速、靈敏，但需要昂貴的儀器和專業(yè)的技術人員。這些因素都限制了以上方法的推廣使用。

目前，β-半乳糖苷酶（β-GAL）是一種常見的特異性酶，通常用于酶比色法。 通過β-半乳糖苷酶與氯苯酚紅β-半乳糖苷（CPRG）發(fā)生特異性的酶-底物顯色反應，由黃色變?yōu)樽霞t色，并進行可視化的檢測與分析（Su 等，2013）。 納米技術的快速發(fā)展有助于開發(fā)新型的檢測裝置用于快速靈敏地檢測病原體。 針對現(xiàn)場即時快速檢測的設計應考慮兩個關鍵問題。首先，在環(huán)境測試或臨床應用中所需的檢測限（LOD）；其次，讀取數(shù)據(jù)時不需要使用昂貴的儀器。為了解決這些問題，本實驗研究了一種基于酶與納米顆粒材料復合而成的比色生物傳感器， 旨在建立一種即時快速檢測水溶液中致病菌的方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 β-半乳糖苷酶（大于500 U/mg）、氯苯酚紅β-半乳糖苷（CPRG）購自Sigma 公司；納米金顆粒（AuNPs）由實驗室提供；實驗所用化學試劑均為分析純。 JEOL 100CX 電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Malvern Zetasizer Nano ZS 納米粒度電位儀 （英國馬爾文儀器有限公司）；8452A二極管陣列分光光度計 （中國惠普有限公司）；Bcn136O 型生物超凈工作臺（上海安亭科學儀器廠）；Delta320 pH 計 （上海三申醫(yī)療器械有限公司）； 超純水的制備采用Milli-Q 凈水系統(tǒng)；MicrofugeR16 離心機（美國貝爾曼庫爾特有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗原理 本研究設計的檢測方法主要由三個部分組成：（1）β-半乳糖苷酶：一種負離子酶（PI 4.6），用于信號放大；（2）氯酚紅β-D-半乳糖苷：一種顯色底物，用于比色反應；（3）納米顆粒（NPs）：一種陽離子，能夠可逆地與β-GAL 結合，在不變性的情況下可以抑制該特異性酶。 當菌體存在時，會與AuNPs 結合從而釋放β-GAL，β-半乳糖苷酶能水解其黃色的特異性酶底物CPRG，釋放糖苷配基氯酚紅形成紅色的顯色基團。 本實驗使用的AuNPs 已被季銨鹽配體所功能化，以提供高穩(wěn)定性、 生物相容性和可調(diào)節(jié)表面相互作用的頭， 所有這些都是穩(wěn)定和靈敏的比色生物傳感器所需的關鍵條件。 陰離子表面的菌體與陽離子顆粒表面結合從而取代了β-GAL，并伴隨著酶活性的恢復。

1.2.2 AuNPs 的制備 通過將3 μL 稀釋的陽離子金納米顆粒水溶液（AuNPs，5 μM）沉積到300目經(jīng)碳涂覆的銅網(wǎng)上來制備透射電子顯微鏡（TEM）所需的樣品。 在室溫下將樣品在空氣中干燥，在100 keV 的條件下獲得TEM 圖像，并使用Image J 圖像軟件進行分析。 將200 多個AuNPs作為目標樣品，以計算其平均直徑和尺寸分布。分別測量ZP、DLS 和AuNPs 的濃度，且每個樣品掃描6 次并計算平均值。

1.2.3 納米顆粒抑制作用的研究 分別使用NP1-NP4 進行β-GAL 催化水解CPRG 底物的活性滴定。 研究使用0.5 nM β-GAL 進行，該濃度為比色法提供了合理的反應時間（約10 min）。 在實驗中，將磷酸鹽緩沖溶液（5 mM，pH 7.4）中的β-GAL 與各種濃度的NP1-NP4 一同溫育15 min，然后將1.5 mM CPRG（最大值= 595 nm）加入到NP-酶復合物中，從而進行抑制作用的優(yōu)化實驗，選擇最佳的NP 配體。

