王久紅，孫 琪，于學(xué)祥，張丙周，庫(kù)旭鋼，范盛先，何啟蓋，3

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070）

豬巴氏桿菌?。⊿wine pasteurellosis），也稱“豬肺疫”、“鎖喉風(fēng)”和“腫脖子病”，主要引起豬只咽喉腫脹、呼吸困難、急性敗血癥和肺炎等癥狀。該病廣泛分布于世界各地，是豬的一種常見(jiàn)傳染病，發(fā)病率達(dá)40%，死亡率在5%左右，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1]。多殺性巴氏桿菌屬于豬呼吸道內(nèi)的一種常見(jiàn)條件性致病菌[2]，根據(jù)其莢膜抗原可以分為5 種血清型，即A、B、D、E 和F 型。目前國(guó)內(nèi)豬群中主要流行的是A 型和D 型，因其能產(chǎn)生毒素，又被稱為產(chǎn)毒性多殺性巴氏桿菌。該病與氣候變化、飼養(yǎng)管理不當(dāng)?shù)葢?yīng)激因素緊密相關(guān)[3]。本文就一例地方黑豬感染巴氏桿菌所致發(fā)病開(kāi)展了一系列的診斷，并有針對(duì)性地提出了治療和防控措施，效果顯著。可為豬場(chǎng)巴氏桿菌病的診斷與防控提供參考。

1 發(fā)病情況

2019 年1 月，湖北省某地方黑豬豬場(chǎng)，肥育豬只出現(xiàn)精神極度萎靡、呼吸困難、張口伸舌、呈犬坐姿勢(shì)，后期出現(xiàn)急性死亡等呼吸道疾病癥狀。到該豬場(chǎng)進(jìn)行實(shí)地調(diào)查，該場(chǎng)發(fā)病豬只主要集中于肥育后期，其豬舍環(huán)境較差，刺激性氣味較重，氨氣含量嚴(yán)重超標(biāo)，且養(yǎng)戶未及時(shí)將發(fā)病豬只與無(wú)癥狀豬只隔離。挑選具有明顯癥狀的3 頭病（死）豬只解剖觀察，發(fā)現(xiàn)其口腔及氣管內(nèi)充滿泡沫樣分泌物（圖1A，圖1B）；肺臟間質(zhì)水腫、增寬（圖1C，圖1D），其它臟器未見(jiàn)明顯異常病變。根據(jù)場(chǎng)內(nèi)情況、臨床癥狀和病理剖檢，初步懷疑上述癥狀是由呼吸道細(xì)菌感染所致，詳細(xì)了解該場(chǎng)呼吸道病原感染情況還有賴于實(shí)驗(yàn)室診斷。

圖1 臨床剖檢結(jié)果

2 實(shí)驗(yàn)室診斷

取完整的氣管和肺臟進(jìn)行細(xì)菌分離，隨后采集肺臟、淋巴結(jié)和扁桃體等組織，冷藏保存與平皿一起，迅速帶回華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心進(jìn)行檢測(cè)。

2.1 病毒性病原檢測(cè)

將3 頭病死豬只（分別編號(hào)1、2、3）對(duì)應(yīng)編號(hào)的肺臟、淋巴結(jié)和扁桃體等組織合并，加入滅菌PBS，于勻漿器進(jìn)行研磨，反復(fù)凍融3 次，離心取上清液，利用病毒核酸提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，使用華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物疫病診斷中心檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立的PCR 方法進(jìn)行檢測(cè)，所用引物由上海生工生物科技有限公司合成，詳細(xì)序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列

檢測(cè)結(jié)果顯示，PRRSV（藍(lán)耳病病毒）、PCV2（圓環(huán)病毒2 型）和PRV（偽狂犬病病毒）等病毒性病原檢測(cè)結(jié)果均為陰性（圖2A，圖2B）。

圖2 病料PCR、RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離鑒定

取完整的肺臟樣品進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，在加有血清和NAD 的TSA 平皿上，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察分離細(xì)菌的菌落形態(tài)（圖3A，圖3B，圖3C），根據(jù)菌落形態(tài)特點(diǎn)初步懷疑其為多殺性巴氏桿菌，并選取疑似致病菌分離純化培養(yǎng)。使用煮沸法制備模板，采用PCR 方法檢測(cè)鏈球菌（SS）[4]、副豬嗜血桿菌（HPS）、胸膜肺炎放線桿菌（APP）、支氣管敗血波氏桿菌（Bb）[5]、多殺性巴氏桿菌（Pm）[6]（引物由上海生工生物科技有限公司合成）。

圖3 細(xì)菌分離菌落形態(tài)

