王曉堂，肖蘭飛，高繼萍，梁宇翔，軒瑞晶，閆曉如，高 莉，宋國華

(山西醫(yī)科大學實驗動物中心，實驗動物與人類疾病動物模型山西省重點實驗室，太原 030001)

口腔癌作為近年來頻發(fā)的腫瘤，在全身惡性腫瘤中約占3%～5%，是全球范圍內常見的第11位癌癥，具有轉移性高、手術切除難度大、術后易復發(fā)等特點[1]?？谇击[狀細胞癌(Oral squamous cell carcinoma，OSCC)的發(fā)病率約占口腔惡性腫瘤的90%，且發(fā)病率較高、惡化程度極強，患者5年存活率在50%左右[2]。已有證據指出，口腔鱗狀細胞癌的形成與患者的多種不良生活習慣有關。此外，遺傳因素、慢性炎癥及病毒感染也是該病的誘因[3]。世界衛(wèi)生組織預計，未來幾十年口腔癌的發(fā)病率將持續(xù)上升，成為一種嚴重的世界公共衛(wèi)生問題[4]。因此，需進一步研究口腔鱗狀細胞癌發(fā)病進程中的相關機制，以便更好地進行癌前診斷與預后治療。

近年來，大量研究表明長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)在多層次調控生物體的基因表達，參與生物體內多種重要的生物學過程[5]。最新研究指出，LncRNA具有復雜的生物學功能與作用調控機制，通過介導基因表達、轉錄、翻譯以及組織分化等途徑調控基因表達，引起細胞功能紊亂、代謝失調，導致多種疾病和癌癥的形成[6-7]。目前，有研究指出LncRNA在多種腫瘤發(fā)生過程中異常表達，參與調控腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲與凋亡過程，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮致癌或抑癌作用，是腫瘤發(fā)生的重要因素之一[8-10]。但是，LncRNA在口腔鱗狀細胞癌中作用機制的研究相對較少，局限于未能獲得足夠的臨床樣本。因此，建立與人類口腔鱗狀細胞癌相似的疾病動物模型模擬OSCC的發(fā)生發(fā)展過程，深入研究其發(fā)病機制至關重要。

中國地鼠(Cricetulusbarabensisgriseus)具有獨特的頰囊組織結構，口腔黏膜與人類的相似性較高，可用其構建口腔癌實驗動物模型，模擬人類口腔癌癌變過程[11-13]。本課題組在前期研究中已成功建立中國地鼠口腔鱗狀細胞癌動物模型，本文將高通量LncRNA測序技術與生物信息學技術相結合，篩選中國地鼠口腔鱗狀細胞癌組織樣本與正常組織樣本中顯著差異表達的LncRNA，對其進行靶基因預測，并對靶基因進行GO功能分析與KEGG信號通路分析，預測差異表達的LncRNA可能具有的功能，深入探討其對中國地鼠口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的調控機制，為口腔鱗狀細胞癌的臨床研究提供數據與理論基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

清潔級中國地鼠60只，雄性，8～10周齡，體重(20 ± 2)g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心[SCXK (晉)2015-0001]。中國地鼠飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學實驗動物中心屏障環(huán)境[SYXK (晉)2015-0001]，溫度25℃，濕度40%～70%，光暗循環(huán)12 h/12 h)。嚴格按照山西醫(yī)科大學實驗動物管理委員會的要求進行全部動物實驗【IACUC號：2017016】，所有實驗均遵循3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒(北京天根生物科技有限公司)，普通PCR與熒光定量PCR相關試劑(日本 Takara 公司)，Nanodrop微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)，Qubit熒光定量儀(美國Thermo Fisher公司)，Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織樣本中RNA提取

本課題組前期采用二甲基苯并蒽涂抹的方式成功制備口腔鱗狀細胞癌動物模型[12-15]。在課題組前期制備的中國地鼠口腔鱗狀細胞癌模型組與正常組中分別隨機選取3只動物，取適量的頰囊組織樣本用液氮充分研磨，采用RNA提取試劑盒提取不同組織中的總RNA。

1.3.2 高通量LncRNA測序

RNA提取完成后，對其進行質檢。首先，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性、降解程度以及是否被污染。RNA純度采用Nanodrop微量分光光度計(美國Thermo Fisher公司)進行檢測，濃度采用Qubit熒光定量儀(美國Thermo Fisher公司)進行精確定量。采用Agilent 2100生物芯片分析系統(tǒng)(美國Thermo Fisher公司)精確檢測RNA的純度與完整性。完成質檢后，對質檢合格的RNA進行片段化、反轉錄成cDNA、末端修復、加接頭、PCR擴增等一系列操作后完成cDNA文庫構建[16-17]。篩選片段大小為200 bp左右的cDNA文庫，按有效濃度及目標上機數據量的需求進行Illumina測序[17]。

