章學(xué)東，王歡歡，葛瑩，宋丹丹，張雷，李慶海，樓立峰

（杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，杭州310024）

G 蛋白α 亞基（G-protein alpha subunit,GNAS）處于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，它是跨膜G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的關(guān)鍵元件，參與很多神經(jīng)遞質(zhì)、自分泌/旁分泌因子、激素相關(guān)的生命活動(dòng)，例如5-羥色胺和多巴胺傳遞、胰島素分泌、黑色素合成等[1-3]。在人和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，GNAS基因通常具有1～12或13 個(gè)外顯子，但呈現(xiàn)比較復(fù)雜的父源、母源或雙性印記表達(dá)模式，這與該基因存在多個(gè)可變啟動(dòng)子和甲基化區(qū)域有關(guān)[4]。因此，GNAS基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)不同的剪接形式，可翻譯為多種蛋白，如Gαs、XLαs、Nesp55（或Nespas）、A/B（ex 1A）和AS（Alex）等[5-6]。其中：Gαs 在絕大多數(shù)組織中呈雙性表達(dá)，是最典型的GNAS 蛋白；而XLαs 則表現(xiàn)為父源等位基因轉(zhuǎn)錄，它與Gαs的區(qū)別在于第1外顯子，XLαs的第1外顯子較大且遠(yuǎn)在Gαs第1外顯子的前方[7-8]。最新NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)檢索表明，雞GNAS 基因位于第20 號(hào)染色體（NCBI 參考序列號(hào)：NC_006107.5，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_006107.5）上，全長(zhǎng)為130 648 bp（前一版NCBI 參考序列號(hào)NC_006107.4 中為48 456 bp，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_006107.4），預(yù)測(cè)其存在X1～X4等4 種轉(zhuǎn)錄剪接體，但尚無(wú)這方面的實(shí)例報(bào)道。我們前期通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（polymerase chain reaction of restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP）和DNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)，雞GNAS 基因的突變與雞膚色性狀顯著相關(guān)[9]，但該基因的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)并不明確；因此，本研究旨在進(jìn)一步通過(guò)5′和3′cDNA 末端快速擴(kuò)增（rapid-amplification cDNA ends, RACE）技術(shù)對(duì)雞GNAS 基因進(jìn)行克隆測(cè)序，探尋該基因的不同剪接形式及其轉(zhuǎn)錄剪接體的組織表達(dá)情況。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)雞

試驗(yàn)雞為來(lái)自杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院培育的90日齡HW1系烏骨雞。該品系雞的每個(gè)世代采用群體制種方法進(jìn)行保存，羽毛均為黑色片羽，皮膚以黑色為主，少部分膚色為白色。育雛育成期采用地面墊料平養(yǎng)；120 日齡左右上籠飼養(yǎng)。按種雞免疫程序進(jìn)行免疫。

1.1.2 主要試劑

MiniBEST Universal RNA 提取試劑盒（TaKaRa公司，美國(guó)）；SMARTer RACE 5′/3′試劑盒（Clontech公司，美國(guó)）；瓊脂糖、無(wú)水乙醇、乙二胺四乙酸二鈉鹽（EDTA-2Na·2H2O）、NaCl、Tris-HCl、硼酸、冰乙酸等試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚半乳糖苷（X-gal）、氨芐青霉素[天根生化科技（北京）有限公司]；質(zhì)粒小提試劑盒（Qiagen公司，美國(guó)）。

1.1.3 儀器設(shè)備

Opticon?2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、電泳儀、電泳槽（BIO-RAD公司，美國(guó)），5417R高速冷凍離心機(jī)、微量移液器、PCR儀（Eppendorf公司，德國(guó)），液氮罐、CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo公司，美國(guó)），凝膠成像系統(tǒng)（Alpha Innotech 公司，美國(guó)），超純水儀（PALL 公司，美國(guó)），電子天平（Mettler Toledo公司，瑞士），超凈工作臺(tái)（江蘇省蘇州凈化設(shè)備有限公司），微型臺(tái)式離心機(jī)（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司），YKKY雪花制冰機(jī)（北京長(zhǎng)流科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 方法步驟