細(xì)菌檢測(cè)結(jié)果顯示，該場(chǎng)僅檢出多殺性巴氏桿菌（圖4），并利用多重PCR[7]方法確定了其血清型，為A 型（圖5）。

圖4 細(xì)菌樣品mPCR 擴(kuò)增結(jié)果

圖5 細(xì)菌模板巴氏桿菌分型PCR 擴(kuò)增結(jié)果

結(jié)合豬場(chǎng)的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查、病理剖檢及實(shí)驗(yàn)室診斷，確診該場(chǎng)是由A 型產(chǎn)毒素型多殺性巴氏桿菌感染引起的豬只發(fā)病和死亡。為控制該病在豬場(chǎng)內(nèi)的進(jìn)一步發(fā)展，我們利用紙片擴(kuò)散法對(duì)分離的A 型多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了藥敏試驗(yàn)。

結(jié)果顯示：該菌株對(duì)大部分抗生素敏感，尤其是恩諾沙星、環(huán)丙沙星等沙星類抗生素，而鏈霉素、慶大霉素等藥物對(duì)其抑制效果不明顯，在本試驗(yàn)中該菌僅對(duì)林可霉素產(chǎn)生耐藥性。詳情見(jiàn)表2。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 防控方案

根據(jù)診斷情況及豬場(chǎng)的具體問(wèn)題，給出如下幾方面建議。

（1）針對(duì)保育及肥育豬群實(shí)施拌料給藥，推薦使用恩諾沙星連續(xù)拌料5 d，停藥7 d 后使用環(huán)丙沙星連續(xù)拌料5 d，均按說(shuō)明書劑量使用。

（2）產(chǎn)房哺乳仔豬在斷奶前可使用恩諾沙星飲水連續(xù)給藥5 d，用于保健和預(yù)防。

（3）針對(duì)發(fā)病的保育、肥育及母豬群，可選擇免疫豬肺疫活疫苗或自家苗（由有資質(zhì)的科研院所或企業(yè)配制）。由于是地方豬種，為避免出現(xiàn)副反應(yīng)，可先免疫5 頭母豬和10 頭斷奶仔豬觀察效果，7 d 后如無(wú)副反應(yīng)，方可全群免疫，需注意一豬一針頭。

（4）生產(chǎn)管理。

①實(shí)行全進(jìn)全出生產(chǎn)模式，禁止混群，對(duì)發(fā)病豬只要及時(shí)隔離，并對(duì)病死豬進(jìn)行無(wú)害化處理。

②加強(qiáng)消毒，每批次豬群轉(zhuǎn)移后充分消毒并空欄5 d。

③加大空氣流通，降低豬舍內(nèi)氨氣含量，改善欄舍空氣質(zhì)量。

4 討論與結(jié)論

采取上述防控方案后，對(duì)該場(chǎng)進(jìn)行跟蹤回訪，每周統(tǒng)計(jì)新發(fā)病例及轉(zhuǎn)歸病例，評(píng)價(jià)方案效果，如有效，持續(xù)使用該方案，如效果不理想也可及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。1 個(gè)月后，該場(chǎng)豬只病情恢復(fù)穩(wěn)定，可見(jiàn)此防控方案確實(shí)可行，具有一定的參考和指導(dǎo)意義。

從本案例的診斷結(jié)果來(lái)看，豬細(xì)菌性呼吸道疾病仍對(duì)我國(guó)豬場(chǎng)影響極大，需加強(qiáng)綜合防控。不當(dāng)?shù)娘曫B(yǎng)管理是其發(fā)生的一個(gè)重要因素，本案例中，通風(fēng)不良、衛(wèi)生條件差給致病菌大量增殖提供了條件，且發(fā)病豬只與無(wú)癥狀豬只未進(jìn)行隔離，加劇了病原的傳播，故豬場(chǎng)應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，豬舍內(nèi)要合理通風(fēng)換氣，搞好環(huán)境衛(wèi)生。現(xiàn)階段，非洲豬瘟給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的損失，豬場(chǎng)應(yīng)提高生物安全防控意識(shí)，及時(shí)隔離發(fā)病豬只，并做好消毒工作，在防控非洲豬瘟的同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)PRRSV、PCV2 和PRV 等病毒性和細(xì)菌性病原的防控，凈化這些病原，提高豬場(chǎng)效益。據(jù)場(chǎng)主介紹，該地方黑豬較少使用抗生素和疫苗，從藥敏試驗(yàn)結(jié)果也可看出，該菌株對(duì)大部分抗生素高度敏感，便于細(xì)菌性疾病的快速扼制，減少經(jīng)濟(jì)損失。抗生素的謹(jǐn)慎使用有利于養(yǎng)殖戶保持豬場(chǎng)生產(chǎn)效益的同時(shí)，也有利于國(guó)家2020 年全面實(shí)現(xiàn)“無(wú)抗”養(yǎng)殖政策的實(shí)施。

本案例經(jīng)過(guò)實(shí)地調(diào)查、臨床觀察、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室診斷的有效結(jié)合，做出了合理的綜合診斷。并根據(jù)檢測(cè)結(jié)果，制定了一系列針對(duì)性的治療及防控措施，通過(guò)連續(xù)跟蹤回訪，顯示該措施切實(shí)可行，行之有效，這為豬場(chǎng)多殺性巴氏桿菌病的診斷和防控提供了基本原則和數(shù)據(jù)上的支持。