姜 華，文海若，劉 麗，王亞楠，李路路，劉曉萌，李 偉，王 欣，周曉冰，王三龍，霍 艷

(中國食品藥品檢定研究院 國家藥物安全評價監(jiān)測中心，藥物非臨床安全評價研究北京市重點實驗室，北京 100176)

生物制品在創(chuàng)新藥物研發(fā)中占據重要地位，在全球最暢銷的藥物排行榜中占據半壁江山。生物制品的主要藥理作用是通過刺激機體免疫系統(tǒng)產生免疫物質來激活人體免疫系統(tǒng)[1-2]。免疫系統(tǒng)功能異?？蓪е赂腥炯澳[瘤性病變，嚴重時可危及生命。藥物免疫毒性是當前僅次于肝毒性的全球第二大新藥召回原因，故生物制品的免疫毒性風險是其安全性評價的重要關注點[3]。淋巴細胞表面的跨膜糖蛋白以表面受體的形式，可特異性識別并參與機體抗原呈遞過程，并參與免疫調節(jié)功能。如T淋巴細胞中CD4+和CD8+表型的數值變化常用于監(jiān)測腫瘤、和獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immune deficiency syndrome, AIDS)等與免疫功能有關的疾病的發(fā)生與發(fā)展[4-6]。使用流式細胞術分類計數淋巴細胞亞群已成為非臨床安全性評價中常規(guī)的免疫毒性評價手段之一。常見的淋巴細胞亞群分類包括CD3+CD4+、CD3+CD8+與CD3-CD20+細胞等[7]。

小鼠、大鼠和食蟹猴均為常用的安全性評價動物模型。使用標準化的樣本制備方法，在符合藥物非臨床研究質量管理規(guī)范(Good Laboratory Practice，GLP)試驗條件下建立淋巴細胞亞群分類背景數據，有助于研究和監(jiān)管者了解數值變化范圍，對動物免疫毒性作合理評估[8]。當前國內食蟹猴外周血淋巴細胞亞群流式檢測參考值相關文獻已有數篇報道[8-11]，但數據涉及動物數量有限(不超過100只)或僅分析單一性別，僅有一篇為由安評機構匯總的基于多年大量動物的背景數據[8]。此外，大鼠及小鼠淋巴細胞亞群流式檢測參考值相關報道較少，因不同品系的大鼠和小鼠其背景值范圍也有所差異，有必要在安評機構中建立基于大量動物樣本數的淋巴細胞亞群的背景值范圍。本研究收集國家藥物安全評價監(jiān)測中心2007年至2019年在GLP條件下開展的生物制品安全性評價研究中未給藥組或溶媒組的BALB/c小鼠、SD大鼠和食蟹猴(廣西或北京)的CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD3-CD20+(僅食蟹猴)檢測值，根據動物性別不同分別匯總以確定不同種屬動物淋巴細胞亞群的參考值，為生物技術類藥物的免疫毒性評價提供參考依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF/VAF級BALB/c小鼠共303只(來自10項研究)，SPF/VAF級SD大鼠共359只(來自11項研究)，雌雄各半(購入時約5～9周齡)，小鼠體重范圍約25～40 g，大鼠體重約300～400 g，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK (京)2002-0003][SCXK (京)2012-0001][SCXK (京)2016-0011]。動物飼養(yǎng)于本中心[SYXK (京)2011-0037][SYXK (京)2016-0045]屏障系統(tǒng)的大鼠籠具(長×寬×高: 460 mm×315 mm×210 mm)和小鼠籠具(長×寬×高: 350 mm×140 mm×136 mm)內，飼養(yǎng)密度為2～3只/籠。給予鼠全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食及飲水。大鼠和小鼠飼養(yǎng)于恒溫(20℃～26℃)、恒濕(40%～70%)的條件下，明暗周期為12 h，每小時最低換氣次數15次。

普通級食蟹猴共460只，雌雄各半(購入時約3～4歲，體重約3～5 kg,來自共12項研究)，購自廣西桂東靈長類開發(fā)實驗有限公司[SCXK (桂)2011-0001][SCXK (桂)2016-0001]或北京協(xié)爾鑫生物資源研究所有限責任公司[SCXK (京)2015-0011]。飼養(yǎng)于本中心[SYXK (京)2011-0037][SYXK (京)2016-0045]普通級動物房不銹鋼籠具內(長×寬×高:80 cm×70 cm×75 cm)，單籠飼養(yǎng)。動物自由飲水，每只動物每天定量給料和水果各150 g，自由攝取。食蟹猴飼養(yǎng)于恒溫(16℃～26℃)、恒濕(40%～70%)的條件下，明暗周期為12 h，每次小時最低換氣次數8次。