1.3.3 測序數據處理

測序獲得的原始序列中存在低質量數據，本研究采用FASTQC軟件[18]處理原始數據并進行質量控制后得到高質量數據。質控完成后，使用RSEM比對軟件[19]將高質量數據比對到中國地鼠參考基因組上進行序列聯配。RSEM比對軟件使用自身腳本對聯配的結果進行表達量提取，生成基因的讀數、FPKM和TPM表達矩陣[20-21]。最后，篩掉低表達量的基因(平均數值>5)，分離mRNA和LncRNA對應的基因。

1.3.4 差異表達LncRNA篩選及靶基因預測

首先，將RSEM估算得到的各個LncRNA的讀數作為輸入數據輸入到DESeq2軟件[20-21]進行差異鑒定，軟件通過自行標準化與模型擬合，通過Wald檢驗[22-23]鑒定兩組樣本間基因的差異顯著性。其次，采用生物統(tǒng)計學與生物信息學相結合的方法篩選與OSCC密切相關的顯著差異表達的LncRNA，以log2(差異倍數)1(|log2(fold change)|1)，P<0.05為篩選條件。本研究通過表達量相關性分析的方法預測差異表達LncRNA的反式作用靶基因，選取P<0.05的基因作為反式作用候選基因。

1.3.5 GO功能富集分析與KEGG信號通路分析

差異表達LncRNA的靶基因富集分析包括GO功能(Gene Ontology)分析與KEGG信號通路(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway)分析[24]。本研究采用GO功能注釋對中國地鼠口腔鱗狀細胞癌組織樣本中差異表達的LncRNA的靶基因進行功能分析，使用生物統(tǒng)計學方法篩選差異表達基因富集的生物學功能，以P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義的功能條目。采用KEGG信號通路富集分析，以達到對差異表達LncRNA的靶基因生物通路注釋的目的，篩選出與OSCC相關的信號調控網絡，以P<0.05表示具有統(tǒng)計學意義的信號通路條目。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 中國地鼠口腔鱗狀細胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達基因

采用高通量LncRNA測序技術對組織樣本進行測序分析，結果表明與中國地鼠正常頰囊組織樣本相比口腔鱗狀細胞癌組織樣本中共篩選出54個顯著差異表達的LncRNA(P<0.05，|log2(差異倍數)|>1)，31個基因表達上調，23個基因表達下調，并繪制了顯著差異表達的LncRNA的火山圖(圖1)。進一步采用t檢驗分析實驗數據，篩選出10個差異具有極顯著統(tǒng)計學意義的LncRNA(P<0.01，|log2(差異倍數)|>3)，分別為LOC100754872、LOC103160606、LOC107978163、LOC103163417、LOC103162225、LOC103161306、LOC107979530、LOC103161117、LOC103164378、LOC103161380。其中7個基因表達上調，3個基因表達下調(表1)。

表1 兩組織樣本中顯著差異表達前十的LncRNA

注：X軸代表差異表達倍數的log2值，縱坐標代表各個基因的經過標準化后的P值。顯著上調的基因(|log2(差異倍數)|>1)為紅色標識，顯著下調的基因為藍色標識，表達量沒有變化的基因為灰色標識。

2.2 中國地鼠口腔鱗狀細胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達的LncRNA靶基因預測

表2 顯著差異表達LncRNA靶基因預測結果統(tǒng)計

采用靶基因預測軟件預測顯著差異表達的54個LncRNA反式作用靶基因。本研究對極顯著差異表達(P<0.01)的10個LncRNA預測的靶基因數目進行統(tǒng)計，不同LncRNA位于染色體上不同位置，發(fā)揮不同生物學功能，因此預測的靶基因數目不同(表2)。進一步使用生物統(tǒng)計學方法分別統(tǒng)計了極顯著差異表達的LncRNA相關性最高的前5個靶基因(表2)(相關性>0.85，P<0.01)。推測組織樣本中極顯著差異表達的LncRNA可能通過與其靶基因之間相互調控發(fā)揮作用，從而調控口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生進程。

2.3 中國地鼠口腔鱗狀細胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達LncRNA的靶基因GO分析

采用GO功能注釋方法分析54個顯著差異表達的LncRNA的靶基因富集的生物學功能。GO注釋結果中共獲得73個條目，70條與生物過程相關，3條與細胞位置相關，未發(fā)現與分子功能相關的條目。采用生物統(tǒng)計學方法篩選顯著富集的GO條目(P<0.05)，其中10條與生物過程相關，3條與細胞位置相關，該結果表明差異表達基因的靶基因主要分布在細胞外區(qū)域，參與調控硫酯、酰基輔酶A、輔酶、輔因子、脂質代謝過程，調節(jié)細胞死亡、細胞黏附、組織發(fā)育及組織形態(tài)發(fā)生等過程(圖2A)。以P<0.01為篩選條件，篩選出極顯著富集的GO條目，8條與生物過程相關(圖2B、2C)，3條與細胞位置相關(圖2D、2E)。推測以上生物學功能的紊亂或異常可能引起口腔鱗狀細胞癌的惡化。

