葉永才，陳哲璇，李 想，譚偉江，楊豐華*，張良清*

(1.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科，廣東 湛江 524000；2.廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣東省實驗動物重點實驗室，廣州 510633)

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷是一種常見的病理過程，廣泛發(fā)生于急性心肌梗死、急性腎衰竭、腦中風等缺血缺氧性疾病過程[1]。I/R可引起組織器官的損傷和功能障礙，并帶來嚴重的并發(fā)癥，因而減輕I/R帶來的損傷對患者病情的好轉和康復至關重要。另外，隨著近年來醫(yī)療水平的提高，器官移植手術日益增多，如何減少器官移植過程帶來的I/R損傷也是亟待解決的問題。在組織器官I/R損傷中，線粒體因其在生成ATP以及在細胞凋亡中發(fā)揮關乎細胞存亡的關鍵作用而備受重視，許多促生存信號通路作用于線粒體這個終效應器來維持細胞膜的完整性并阻止細胞死亡[2]，因此，如何維持線粒體結構和功能成為減輕I/R損傷策略的關鍵點。

近年的研究結果表明環(huán)氧二十碳三烯酸(epoxyeicosatrienoic acids,EETs)是一種適合治療組織器官I/R損傷的成分。EETs是一類生物活性很強的脂質環(huán)氧化合物，已有許多研究證明EETs與心、腦、腎等重要器官的I/R過程密切相關，其中抗炎、抗凋亡等作用機制在EETs的I/R保護作用中發(fā)揮至關重要的作用，這與EETs介導的抗凋亡機制密切相關，同時線粒體途徑也是組織器官I/R損傷防治的重要靶標，因此線粒體途徑在EETs介導的I/R損傷保護作用中具有重要地位。然而作為I/R損傷防治的重要靶點，線粒體途徑在EETs介導的I/R損傷保護作用中卻未得到很深入的探討，并且分子機制仍未完全闡明。本文就線粒體途徑在EETs保護I/R損傷中的作用進行總結，并指出潛在的研究方向。

1 EETs的生物學功能

花生四烯酸(arachidonic acid，AA)是一種廣泛存在于人體內的多元不飽和脂肪酸，在體內的代謝途徑主要有3種，即環(huán)氧化酶途徑(cyclooxygenase pathway，COX)、脂氧合酶途徑(lipoxygenase pathways，LOX)和細胞色素P450途徑(cytochrome P450，CYP)。其中AA經(jīng)CYP途徑代謝后會產(chǎn)生EETs，主要包括5,6-EET、8,9-EET、11,12-EET和14,15-EET四種區(qū)域異構體[7]。體內的EETs可被可溶性環(huán)氧化物水解酶(soluble epoxide hydrolase,sEH)快速代謝成生物活性低的二羥基二十碳三烯酸(dihydroxyeico satetraenoic acids,DHETs)，其許多潛在有益作用也隨著被轉化為DHETs而減弱。研究發(fā)現(xiàn)EETs具有擴血管、抗炎、促纖溶、調節(jié)血管生長等多種生物學功能。同時，EETs作為許多組織信號通路的重要組成部分能增加細胞內促生存和抗凋亡信號通路的表達[8-9]。另外研究還發(fā)現(xiàn)抑制sEH的表達能減少內源性EETs的降解，在I/R損傷中起到保護作用[3-5]，因此提高體內EETs 的有效濃度成為研究EETs生物學作用及機制的研究方法。

2 組織器官缺血/再灌注損傷

組織器官缺血后重新得到血液再灌注在多數(shù)情況下可使組織器官功能得到恢復,但有時缺血后的再灌注反而加重組織器官的功能障礙和結構損傷，這種在缺血基礎上恢復血流后組織進一步的損傷，甚至不可逆性的現(xiàn)象稱為缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷[10]。組織器官I/R引起的缺氧會影響細胞ATP的產(chǎn)生，而ATP作為保證細胞各項生命活動的能量供應者，它的消耗會引發(fā)諸如膜離子泵衰竭、細胞鉀外流、細胞內和線粒體鈣超載等缺血性級聯(lián)反應[11]。另外組織器官I/R還會引起活性氧的產(chǎn)生、炎癥細胞的聚集、內質網(wǎng)應激和缺血后毛細血管無復流的發(fā)生。這些病理過程的發(fā)生最終會導致線粒體K+通道受損、線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)的開放以及線粒體結構異常[12]，最終導致細胞裂解和死亡。

