李 俊，毛世明，陳大芳，龍清孟，周 迪，李 平，張 勇，張 雄，馮文武，李明勇，尹楊莎，唐明宗

（1.貴州省種畜禽種質(zhì)測(cè)定中心，貴州 貴陽(yáng) 550021；2 貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025；

3.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550021）

SIM1（Single-minded 1）基因是一種編碼與神經(jīng)發(fā)生有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，是堿性-螺旋-環(huán)-螺旋（basic helix-loop-helix, bHLH）轉(zhuǎn)錄因子超家族中新發(fā)現(xiàn)的亞家族成員之一[1]，通過(guò)影響下丘腦視上核和室旁核神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞在哺乳動(dòng)物能量平衡調(diào)節(jié)中的作用，從而影響動(dòng)物的采食行為，可導(dǎo)致食欲過(guò)盛、肥胖和體重增加[2]。Holder 等[3]研究發(fā)現(xiàn)SIM1基因平衡易位會(huì)導(dǎo)致兒童肥胖。Tolson 等[4]發(fā)現(xiàn)SIM1+/-和SIM1-/-小鼠食量增加，比同窩正常小鼠肥胖，且催產(chǎn)素（Oxytocin）和黑素皮質(zhì)素激素（MC4R）在下丘腦內(nèi)的表達(dá)量顯著降低；由此，Traurig 等[5]推測(cè)SIM1基因可能參與瘦素—黑素皮質(zhì)激素—催產(chǎn)素這一調(diào)控途徑，進(jìn)而導(dǎo)致肥胖，并通過(guò)DNA 測(cè)序發(fā)現(xiàn)SIM1基因一處非編碼區(qū)突變位點(diǎn)與印第安人的體脂指數(shù)顯著相關(guān)。Zhao 等[6]應(yīng)用輻射雜交細(xì)胞系（RH）將SIM1基因定位到豬染色體1p13，并且在SIM1基因內(nèi)含子七的607 bp（A/G）和SIM1外顯子八的780 bp（C/T）處檢測(cè)到兩個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)該突變和生長(zhǎng)率、背膘厚、眼肌面積、腿部脂肪重、日增重以及肌內(nèi)脂肪含量顯著相關(guān)。因此推測(cè)，SIM1基因可能是影響豬胴體性狀、生長(zhǎng)性狀和肉質(zhì)性狀的潛在功能基因。本文采用PCR 產(chǎn)物直接測(cè)序法，對(duì)已篩選到的SIM1基因3 個(gè)SNP 位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證和基因分型，分析該基因?qū)慕阖i胴體性狀的遺傳效應(yīng)，為進(jìn)一步利用分子標(biāo)記選育提純從江香豬奠定理論基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2018 年3 月至2019 年6 月在貴州省貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)羊昌鎮(zhèn)綠生源香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場(chǎng)和中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)樣品為74 頭從江香豬耳組織，采自貴陽(yáng)市烏當(dāng)區(qū)綠生源香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場(chǎng)。用耳號(hào)鉗取耳組織1.5 g，標(biāo)記后分別放入裝有1 mL 70%乙醇的2 mL 離心管中，帶回實(shí)驗(yàn)室-20 ℃保存，用于DNA 提取。

1.2.2 主要試劑及儀器 組織基因組DNA 提取試劑盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、瓊脂糖、DL 2 000 DNA Marker 等試劑均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；去離子水、無(wú)水乙醇、TAE 緩沖液等試劑實(shí)驗(yàn)室自備。PCR 擴(kuò)增儀（C1000 Touch），凝膠成相系統(tǒng)（G：BOX F3），紫外分光光度計(jì)（NanoDrop-ONE），去離子純水儀（Milli-Q Intergral 3）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DNA 提取 用基因組DNA 提取試劑盒提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，凝膠成像系統(tǒng)照相保存，并用紫外分光光度計(jì)測(cè)量每個(gè)DNA 樣品濃度3 次，取其平均值，用ddH2O 將所有DNA 樣品調(diào)至100ng/μL，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物設(shè)計(jì)與PCR 擴(kuò)增 參照GenBank（登錄號(hào)為NC_010443.5）提供的豬SIM1基因序列，以及李俊等[7]利用DNA 池在從江香豬群體中篩查到SIM1基因的12 個(gè)SNP 位點(diǎn)，運(yùn)用NCBI 中的Primer-BLAST 設(shè)計(jì)引物，委托賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司合成，引物序列及擴(kuò)增條件見(jiàn)表1。