注：A：GO分類所有條目柱狀圖，橫坐標為富集的基因數量，縱坐標為GO條目，不同的顏色代表不同的GO分類。B：生物過程相關的GO條目的柱狀圖。C：生物過程相關的GO條目的氣泡圖。D：細胞組成相關的GO條目的柱狀圖。E：細胞組成相關的GO條目的氣泡圖。

2.4 中國地鼠口腔鱗狀細胞癌組織樣本與正常組織樣本差異表達LncRNA的靶基因KEGG分析

KEGG通路富集分析結果表明，差異表達的LncRNA的靶基因共富集了25條信號通路(P<0.05)。采用生物統(tǒng)計學方法，篩選極顯著富集的信號通路(P<0.01)，共篩出12條極顯著的信號通路(圖3A、3B，表3)。主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路(cge04060)、粘著力信號通路(cge04510)、軸突指導信號通路(cge04360)、鈣信號通路(cge04020)與TNF信號通路(cge04668)，這些通路多與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。此外，差異表達的LncRNA的靶基因還參與調控ARVC信號通路(cge05412)、DCM信號通路(cge05414)、HCM信號通路(cge05410)、心肌細胞的腎上腺素信號傳導通路(cge04261)、造血細胞譜系信號通路(cge04640)、萜類骨架的生物合成(cge00900)及ECM-受體相互作用通路(cge04512)，這些通路大多與心臟疾病密切相關。推測在口腔鱗狀細胞癌中這些信號通路在不同程度上發(fā)揮調控作用，影響口腔鱗狀細胞癌的發(fā)生發(fā)展。

注：A：KEGG信號通路柱狀圖。B：KEGG信號通路氣泡圖。

3 討論

口腔癌是經過一系列組織病理學發(fā)展進程演變而來，病損因輕到重，最后發(fā)展為原位癌或口腔鱗狀細胞癌[25-26]。近年來，口腔鱗狀細胞癌的發(fā)病者趨于年輕化，發(fā)病率不斷上升[27]。由于缺少針對性的早期篩查方法，就診患者大多為晚期病人。因此，尋找口腔鱗狀細胞癌早期篩查與診斷預后的生物標記物成為近年來臨床研究熱點。長鏈非編碼RNA是長度大于200 bp的非編碼RNA，不編碼蛋白質，在生物體生長發(fā)育、生殖分化過程中發(fā)揮重要作用，是目前生物學與醫(yī)學的熱點研究領域[28-29]。大量研究報道，LncRNA在表觀遺傳與基因表達過程中扮演重要角色，參與細胞增殖、分化、凋亡進程[30-32]。LncRNA與其靶mRNA的3’非翻譯區(qū)部分序列通過互補配對的方式結合，調控靶mRNA的表達，導致多種腫瘤的發(fā)生，在一定程度上影響腫瘤細胞增殖，參與調控細胞病變與癌癥惡化過程，在腫瘤增生及患者生存期不同的病理生理特點中發(fā)揮作用，表明LncRNA可能作為潛在的癌癥診斷標記物[33-34]。高通量LncRNA測序技術能在較短的時間內對大量LncRNA基因組信息進行分析，預測其可能具有的生物學功能，有利于加速新的腫瘤標記物的產生，推動腫瘤的臨床研究與治療。