1.2.1 組織樣本采集

屠宰采集8只90日齡試驗(yàn)雞的多種組織樣本，包括胸側(cè)皮膚、胸肌、腹脂、腦、肺、心和肝等，于液氮中保存。

1.2.2 總RNA 提取

根據(jù)TaKaRa 公司總RNA 提取試劑盒（產(chǎn)品編號(hào)：9767）的使用說(shuō)明，分別提取各組織樣本的總RNA，于-20 ℃保存，備用。

1.2.3 5′和3′RACE 實(shí)驗(yàn)

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)Ensemble 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://asia.ensembl.org/Gallus_gallus/Gene/Sequence?db=core;g=ENSGALG 00000030859;r=20:10918207-11045636）中的雞GNAS基因序列，設(shè)計(jì)5′和3′RACE引物（表1）。

表1 GNAS基因的RACE引物信息Table 1 RACE primer information of GNAS gene

1.2.3.2 cDNA合成

取1 μL RNA 與1 μL 5′-CDS 引物A 和9 μL ddH2O（5′ RACE）或1 μL RNA 與10 μL ddH2O（3′RACE）混合離心后，放入PCR儀中，于72 ℃條件下孵育3 min，42 ℃條件下冷卻2 min。然后加入1 μL SMARTer ⅡA 寡核苷酸、4 μL 5×第1鏈緩沖液、0.5 μL 二硫蘇糖醇（DTT）（100 μmol/L）、1 μL dNTPs（20 mmol/L）、0.5 μL RNase 抑制劑(40 U/μL)、2 μL SMARTScribeTM反轉(zhuǎn)錄酶（100 U），混勻，離心，在42 ℃條件下孵育90 min，70 ℃條件下加熱10 min，終止反應(yīng)。

1.2.3.3 巢式PCR

將上述cDNA 溶液加入到90 μL 乙二胺四乙酸（EDTA）中進(jìn)行稀釋后，開(kāi)始第1 輪PCR 反應(yīng)；將第1 輪產(chǎn)物稀釋50 倍后，進(jìn)行第2 輪PCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系（50 μL）如下。第1 輪：cDNA 稀釋液2.5 μL，2×SeqAmpTM緩沖液25 μL，SeqAmpTMDNA 聚合酶1 μL，10×通用長(zhǎng)引物（UPM long）5 μL，10 μmol/L基因特異性引物（5′GSP-1 或3′GSP-1）1 μL，ddH2O 15.5 μL。第2 輪：產(chǎn)物稀釋液5 μL，2×SeqAmpTM緩沖液25 μL，SeqAmpTMDNA聚合酶1 μL，10×通用短引物（UPM short）1 μL，10 μmol/L 基因特異性引物（5′GSP-2 或3′GSP-2）1 μL，ddH2O 17 μL。反應(yīng)程序如下。第1 輪：94 ℃變性30 s，72 ℃退火、延伸3 min，5 個(gè)循環(huán)；接著94 ℃變性30 s，70 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，5 個(gè)循環(huán)；然后94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，25 個(gè)循環(huán)。第2 輪：94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸3 min，20個(gè)循環(huán)。

1.2.4 克隆測(cè)序

將巢式PCR 產(chǎn)物割膠、回收、純化，連接到pRACE 載 體 上，取2.5 μL 反 應(yīng) 液 加 入 到50 μL Stellar感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻；取3 μL轉(zhuǎn)化液加入到降解物阻遏的超級(jí)優(yōu)化肉湯（super optimal broth with catabolite repression, SOC）培養(yǎng)基上，補(bǔ)齊至100 μL；然后將其涂布于預(yù)熱的溶菌肉湯（lysogeny broth, LB）培養(yǎng)板（含適量氨芐青霉素）上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。隨機(jī)挑取10個(gè)陽(yáng)性菌落，搖菌擴(kuò)繁，參照Qiagen 質(zhì)粒小提試劑盒使用說(shuō)明，抽提質(zhì)粒后送杭州擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序；拼接得到轉(zhuǎn)錄剪接體全長(zhǎng)序列。