表1 SIM1 基因引物序列、退火溫度、擴(kuò)增長(zhǎng)度及區(qū)域

1.3.3 PCR 反應(yīng)體系及條件 采用25 μL PCR 反應(yīng)體系，即DNA 模板2.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34 個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min；最后得到的PCR 產(chǎn)物4 ℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)照相保存，將檢測(cè)合格樣品送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)分析 測(cè)序得到的DNA 序列用DNAStar等軟件進(jìn)行序列對(duì)比，篩選SNP 位點(diǎn)，計(jì)算不同位點(diǎn)在受試群體中的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、群體遺傳純合度（Ho）、雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC）；根據(jù)最小二乘線性模型，分析不同基因型與樣本胴體性狀的關(guān)聯(lián)效應(yīng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，均顯示為一條特異性條帶，其片段長(zhǎng)度P1、P2、P3 分別為193 bp、194 bp、173 bp，與目的片段相符，條帶清晰、整齊無(wú)拖尾，可用于測(cè)序（圖1）。

2.2 測(cè)序結(jié)果分析

運(yùn)用SeqMan 軟件對(duì)所有樣品的測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)（圖2），C77T 位點(diǎn)分型為MM、MN、NN 基因型；C225T 位點(diǎn)分型為CC、CT、TT 基因型，A426G 位點(diǎn)分型為AA、AG、GG 基因型。通過(guò)序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，MM 基因型、CC 基因型、AA 基因型個(gè)體的序列與GenBank上提交的序列相一致，定義為野生型，NN 基因型、TT 基因型、GG 基因型定義為突變型，MN 基因型、CT 基因型、AG 基因型為雜合型。

圖1 部分PCR 產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

圖2 SIM1 基因3 個(gè)SNP 位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果

2.3 SNP 位點(diǎn)的基因型頻率及遺傳特異性分析

從群體遺傳學(xué)角度分析從江香豬SIM1基因SNP 位點(diǎn)的基因型和等位基因頻率（表2）。從表2可看出，對(duì)于C77T 位點(diǎn)，MM 基因型頻率最高，表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)基因型；M、N 等位基因頻率分別為87.8%、12.2%，且M 為優(yōu)勢(shì)等位基因。對(duì)于C225T 位點(diǎn)，CC基因型頻率最高，表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)基因型；C、T 等位基因頻率分別為76.3%、23.7%，且C 為優(yōu)勢(shì)等位基因。在A426G 位點(diǎn)上，AA 基因型和AG 基因型頻率一樣，均為35.1%，A、G 等位基因頻率分別為52.6%、47.4%，且A 為優(yōu)勢(shì)等位基因。

通過(guò)對(duì)C77T、C225T、A426G 位點(diǎn)的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，均發(fā)現(xiàn)這3 個(gè)SNP 位點(diǎn)在試驗(yàn)群體中純合度（Ho）較高，雜合度（He）則相對(duì)較低，表明這3 個(gè)SNP 位點(diǎn)在群體中的變異較??；3 個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.27、1.56、1.99；而A426G 位點(diǎn)最接近于實(shí)際檢測(cè)到的2 個(gè)等位基因數(shù)，說(shuō)明該位點(diǎn)的等位基因在群體中分布最均勻；3 個(gè)位點(diǎn)的多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.19、0.30、0.37，表明C77T 位點(diǎn)表現(xiàn)為低度多態(tài)（PIC＜0.25），C225T、A426G 位點(diǎn)變現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50），經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)結(jié)果表明，C77T、A426G、C225T 位點(diǎn)均未偏離Hardy-weinberg 平衡（P＞0.05）。

表2 從江香豬SIM1 基因3 個(gè)SNP 位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率及遺傳特異性分析