1.2.4 溶液體系中細菌的檢測 在比色裝置的研究初期，使用大腸桿菌（XL1）作為模型分析物。 在初步的液體反應條件研究中， 可以區(qū)分菌體濃度水平低至102CFU/mL （每個樣本平行樣為3 個，且進行了3 次重復實驗）。每個濃度不僅可以通過強度曲線和Vmax直方圖來識別， 還可以通過肉眼可見的顏色變化來識別，在顯色反應（10 min）后立即拍攝的圖像顯示了這一色度效果。 隨后用革蘭氏陽性菌灰色鏈霉菌和枯草芽孢桿菌觀察到Vmax的類似變化。

1.2.5 微斑試紙條的制備 首先， 需要確定添加β-半乳糖苷酶與顯色底物CPRG 的最適含量。 在磷酸鈉緩沖液（5 mM，pH 7.4）中制備了納米顆粒和β-GAL 溶液。在活性測定中，β-GAL（0.5 nM)與不同濃度的NP1-NP4 孵育30 min， 加入1.5 mM的顯色底物， 并對β-GAL 的酶活性進行了檢測。在200 μL β-GAL/AuNPs 溶 液 中 加 入5 μL 的CPRG（PB 緩沖液1.5 mm，5 μL），在預先確定的時間內(nèi)進行相關的抑制研究。通過活性/抑制研究，得到了β-GAL/ AuNP 配合物的最佳濃度， 確定了β-GAL/AuNP 復合物的不同抑制特性后， 用β-GAL 和NP1-NP4 的化學計量比對細菌進行測定。

1.2.6 微斑試紙條的性能測試 為了測試本研究在試紙條上的性能， 在pH 7.4 的GF/B 濾紙上添加了3 μL 的CPRG （25 mM）、 復合溶液和含有108～103CFU/mL 的大腸桿菌（XL1）菌液。 10 min后，用掃描儀進行顯色圖像的獲取。 并用Image J圖像軟件進行RGB 通道的平均灰度值的分析。

2 結果與分析

2.1 AuNPs 的特性分析 計算ζ-勢（ZP）和動態(tài)光散射（DLS），結果用于表征納米顆粒和蛋白質(zhì)的電荷與流體動力學直徑DH （Zhang 等，2013；Zheng 等，2012；Zhang 等，2010）。將陽離子金納米顆粒溶解在磷酸鹽緩沖液（5 mM，pH 7.4）中以制備5 μM 的溶液。 用透射電子顯微鏡從200 粒納米粒子中測定了金屬核的平均尺寸， 用“平均直徑±標準差”表示。 在pH 7.4、5 mM 磷酸鹽緩沖液中測定Zeta 電位。NP1-NP4 相關的表征數(shù)據(jù)測量結果如表1 所示。

表1 4 種納米顆粒的表征測量結果

2.2 納米顆粒抑制作用的分析 將標準化的一級生色底物水解速率（Vmax）相對于NP/β-GAL 摩爾比進行作圖，以NP2 為例，在加入NP 后明顯降低（圖1）。 在活性/抑制研究中，得到了β-Gal/AuNP配合物的最佳濃度β-GAL=0.5 nM 時，納米粒子最適匹配量分別為NP1： 12 nM；NP2： 6 nM；NP3： 9 nM；NP4： 35 nM。 最終選擇NP2 作為最高親和力的酶抑制劑， 因為其在非常低的濃度下即可抑制β-GAL 活性并提供最低的LOD（圖2）。