1.2.5 生物信息學(xué)分析

運(yùn)用DNAMAN 6.0 軟件（Lynnon Biosoft 公司，美國(guó)）搜索克隆得到的雞GNAS 基因轉(zhuǎn)錄剪接體全長(zhǎng)序列的開(kāi)放閱讀框，定義編碼序列（coding sequence,CDS）位置，然后進(jìn)行氨基酸的編碼翻譯。

選擇人（Homo sapiens）、小鼠（Mus musculus）2個(gè)物種，運(yùn)用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLASTP 程序（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome），進(jìn)行轉(zhuǎn)錄剪接體編碼蛋白序列的同源性比對(duì)，建樹(shù)方法為快速最小進(jìn)化（fast minimum evolution）法，最大序列差比（max seq difference）為0.85。

運(yùn)用NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的COBALT 程序（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/），進(jìn)行2 種轉(zhuǎn)錄剪接體的編碼蛋白與4條預(yù)測(cè)的雞GNAS基因蛋白序列的同源性比對(duì)。

1.2.6 表達(dá)量檢測(cè)

根據(jù)測(cè)序拼接得到的轉(zhuǎn)錄剪接體全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)目的基因的mRNA引物（表2），內(nèi)參基因?yàn)镽PL4（NCBI參考序列號(hào)：NM_001007479.1）。

定 量PCR 反 應(yīng) 體 系：cDNA 1 μL，SYBR?Premix Ex Taq Mix（2×）10 μL，上、下游引物各0.5 μL，加水補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火、延伸40 s，40個(gè)循環(huán)。繪制55～95 ℃范圍內(nèi)的熔解曲線，每0.2 ℃讀板一次。每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù)，記錄CT值，用2-△△CT法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析

運(yùn)用GraphPad Prism 6.0 軟件對(duì)雞GNAS 基因轉(zhuǎn)錄剪接體的各組織表達(dá)量進(jìn)行單因素方差分析并制圖，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 表達(dá)量檢測(cè)所用引物信息Table 2 Primer information of gene expression detection

2 結(jié)果與分析

2.1 RACE 和克隆結(jié)果

運(yùn)用5′和3′RACE法對(duì)雞GNAS基因進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增，得到的瓊脂糖凝膠電泳條帶見(jiàn)圖1。從中可見(jiàn)，5′和3′RACE均出現(xiàn)特異性條帶，大小約為1 000 bp。測(cè)序發(fā)現(xiàn)存在2種克隆子，拼接得到的這2 種克隆子序列長(zhǎng)度分別為1 554 bp 和1 796 bp。經(jīng)比對(duì)，克隆子中各個(gè)外顯子片段長(zhǎng)度及所在基因組位置見(jiàn)表3?？寺∽?與克隆子2均含有12個(gè)外顯子，二者僅第1外顯子的長(zhǎng)度和位置不一樣，前者在后者上游，相距46 897 bp；其余11個(gè)外顯子相同。

2.2 轉(zhuǎn)錄剪接體全長(zhǎng)序列分析

克隆得到的雞GNAS 基因的2 種轉(zhuǎn)錄剪接體的全長(zhǎng)序列及編碼情況見(jiàn)圖2。從中可知：克隆子1全長(zhǎng)1 554 bp，CDS 區(qū)從5′端的第55 個(gè)堿基開(kāi)始，至1 308 bp 處結(jié)束，共計(jì)編碼417 個(gè)氨基酸；克隆子2全長(zhǎng)1 796 bp，CDS 區(qū)從5′端的第411 個(gè)堿基開(kāi)始，至1 550 bp 處結(jié)束，共計(jì)編碼379 個(gè)氨基酸。克隆子1的第1外顯子編碼84個(gè)氨基酸，克隆子2的第1外顯子編碼46個(gè)氨基酸。2種轉(zhuǎn)錄剪接體的第2-12 外顯子完全相同，均編碼333 個(gè)氨基酸；第12 外顯子中的3′非翻譯區(qū)（untranslated region, UTR）長(zhǎng)度為246 bp。

2.3 序列同源性分析

圖1 雞GNAS基因的5′和3′RACE擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR products of 5′and 3′RACE of chicken GNAS gene