2.4 連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建

利用SHEsis 在線軟件對(duì)SIM1基因3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)進(jìn)行連鎖不平衡參數(shù)估計(jì)及單倍型構(gòu)建，見(jiàn)表3和表4，結(jié)果表明，r2和D'大于0，說(shuō)明3 個(gè)多態(tài)位點(diǎn)間分別處于連鎖不平衡狀態(tài)?？蓸?gòu)建7 種單倍型，即：M-C-G、M-C-A、M-T-A、N-C-A、M-T-G、N-T-A、N-C-G；分別命名為H1、H2、H3、H4、H5、H6、H7，其頻率分別為39.3%、28.2%、13.0%、8.1%、7.2%、3.4%、0.7%。

表3 3 個(gè)SNP 位點(diǎn)之間的連鎖不平衡參數(shù)估計(jì)

表4 3 個(gè)SNP 位點(diǎn)的單倍型構(gòu)建及頻率

2.5 SIM1 基因不同基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析

從江香豬SIM1基因C77T 位點(diǎn)、C225T 位點(diǎn)、A426G 位點(diǎn)不同基因型與肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚的最小二乘分析結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可知，在C77T 位點(diǎn)上，MM 基因型的肌內(nèi)脂肪和眼肌面積高于MN 和NN 基因型，但差異不顯著（P＞0.05），背膘厚為NN 基因型＜MN 基因型＜MM 基因型，且NN 基因型與MM 基因型差異顯著（P＜0.05），皮厚為NN 基因型最低。對(duì)于C225T 位點(diǎn)，肌內(nèi)脂肪和眼肌面積均為CC 基因型高于CT 基因型和TT 基因型，背膘厚和皮厚均為T(mén)T 基因型低于CC 基因型和CT基因型，且差異均不顯著（P＞0.05）。對(duì)A426G 位點(diǎn)，肌內(nèi)脂肪和眼肌面積為GG 基因型＞AG 基因型＞AA基因型，但差異不顯著（P＞0.05），背膘厚和皮厚均為AA 基因型最低，且AA 基因型的背膘厚顯著低于GG 基因型（P＜0.05）。

表5 不同基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析

通過(guò)SIM1基因的3 個(gè)SNP 位點(diǎn)不同基因型的聚合，產(chǎn)生15 種聚合基因型，采用最小二乘法分析與聚合基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性（表6），結(jié)果顯示，肌內(nèi)脂肪含量最高的為MMCCAA 組合基因型，最低的為MMTTAA 組合基因型；眼肌面積最高的為MNCCGG 組合基因型，最低的為MNTTAA 組合基因型；背膘厚和皮厚最低的均為MNTTAA 組合基因型，背膘厚和皮厚最高的均為MNCCGG 組合基因型；但不同聚合基因型間的肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚差異均不顯著（P＞0.05）。

表6 3 個(gè)SNP 位點(diǎn)聚合基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

SIM1基因是人類(lèi)和鼠肥胖癥的候選基因，缺失SIM1基因可導(dǎo)致視前核神經(jīng)元細(xì)胞不發(fā)育，影響哺乳動(dòng)物能量平衡和采食行為。Holder 等[8]報(bào)道，一名患者1 號(hào)和6 號(hào)染色體之間發(fā)生易位，破壞6 號(hào)染色體上的SIM1基因，導(dǎo)致出現(xiàn)肥胖癥。而小鼠試驗(yàn)研究[4]顯示，SIM1基因純合子小鼠在出生后不久就死亡，而雜合子小鼠能夠存活下來(lái)且出現(xiàn)食欲過(guò)盛和肥胖的癥狀，可見(jiàn)SIM1基因在維持動(dòng)物能量、食欲和體脂方面起著重要的作用。但目前關(guān)于SIM1基因的研究主要在人和小鼠上，在家畜家禽方面的研究較少。郭曉令等[9]對(duì)169 頭國(guó)內(nèi)外豬種的SIM1基因SNP 分析發(fā)現(xiàn)，國(guó)外豬種均存在CC、CT、TT 基因型，且純合基因型個(gè)體的背膘厚顯著大于雜合基因型個(gè)體；但在國(guó)內(nèi)豬種中只發(fā)現(xiàn)TT 基因型，這與陳哲等[10]在金皮F2 代資源家系豬SIM1基因發(fā)現(xiàn)CC、CT 和TT 3 種基因型不一致，推測(cè)其原因可能是品種差異或者SNP 位點(diǎn)的不同造成，且TT 基因型個(gè)體的背膘厚高于CC 基因型個(gè)體的背膘厚。Nezer等[11]、Beeckmann 等[12]和De 等[13]均在豬SIM1基因所在區(qū)域發(fā)現(xiàn)一個(gè)影響背膘厚、采食量和生長(zhǎng)率的數(shù)量性狀基因座（Quantitative Trait Locus, QTL）。由此可見(jiàn)，SIM1基因?qū)ωi的脂肪沉積具有顯著效應(yīng)。