所有研究方案均通過國家藥物安全評價監(jiān)測中心實驗動物福利倫理委員會(institutional animal care and use committee, IACUC)的倫理審查(IACUC編號為：IACUC-2008-023、IACUC-2010-008、IACUC-2013-031、IACUC-2014-068、IACUC-2015-028、IACUC-2016-005、IACUC-2017-005、IACUC-2018-001、IACUC-2018-058，等等)，并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑包括流式儀校準微球(BD CalibriteTM3-color，批號：7347634、APC bead，批號：80129)、BALB/c小鼠用抗體FITC-CD8a(Clone 53-6.7，批號：3177592,8152865)、PerCP-CD4(Clone RM4-5，批號：8025572,8194889,8025572)、Hamster抗Mouse PE-CD3e(Clone 145-2C11，批號：6012949,7158744)和食蟹猴用抗體FITC-CD8(Clone RPA-T8，批號：5341673,5159821)、PE-CD4(Clone L200，批號：7299836,5313876,5057543)、PerCP-CD3(Clone SP34-2，批號：8124735,6092584,7069961)和APC-CD20(Clone 2H7，批號：3291627)均購自BD公司；SD大鼠用抗體CD3-FITC/CD4-RPE(Clone IF4:W3/25，批號：1113)，CD8ALPHA:Alexa Fluor647(Clone OX-8，批號：0310)購自BIO-RAD；紅細胞裂解液主要成分：氯化氨(批號：20161208)、碳酸氫鉀(批號：20150924)和乙二胺四乙酸二鈉(批號：20140328)購自國藥集團，磷酸鹽緩沖液(PBS批號：AD2016267，AD22391274)購自Hyclone；多聚甲醛(批號：20170825)購自國藥集團，使用前經PBS稀釋為1%的應用液。主要儀器包括BD FACSCalibur流式細胞儀，分析軟件Cell QuestTMPro；H-500FRS高速離心機。

1.3 檢測方法

1.3.1 血樣采集

本研究收錄動物數據均來自未給藥動物或生物制品溶媒對照組動物數據，全部動物采血前過夜禁食。嚙齒類動物腹腔注射戊巴比妥鈉(45 mg/kg)麻醉后經腹主靜脈采血，食蟹猴不麻醉由前臂靜脈采血。全部動物采集全血0.3～0.5 mL，血樣于肝素鈉抗凝管中混勻，所有樣本在采集后4 h之內完成制備與測定分析。

1.3.2 檢測流程

將各相應熒光抗體組合和50 μL抗凝全血加入流式管中，混勻樣本后于室溫、避光條件下孵育30分鐘。在流式管中分別加入1 mL的紅細胞裂解液并混勻，小鼠和大鼠樣本的裂解時間通常為1～3 min，食蟹猴樣本約4～9 min。紅細胞充分裂解后，以1000 r/min離心5 min，棄上清并加入1 mL PBS再次離心(離心條件同上)并棄上清。每管加入1%多聚甲醛重懸細胞后上機測定。小鼠和大鼠樣本共收集3000～5000個淋巴細胞，食蟹猴共收集5000個淋巴細胞。分別計算表達CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+和CD3-CD20+(僅食蟹猴)的淋巴細胞百分率。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

雄性和雌性BALB/c小鼠外周血CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+淋巴細胞范圍(表1)，雄性的結果分別為45.45%～85.86%、12.73%～42.48%、1.07～6.74；雌性為53.27%～84.15%、8.95%～37.49%、1.42±8.59。雄性和雌性SD大鼠平均CD3+CD4+、CD3+CD8+和CD4+/CD8+范圍(表2)，雄性的結果分別為48.26%～84.53%、16.35%～62.75%、0.99～8.78；雌性為34.06%～86.24%、7.39%～62.75%、0.54±11.67。約3～4歲齡雄性和雌性食蟹猴CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+和CD3-CD20+范圍(表3)，雄性的結果分別為28.42%～72.83%、23.93%～65.32%、0.44±3.04、1.40%～47.91%；雌性為22.70%～75.90%、17.43%～65.13%、0.35±4.22、9.6%～51.99%。

表1 BALB/c小鼠T淋巴細胞亞群參考范圍

表2 SD大鼠T淋巴細胞亞群參考范圍

表3 食蟹猴淋巴細胞亞群參考范圍

上述背景數值分布范圍較廣，故對不同種屬及性別動物的淋巴細胞亞群分布情況作進一步分析匯總。BALB/c小鼠的CD3+CD4+數值分布集中于60%～80%，CD3+CD8+分布多集中于15%～35%，CD4+/CD8+比值集中于1.5～4.5的區(qū)間范圍(表4)；SD大鼠的CD3+CD4+數值分布集中于60%～80%，CD3+CD8+分布集中于25%～45%，CD4+/CD8+比值多集中于1.5～4.5的區(qū)間范圍(表5)；食蟹猴的CD3+CD4+分布集中于40%～60%，CD3+CD8+分布多集中于30%～50%，CD4+/CD8+比值多集中于1.0～2.0，CD3-CD20+分布多集中于10%～30%(表6)。上述分布情況未見性別差異。