3 EETs防治缺血/再灌注損傷的重要靶標：線粒體

EETs作為許多組織信號通路的重要組成部分能增加細胞內促生存和抗凋亡信號通路的表達[8-9]，能有效減輕組織器官的I/R損傷，其中線粒體是EETs防治I/R損傷的重要靶點。線粒體是具有雙膜結構的廣泛分布于細胞內的細胞器，它的主要作用是通過線粒體電子傳遞鏈經(jīng)氧化磷酸化以ATP的形式產(chǎn)生細胞能量，在細胞能量穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮關鍵作用。除能量產(chǎn)生外，線粒體也是活性氧的主要來源[13]，同時還涉及細胞凋亡、自噬和壞死性細胞凋亡等細胞死亡的調節(jié)[14]，是細胞存活和死亡的關鍵。

組織器官I/R時會導致線粒體活性氧的大量產(chǎn)生，過量的活性氧直接導致線粒體呼吸鏈和代謝酶的氧化損傷[15]，同時也會破壞線粒體膜結構并增加mPTP開放[16]。線粒體通透性的增加則會使促凋亡因子向細胞質的釋放增多[17]，最終導致細胞凋亡并加劇各種組織器官中I/R誘導的損傷，因此線粒體功能障礙被認為是導致組織器官I/R損傷的標志之一。研究表明EETs能有效通過抗炎與抗凋亡等作用機制減輕組織器官的I/R損傷[3-6]，其中線粒體途徑在這些機制中起著至關重要的作用[2]，這提示EETs能通過保護線粒體減少組織器官的I/R損傷。然而線粒體盡管在EETs介導的I/R保護作用中的占有重要地位，但相關保護作用中卻未得到很深入的探討，并且分子機制仍未完全闡明，這值得我們進行深入研究。

4 EETs保護線粒體免受缺血/再灌注損傷的作用機制

研究表明EETs和sEH抑制劑能有效減輕組織器官I/R損傷引起的線粒體功能障礙。目前人們認為EETs主要通過以下幾個途徑來保護線粒體免受I/R損傷(詳見表1)：①EETs激活線粒體K+通道；②EETs限制mPTP開放；③EETs減少線粒體促凋亡蛋白的激活；④EETs維持線粒體結構的完整性。

4.1 EETs與線粒體K+通道

EETs能夠作用于包括線粒體ATP敏感性鉀(mitochondrial ATP-sensitive K+,mito-KATP)通道和線粒體Ca2+激活的K+(mitochondrial calcium-activated potassium,mito-KCa)通道在內的線粒體K+通道來減輕組織器官的I/R損傷。mito-KATP位于線粒體內膜上，由內向整流鉀通道和ATP 結合蛋白兩部分組成，其主要功能是將K+轉運至線粒體基質內調節(jié)線粒體內K+的濃度從而影響線粒體能量代謝，同時還參與線粒體的氧化磷酸化過程進而維持線粒體跨膜電位的穩(wěn)定性[18]。研究表明mito-KATP的激活能減少線粒體內膜的部分去極化、線粒體鈣超載以及活性氧的產(chǎn)生，從而賦予缺血后組織器官保護作用[19]。而EETs被證明能激活mito-KATP通道，如在CYP過表達即內源性增高EETs濃度的小鼠中，賦予的心臟保護作用涉及mito-KATP通道的激活[20]。同時用外源性EETs處理野生型小鼠心肌細胞也能通過增加線粒體的氧化還原狀態(tài)，表明EETs能激活mito-KATP通道[20]。在進一步的EETs調控mit-KATP機制研究中，Katragadda D 等[21]用mito-KATP的抑制劑5-HD進行實驗發(fā)現(xiàn)EETs通過減少線粒體應激而起作用，相關的研究也表明磷脂酰肌醇3-激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)信號通路參與了EETs激活mito-KATP通道的過程[22]，但此調控通路可能不是唯一通路，Sreedhar B[23]等發(fā)現(xiàn)即使PI3K被抑制EETs也能刺激mito-KATP通道的激活，并且在mito-KATP通道阻滯劑作用下也會發(fā)生PI3K-Akt的激活，提示在EETs調控mito-KATP通道的保護作用中有更加復雜的信號調控機制，有待進一步的研究探討。