本研究通過(guò)對(duì)74 頭從江香豬SIM1基因擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物全部測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與李俊等[7]利用DNA 池篩選出的SIM1基因C77T、C225T、A426G 位點(diǎn)結(jié)果相一致，證實(shí)DNA 混池篩查出的SNP 位點(diǎn)也具有一定的可靠性。而多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)3 個(gè)SNP 位點(diǎn)分別產(chǎn)生3 種不同的基因型，其中MM 基因型、CC 基因型、AA 基因型表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)基因型，且M、C 和A 表現(xiàn)為優(yōu)勢(shì)等位基因。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示3 個(gè)SNP 位點(diǎn)在該群體中分布均勻，且能比較合理地提供遺傳信息。因此，通過(guò)連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)，上述3 個(gè)SNP 位點(diǎn)兩兩之間均處于連鎖不平衡狀態(tài)。一個(gè)群體中單倍型的頻率不能小于0.03%，因此單倍型頻率未達(dá)到0.03%的未參與統(tǒng)計(jì)，對(duì)應(yīng)的單倍型組合也應(yīng)忽略，SHEsis 在線軟件在單倍型分析過(guò)程中，系統(tǒng)會(huì)自動(dòng)刪除不符合條件的單倍型組合[14-15]，從而構(gòu)建7 種單倍型，其中H1、H2 和H3 為主要單倍型。由于該研究的試驗(yàn)樣本較少，發(fā)現(xiàn)的SNP 位點(diǎn)少，有些單倍型所占比例太小，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成一定的誤差，未進(jìn)行單倍型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析，因此，還需進(jìn)一步擴(kuò)大試驗(yàn)樣本加以驗(yàn)證。

關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，C77T、C225T、A426G 位點(diǎn)不同基因型以及聚合基因型與肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、皮厚之間差異均不顯著（P＞0.05），C77T、A426G 位點(diǎn)不同基因型從江香豬背膘厚差異顯著（P＜0.05）。MM基因型、CC 基因型、GG 基因型的肌內(nèi)脂肪和眼肌面積高于其他基因型；NN 基因型、TT 基因型、AA 基因型的背膘厚和皮厚低于其他基因型；肌內(nèi)脂肪最高的為MMCCAA 聚合基因型，眼肌面積最高的為MNCCGG 聚合基因型；背膘厚和皮厚最低的均為MNTTAA 聚合基因型。但由于本試驗(yàn)樣本數(shù)少、品種單一，具有一定局限性。因此，在今后的研究中，將擴(kuò)大樣本數(shù)，并在肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚差異較大品種中驗(yàn)證這3 個(gè)SNP 位點(diǎn)是否對(duì)從江香豬胴體性能產(chǎn)生影響，為今后推動(dòng)從江香豬高產(chǎn)肉性能品系的選育提供參考。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SIM1基因C77T、C225T、A426G 位點(diǎn)可能是影響從江香豬胴體性能的3 個(gè)分子標(biāo)記，可以將MM 基因型、CC 基因型、GG 基因型、MMCCAA聚合基因、MNCCGG 聚合基因型作為影響從江香豬肌內(nèi)脂肪和眼肌面積的有利基因型；將NN 基因型、TT 基因型、AA 基因型和MNTTAA 聚合基因型作為影響從江香豬背膘厚和皮厚有利基因型。