表4 BALB/c小鼠淋巴細胞亞群總體分布情況

表5 SD大鼠T淋巴細胞亞群總體分布情況

表6 食蟹猴淋巴細胞亞群總體分布情況

3 討論

免疫毒性評價已成為藥物毒理學評價中不可或缺的單元。使用流式細胞計數法(flowcytometry, FM)檢測外周血淋巴細胞表型已成為毒理學評價實驗室常規(guī)的試驗手段，該方法與免疫組化檢測法相比靈敏度高、更客觀、且可以更好地兼容高通量評價。外周血淋巴細胞表型是評估動物免疫功能的重要指標，而動物的產地、環(huán)境、樣本制備和所用試劑不同等諸多因素均可對其數值產生影響[12-13]。在實驗室內確立一套正常動物外周血淋巴細胞亞群正常參考范圍，有利于查找研究數據存在的問題并對藥物潛在免疫毒性作出有效判斷，滿足不斷提高的實驗結果準確度的要求，從而推動生物制品產品研發(fā)并更好地服務于毒理數據監(jiān)管。當試驗中陰性組數值偏離背景數據時，認為該組數據不可靠，應查找原因并重復采血檢測。本研究匯總12年來我中心未給藥或僅給予溶媒的嚙齒類動物和靈長類動物的淋巴細胞亞群分類結果，所有數據均來自10以上次獨立研究，背景值范圍在文獻報道范圍之內[8-11]。

CD3+CD4+為輔助/誘導細胞亞群，主要通過分泌的淋巴因子來增強和擴大免疫應答；而CD3+CD8+屬于抑制/細胞毒細胞亞群，可特異性殺傷靶細胞, 具有抗病毒、抗腫瘤及重要的調節(jié)作用[14]。影響CD4+/CD8+的因素除種屬外，也與年齡和性別等因素有關。如，衰老與免疫功能減退息息相關。本研究中發(fā)現(xiàn)BALB/c小鼠、SD大鼠和食蟹猴的CD4+/CD8+范圍分別為1.07～8.59、0.54～11.67和 0.35～4.22，范圍區(qū)間大，與個別動物個體差異導致頭尾兩端的數據差異大有關。故進一步對所有數據分區(qū)間進行匯總，發(fā)現(xiàn)相同種屬大多數動物的數值(約70%～85%左右)位于相同區(qū)間內，且數據分布無明顯性別差異。黃秋香等對不同性別和不同周齡的食蟹猴的淋巴細胞亞群分類結果比較分析，發(fā)現(xiàn)3～5歲的食蟹猴存在雌性動物CD3+CD4+較高的現(xiàn)象，而1.5～2歲的食蟹猴數據中未見上述差異[8]。此外，李巖等匯總的4～7歲食蟹猴淋巴細胞亞群分類結果中亦未見性別差異[11]。食蟹猴通常約4歲左右達性成熟，本中心用于藥物臨床前安全性評價的食蟹猴年齡通常為3～4歲，處于接近性成熟或性成熟伊始階段。輔助性T淋巴細胞(CD3+CD4+)變化可與動物的性成熟和胸腺萎縮程度有關，動物的年齡以及雌性動物性成熟時間早于雄性動物等因素可能是造成年齡和性別差異的主要原因。因上述文獻使用動物產地各異，不排除存在食蟹猴產地原因。

除CD3+CD4+、CD3+CD8+、CD4+/CD8+和CD3-CD20+外，其它淋巴細胞表型對特殊靶向的生物制品的免疫毒性也有一定提示，然而涉及研究較少，未獲得大量數據用于制定背景數據。如自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)認為是T細胞和B細胞外的第三大最重要的免疫細胞，可通過CD16+或CD56+識別。作為天然免疫的核心細胞，外周血中NK的多寡也可反應受試物的免疫毒性[15]。而表達CD40+的B細胞可激活樹突狀細胞(dendritic cell，DC)并在CD8+的調控中至關重要[16]。當前已有針對CD40+開發(fā)的一系列抗體抗腫瘤藥物，如SEA-CD40、魯卡木單抗、阿韋舒托等陸續(xù)進入臨床，上述藥物的毒性評估中應關注CD40+的表達水平。此外，近年來靶向CD19、CD20和CD22的嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptor, CAR)修飾的T細胞治療在復發(fā)/難治型急性淋巴細胞白血病的治療中彰顯優(yōu)勢[17,18]，類似細胞治療產品陸續(xù)進入安評領域，而表型為CD19+、CD20+和CD22+的淋巴細胞表達水平也成為其毒性監(jiān)測的關注點。今后應注意收集相關數值，完善背景數據積累。

本研究規(guī)范而系統(tǒng)性地收集了12年來大量小鼠、大鼠和食蟹猴的外周血淋巴細胞亞群背景數據，尤其是首次報道了基于大量樣本的小鼠和大鼠淋巴細胞亞群背景數據，作為生物制品臨床前動物試驗數據解讀的重要支持，對進一步討論藥物或疾病對動物免疫功能狀態(tài)的影響提供參考。當前有關嚙齒類動物的淋巴細胞亞群背景值信息罕有報道，本文對以嚙齒類動物為模型的生物制品評價及研究具有借鑒意義。