圖1 加入NP2 后，對β-GAL 的抑制作用

圖2 不同納米顆粒NP 對LOD值的影響

本研究中， 含AuNP 的溶液各實驗前均新鮮制備酶復合物， 在實驗過程中和實驗后均未觀察到明顯的沉淀或顏色變化。作為對照組，實驗研究了經(jīng)過中性納米粒子NPTEG和負納米粒子NPCO2所功能化后對酶的抑制作用， 未見抑制作用的發(fā)生（圖3）。幾種酶-納米復合傳感器（β-GAL/NP2）對不同細菌濃度孵育的動力學吸光度的變化。 在嵌入體中，NPCO2和NPTEG是負的和中性的納米粒子，沒有觀察到相互作用。 以細菌（E.coli XL1）以及β-GAL 與底物進行對照， 可觀察到溶液中顏色的變化。為作對照實驗，又研究了NPCO2和NPTEG納米粒子、 細菌和α-GAL 在CPRG 溶液中的作用，并與NP2 作比較，沒有觀察到任何活性或顯色反應， 說明此檢測方法只是由于酶對底物的水解所致。由圖4 可知，溶液相中革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的比色反應顯示出， 三種致病菌濃度的變化率變化過程相似。 所以該檢測方法具有一定的廣譜性。

圖3 不同納米顆粒對細菌抑制作用

圖4 廣譜性分析

2.3 試紙條的制備與優(yōu)化 為了可在現(xiàn)場即時快速檢測，實驗繼而進行了微斑試紙條的制備。 這種檢測手段的關鍵問題是怎樣能夠產(chǎn)生快速且可重復操作。 而不同材料的紙張對于不同檢測方法的作用是不同的。 因此，實驗廣泛試用了各種可用材料， 以保證酶的活性和效率不變以及酶的抑制和活性恢復過程的有效進行。 在測試材料中，最終確定選用GF/B 無粘結微纖維濾紙作為檢測裝置的載體，具有濕強度高、承載能力強、響應快等特點。 經(jīng)過相關的優(yōu)化實驗， 確定了在比色試紙條中分別滴加25 mM CPRG 和15 nM β-GAL，可在10 min內(nèi)發(fā)生顯色反應。 隨后在相關抑制作用的研究中NPTEG和NPCO2作為對照，未觀察到抑制作用。 最終確定將β-GAL（15 nM）與NP2（80 nM）混合，使復合材料干燥15 min，最終生成NP2 配合物。在檢測裝置內(nèi)分別滴加25 mM CPRG 和15 nM β-GAL，使反應以適當?shù)乃俣冗M行， 使底物的顏色在預定的時間內(nèi)（即10 min）由黃色變?yōu)榘导t色。

圖5 大腸桿菌的可視化檢測

2.4 水中大腸桿菌的可視化檢測 以大腸桿菌XL1 為例，進行實際樣品的可視化測試實驗。 如圖5 所示， 在103CFU/mL 濃度范圍內(nèi)可以觀察到明顯的視覺差異。為了對微斑試紙進行定量評價， 對圖像的RGB 譜圖進行了分析。 圖5 中的RGB 比色通道圖（n=4）確定了顯色反應的有效性， 通過不同顏色通道下平均灰度值的計算，得到不同趨勢的分析結果，但都可分別進行相關的定量分析。 最終確定該方法可檢測出103CFU/mL 的菌體濃度。

3 結論

基于酶-納米顆粒結合，提供快速、靈敏的致病菌比色試紙條。 通過NP 的優(yōu)化最終確定了NP2 為配體頭基， 該系統(tǒng)不僅可以在溶液體系內(nèi)反應， 實驗又將這一方法轉(zhuǎn)換成可視化微斑測試條模式， 為現(xiàn)場即時快速檢測提供了一種潛在的分析手段。 目前，針對大腸桿菌（XL1）模型進行檢測，其靈敏度為103CFU/mL，但不同致病菌的檢測靈敏度可能因種而異。 未來將向多重快速檢測的方向發(fā)展， 以期在提高裝置靈敏度的同時可進行多種致病菌的同時檢測并可定量分析。