表3 極顯著差異KEGG pathway統(tǒng)計表

大量臨床數據表明，口腔癌患者體內異常表達的LncRNA參與調控腫瘤的發(fā)生發(fā)展[35-36]。有研究者對人類第一個口腔黏膜及其癌前病變的LncRNA表達譜進行研究，結果表明在癌組織中超過60%的異常表達的LncRNA與口腔癌相關[37]?？紫榕蔚萚38]研究指出LncRNAFOXCUT在口腔癌組織及鱗癌細胞中呈高表達狀態(tài)，其表達下調后會抑制口腔鱗狀細胞癌細胞的增殖、克隆與遷移。付叢等[39]研究表明，LncRNAAFAP1-AS1在口腔鱗癌組織中相對表達水平是正常組織的5.16倍，并與腫瘤臨床分期、分化與轉移相關。劉速等[40]研究指出LncRNAMALAT1敲低表達后抑制癌細胞的遷移、侵襲能力。Tang等[41]檢測了口腔鱗狀細胞癌中6種常見的LncRNA的表達情況，結果表明癌組織與正常組織相比MALAT-1、HOTAIR、NEAT-1、HULC、UCA1的表達顯著升高，MEG-3表達水平顯著降低。基于已有研究，推測LncRNA在口腔鱗狀細胞癌的病變過程中發(fā)揮重要作用。因此，闡明新發(fā)現的LncRNA與已知的LncRNA在腫瘤形成過程中具有的生物學功能，將有助于癌癥的早期診斷和預后治療。目前，口腔鱗狀細胞癌患者的組織樣本較難獲取，且耗時很長，嚴重阻礙了對其發(fā)病機制的研究?；谝陨显?，本課題組在前期研究中采用化學誘導法成功建立中國地鼠口腔鱗狀細胞癌動物模型，模擬人類口腔鱗狀細胞癌發(fā)生的病變過程[12-15]。該動物模型的建立可以在較短的時間內獲得實驗所需的口腔鱗狀細胞癌組織樣本，以彌補臨床樣本的不足。大量臨床研究采用基因芯片技術對腫瘤組織樣本中差異表達基因進行篩選，本研究則選用高通量LncRNA測序技術進行研究。與基因芯片技術相比，采用高通量測序技術篩選模型動物組織樣本中LncRNA差異表達譜可發(fā)現一些新的LncRNA，為揭示更多新發(fā)現的LncRNA在疾病中的作用調控機制提供數據基礎。

本實驗采用高通量LncRNA測序技術對中國地鼠口腔鱗狀細胞癌組織樣本與正常樣本進行測序分析，揭示了LncRNA在兩種組織樣本中的差異表達，成功建立了中國地鼠口腔鱗狀細胞癌相關的長鏈非編碼RNA差異表達譜。采用聚類分析的方法對實驗組與對照組差異表達基因進行研究，共篩選出54個顯著差異表達的LncRNA(P<0.05)。對顯著差異表達LncRNA的靶基因進行功能性分析發(fā)現，OSCC相關的GO條目有73條，以P<0.01為條件，篩選出極顯著富集的GO條目，8條與生物過程相關，3條與細胞位置相關。GO功能分析表明，差異表達LncRNA的靶基因主要位于細胞外區(qū)域，參與調控參與調控硫酯、?；o酶A、輔酶、輔因子、脂質代謝過程，調節(jié)細胞死亡、細胞黏附、組織發(fā)育及組織形態(tài)發(fā)生過程。此結果與先前的研究報道一致[42-44]。KEGG信號通路富集分析結果指出，差異表達LncRNA的靶基因主要參與調控25條信號通路(P<0.05)，其中極顯著富集的信號通路12條(P<0.01)。主要包括細胞因子-細胞因子受體相互作用信號通路、粘著力信號通路、軸突指導信號通路、鈣信號通路和TNF信號通路。這些信號通路在其他癌癥發(fā)生發(fā)展中的作用機制已有報道，但其在口腔鱗狀細胞癌中的報道相對較少[45-47]。因此，深入研究口腔鱗狀細胞癌發(fā)生進程中的生物學功能變化與相關信號通路的作用機制，有利于更好的揭示口腔鱗狀細胞癌的發(fā)病機制。

綜上所述，本研究以中國地鼠為實驗動物，利用其獨特優(yōu)勢成功構建成功構建了符合口腔鱗狀細胞癌病理生理過程的中國地鼠模型，實驗操作簡單，造模成功率高。應用此模型對口腔鱗狀細胞癌進行基礎研究，可為其臨床治療提供新思路。此外，本實驗主要基于生物信息學技術對動物模型中差異表達LncRNA進行篩選，對其靶基因的功能進行預測，并未進行大量的實驗驗證，在接下來的研究中還有許多問題有待解決。因此，在下一步的研究中，將深入探討測序結果篩選出的極顯著差異表達LncRNA參與調控口腔鱗狀細胞癌發(fā)生發(fā)展的具體調控機制，闡明其與靶基因的相互關系以及在口腔鱗狀細胞癌相關的信號通路中發(fā)揮的作用，以期望為口腔鱗狀細胞癌的癌前診斷與預后治療提供新的腫瘤標記物。

注：中國地鼠(Cricetulusbarabensisgriseus)是倉鼠科倉鼠亞科動物，在公開出版物中使用倉鼠作為名稱更為科學。但鑒于目前我國實驗動物國家標準中提到的動物的種類都是地鼠，作為專業(yè)人員能夠清楚該物種在動物分類中地位，并不妨礙科學研究的成果和使用。中文名稱后面的拉丁文不會對該研究的主體產生歧義，故本文在發(fā)表時仍沿用“中國地鼠”，待國標修訂后再統(tǒng)一命名為“倉鼠”。