mito-KCa通道也是線粒體K+離子通道的一種，mito-KCa通道可以通過細胞內Ca2+的升高和膜去極化被激活,進而促進細胞線粒體K+的攝取，減少Ca2+流入引起的線粒體Ca2+超載，提示mito-KCa通道的激活在組織I/R損 傷中具有保護作用[24]。進一步的研究表明天然缺失mito-KCa通道使得組織更容易受到I/R損傷[25]。EETs被證明能激活mito-KCa通道，如Katragadda D 等[21]用mito-Kca通道抑制劑PAX 處理心肌組織，結果發(fā)現(xiàn)它消除了EETs對缺血組織的保護作用，但EETs通過什么途徑作用于mito-KCa通道并不清楚。有證據(jù)表明PKA或PKC在涉及K+通道的I/R損傷保護途徑中起重要作用[26]，那么PKA或PKC通路很可能是EETs激活mito-KCa的一種機制，這需要進一步的實驗來確定EETs介導的I/R損傷保護作用是否涉及PKA或PKC向線粒體的早期激活或共定位。

4.2 EETs與線粒體通透性轉換孔

mPTP是線粒體內膜上的蛋白質復合物，由ATP合酶的二聚體構成，是細胞死亡的關鍵效應器，在正常生理條件下mPTP保持閉合，它的開放受基質親環(huán)蛋白D(cyclophilin D,CyPD)的調節(jié)[27]。組織器官I/R時，由于細胞缺乏氧供，線粒體代謝功能會受到抑制進而引起線粒體Ca2+超載、氧化應激、腺嘌呤核苷酸消耗和線粒體去極化等不良反應，在這些不良反應作用下mPTP持續(xù)開放。mPTP的開放會允許> 1.5×103的分子自由通過，這引發(fā)細胞滲透壓的變化和氧化磷酸化的解偶聯(lián)，最終導致細胞死亡[28]。EETs被證明能抑制mPTP的開放從而減輕組織器官I/R損傷，如Katragadda D等[21]發(fā)現(xiàn)EETs能減少由氧化應激引起的H9C2心臟細胞線粒體內膜電位(mitochondrial membrane potential，ΔΨm)的損失和mPTP的開放，同時也指出EETs介導的保護作用可能通過限制ΔΨm的損失減緩mPTP的開放，并有研究指出EETs可能通過PI3K-AKT信號通路來影響ΔΨm以達到限制mPTP的開放[29]。進一步的mPTP開放的機制研究表明，AMP依賴的蛋白激酶(Adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase，AMPK)的內在激活對于防止在再灌注期間過量的線粒體活性氧產(chǎn)生和隨后的JNK信號傳導至關重要，能夠限制mPTP的開放進而減輕不可逆的線粒體損傷[30]。由于EETs能通過激活AMPK和增強Akt的核轉位來減輕心臟肥大[31]，提示我們EETs很可能通過激活AMPK 信號通路進而限制mPTP的開放，從而減輕組織器官的I/R損傷。

表1 EETs保護線粒體免受I/R損傷的途徑及作用機制

隨著近年來高通量細胞實時成像技術的發(fā)展，研究者可以更好的對一些細胞亞結構進行觀察。最近一項研究通過同時對500至1000個單獨的線粒體進行實時成像，發(fā)現(xiàn)mPTP的激活機制涉及瞬時低電導開口，被稱為MitoWinks[32]。這種MitoWinks能通過重置單個線粒體以限制線粒體基質鈣超載，進而以較小的能量成本來促進線粒體和細胞存活[32]，但EETs是否會引起MitoWinks還有待研究，這可能是未來研究EETs通過線粒體途徑保護組織器官I/R機制的一個新焦點。