克隆得到的雞GNAS 基因的2 種轉(zhuǎn)錄剪接體與人、小鼠、雞等物種的蛋白同源性比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3和表4。從中可見(jiàn)，克隆子2編碼的379個(gè)氨基酸（aa）序列與已知的人和小鼠的GNAS基因Gαs亞基同源相似度達(dá)93%，明顯高于與XLαs 亞基的同源性（相似度84%～87%）。克隆子1編碼的417 aa序列與已知的人和小鼠的GNAS基因XLαs亞基同源性較高，相似度最高達(dá)87%（330/379 aa），與其他2 條XLαs亞基的相似度為84%，這主要是因?yàn)檫@2條XLαs亞基中間多了一段15 aa序列，導(dǎo)致相似度降低；此外，雖然417 aa 序列與2 條Gαs 亞基的相似度也達(dá)到87%，但二者相似氨基酸的數(shù)目要比XLαs 亞基少7～8 aa（323/370 aa，322/370 aa）。經(jīng)與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中4 種預(yù)測(cè)的雞GNAS 基因蛋白亞基比較發(fā)現(xiàn)，417 aa 序列與預(yù)測(cè)的X1亞基、379 aa 序列與預(yù)測(cè)的X2亞基的同源相似度均達(dá)到100%，但這2種預(yù)測(cè)蛋白亞基對(duì)應(yīng)的mRNA 序列長(zhǎng)度卻在5 000 bp 以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于克隆得到的剪接體長(zhǎng)度。

表3 雞GNAS基因經(jīng)RACE得到的克隆子信息Table 3 Information of the clones obtained from RACE of chicken GNAS gene

2.4 組織表達(dá)量分析

心、腦、皮膚等不同組織中雞GNAS基因的2種轉(zhuǎn)錄剪接體的表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。從中可見(jiàn)，雞GNAS 基因克隆子1 和克隆子2 在7 種組織中均有不同程度的表達(dá)。其中：在腦組織中的表達(dá)量最高，與其他6 種組織的差異均極顯著（P＜0.01）；在皮膚組織中的表達(dá)量次之，基本極顯著高于在其他5種組織中的表達(dá)量（P＜0.01，除克隆子2在皮膚與肺組織中的表達(dá)量在P＜0.05水平上差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外）；在肺、胸肌、肝、心、腹脂等組織中的表達(dá)量較低，且組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.01）；相對(duì)而言，克隆子1在腹脂組織中的表達(dá)量最低，克隆子2在肝組織中的表達(dá)量最低。

3 討論與結(jié)論

本研究找到了雞GNAS 基因的2 種轉(zhuǎn)錄剪接狀態(tài)，而據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)資料，人和小鼠的GNAS 基因分別存在多達(dá)26種和16種已知的或預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄剪接 形 式，可 翻 譯 形 成 不 同 的Gαs、Alex、XLαs、Nesp55等蛋白亞基。GNAS基因存在許多轉(zhuǎn)錄剪接體，這應(yīng)該與mRNA 前體的選擇性剪接有關(guān)，即基因在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，其mRNA前體通過(guò)不同的剪接方式（選擇不同的剪接位點(diǎn)）產(chǎn)生不同的mRNA 剪接異構(gòu)體。學(xué)界普遍認(rèn)為，mRNA 前體的可變剪接，是調(diào)節(jié)基因表達(dá)和產(chǎn)生蛋白質(zhì)組多樣性的重要機(jī)制，也是生物體基因和蛋白質(zhì)數(shù)量差異較大的主要原因[10-11]。對(duì)于作用于神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的基因，其可變剪接現(xiàn)象更為常見(jiàn)，這與2大系統(tǒng)的功能多樣性和反應(yīng)敏感性密切相關(guān)[12-13]。GNAS 基因參與了眾多神經(jīng)遞質(zhì)、免疫因子等相關(guān)的生命活動(dòng)，是關(guān)鍵的信號(hào)通路元件，其轉(zhuǎn)錄剪接形式多樣也在情理之中。因此，雞GNAS基因除了本研究找到的2種轉(zhuǎn)錄剪接體，很可能還存在更多的剪接體。

圖2 雞GNAS基因2種轉(zhuǎn)錄剪接體的全長(zhǎng)序列Fig.2 Full-length sequences of two transcriptional spliceosomes of chicken GNAS gene

圖3 雞GNAS基因2種轉(zhuǎn)錄剪接體的蛋白同源性比對(duì)結(jié)果Fig.3 Protein homology alignment results of two transcriptional spliceosomes of chicken GNAS gene

通過(guò)考察人和小鼠的GNAS 基因剪接體發(fā)現(xiàn)，Gαs 和XLαs 在第2 外顯子之后的mRNA 組成序列比較一致，二者區(qū)別主要在第1 外顯子：人XLαs 的第1和第2外顯子相距約40 kb（小鼠約為33 kb），而Gαs 的第1 和第2 外顯子相距約6.1 kb（小鼠約為3.7 kb）；且XLαs的第1外顯子編碼氨基酸數(shù)目大于Gαs。本研究得到的雞GNAS基因克隆子1的第1和第2 外顯子相距約50 kb，而克隆子2 的相應(yīng)間距只有約3.3 kb；同時(shí)，蛋白同源性比對(duì)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，雞GNAS 基因克隆子1 與人和小鼠XLαs 的同源性較高，而與Gαs的同源性稍低。因此，我們有理由認(rèn)為找到的克隆子1 就是雞GNAS 基因的XLαs 剪接形式。

表4 同源比對(duì)涉及的蛋白序列及相關(guān)信息Table 4 Protein identification(ID)and related information involved in homologous alignment

圖4 雞GNAS基因2種轉(zhuǎn)錄剪接體的組織表達(dá)量Fig.4 Tissue expression level of two transcriptional spliceosomes of chicken GNAS gene

當(dāng)然，與人和小鼠XLαs 相比，雞XLαs 克隆子的5′UTR 區(qū)長(zhǎng)度較短，編碼氨基酸數(shù)較少。同時(shí)，與雞GNAS 基因的4 種預(yù)測(cè)剪接體相比，本研究找到的2 種轉(zhuǎn)錄剪接體的3′UTR 區(qū)長(zhǎng)度要短約3 000 bp。5′UTR 和3′UTR 區(qū)雖然不是翻譯蛋白的組成序列，但它們包含的特殊結(jié)構(gòu)和一些順式作用元件，如5′UTR 區(qū)uORFs 和uAUGs、3′UTR 區(qū)APA等，會(huì)參與翻譯調(diào)節(jié)，影響轉(zhuǎn)錄后的各個(gè)方面，包括mRNA 的轉(zhuǎn)運(yùn)、穩(wěn)定性及翻譯效率等[14-15]。本研究得到的雞GNAS 基因5′UTR 和3′UTR 區(qū)長(zhǎng)度雖短，但可能與研究涉及的種屬特異性有關(guān)，這在mRNA的表達(dá)檢測(cè)結(jié)果中也有所反映。

從本研究測(cè)定的組織表達(dá)情況來(lái)看，雞GNAS基因的2 種轉(zhuǎn)錄剪接體在腦、皮膚組織中的表達(dá)量與其他組織相比均要高得多，其中XLαs 剪接體在腦組織中的表達(dá)差異更為顯著。前面提到，GNAS基因參與神經(jīng)遞質(zhì)活動(dòng)，它在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（腦）中的表達(dá)量理應(yīng)較為豐富，因此雞與人、小鼠腦中的GNAS 基因表達(dá)量檢測(cè)結(jié)果[16-18]是相符的。但與人和小鼠相比，雞GNAS 基因在皮膚中的表達(dá)水平也較高，推測(cè)這與物種差異有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，雞皮膚具有無(wú)疤痕愈合現(xiàn)象[19]，表明其抗炎再生性強(qiáng)、免疫因子活躍，這可能是雞皮膚中GNAS 基因表達(dá)量高的原因之一。此外，我們發(fā)現(xiàn)，雞GNAS 基因的2種轉(zhuǎn)錄剪接體在不同組織間的表達(dá)水平存在差異，表明二者有不同的表達(dá)方式或功能。據(jù)報(bào)道，基因的可變剪接一般具有時(shí)空（發(fā)育階段、組織、疾病狀態(tài)）表達(dá)的特異性[20-21]，本研究只涉及90日齡雞的7種組織，所以今后還需要不斷完善雞GNAS 基因的表達(dá)譜。