4.3 EETs與線粒體促凋亡蛋白

細胞凋亡的內在途徑即線粒體相關途徑在組織器官I/R損傷過程中發(fā)揮重要的作用，其中線粒體外膜上的促凋亡蛋白扮演著重要的角色。研究發(fā)現(xiàn)用EETs預處理缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)細胞以及利用具有EETs模擬特性和sEH抑制特性的新型雙功能化合物UA-8處理小鼠離體心臟都能夠減弱細胞的凋亡[33-34]。有趣的是有報道指出EETs可以激活PI3K/Akt信號通路并防止肺動脈內皮細胞凋亡[35]，提示EETs在組織器官I/R中可能是通過PI3K/Akt信號通路調節(jié)線粒體相關途徑發(fā)揮抗凋亡作用，這在Wenshu C等[36]的研究中得到證實。他們通過肺組織I/R模型，發(fā)現(xiàn)肺組織缺血會導致線粒體功能障礙和NADPH氧化酶的激活，導致活性氧過量產(chǎn)生進而調節(jié)Bcl-2家族蛋白的表達和激活Caspase-3來觸發(fā)細胞凋亡過程。同時I/R誘導的這些有害作用會通過CYP過表達或外源性增加EETs處理而減弱，并且CYP和EETs的保護作用會被被PI3K-Akt抑制劑LY294002阻斷，表明EETs的保護作用至少部分通過PI3K-Akt途徑調節(jié)位于線粒體外膜的Bcl-2家族蛋白的表達進而在組織I/R損傷中發(fā)揮抗凋亡作用[36]。但是細胞凋亡涉及非常復雜的信號傳導通路，提示我們可以關注其它相關信號通路，例如最近有研究發(fā)現(xiàn)EETs可以通過靶向JNK/c-Jun信號通路抑制氧葡萄糖剝奪對腦微血管平滑肌細胞凋亡的作用[37]，那么EETs是否也通過JNK/c-Jun信號通路調節(jié)線粒體途徑發(fā)揮組織I/R損傷的保護作用，這可能也是未來研究的一個方向。

4.4 EETs與線粒體結構完整性

線粒體的結構由外至內可劃分為線粒體外膜、線粒體膜間隙、線粒體內膜和線粒體基質四個功能區(qū)。其中線粒體內膜向內皺褶形成線粒體嵴，是許多生化反應的重要場所。線粒體的結構完整性一旦受到破壞就會引起線粒體功能的障礙。研究發(fā)現(xiàn)EETs能夠保護線粒體結構的完整性維持線粒體的正常功能。El-Sikhry等[38]在HL-1心肌細胞饑餓模型中,通過評估ADP/ATP比率和氧化呼吸能力發(fā)現(xiàn)，EETs在心肌細胞饑餓脅迫期間能增加OPA-1寡聚體水平和線粒體嵴密度，保留線粒體功能，延長細胞對饑餓應激的應答的存活期，揭示了EETs在調節(jié)線粒體中的新作用。Akhnokh等[39]利用sEH 敲除鼠和對應的野生型小鼠進行心梗造模，并用sEH抑制劑tAUCB治療，結果發(fā)現(xiàn) tAUCB治療或sEH缺乏可以通過減少EETs的降解顯著減輕線粒體結構損傷從而改善心肌梗死后的收縮和舒張功能，同時還發(fā)現(xiàn)抑制sEH會使線粒體酶活性顯著改善，進而說明EETs可以保留缺血性損傷后的線粒體功能。然而EETs如何將保護信號傳達到線粒體并保持其結構的完整性并未探索明白。有研究認為小窩蛋白1(Caveolin-1，Cav-1)可能起到一個信號傳達的作用，Chaudhary等[40]從I/R的野生型小鼠心臟中分離出心肌細胞的質膜和線粒體，結果顯示其中Cav-1缺失以及細胞膜穴樣內陷的缺乏，而從EETs處理后的心臟中分離的質膜和線粒體則存在Cav-1和細胞膜穴樣內陷,提示Cav-1信號傳導可能是EETs介導保護信號到線粒體從而引起保護效應的一個新機制，但還需更多的研究加以證明。

5 小結與展望

綜上所述，EETs能通過調節(jié)線粒體K+通道、mPTP、線粒體促凋亡蛋白以及線粒體結構的完整性在組織器官I/R損傷中發(fā)揮重要的保護作用。作為組織器官I/R損傷防治的重要靶點，線粒體結構和功能穩(wěn)定性的維持一直是研究的重點。而EETs作為一種能保護組織器官I/R損傷的脂質環(huán)氧化物，其對線粒體的作用機制盡管部分已經(jīng)得到闡述，但仍然還有很多未知的機制存在，這就需要我們接下來深入去探索。全面深入了解EETs作用于線粒體的機制對于尋找新的防治方式，發(fā)現(xiàn)新的治療靶點來保護組織器官I/R損傷有著重要的意義。