李夏，夏文君，毛鍶超，盧舒婷，莫開昆，廖敏，周繼勇，鄭肖娟

（浙江大學動物科學學院，農業(yè)農村部動物病毒學重點實驗室，杭州310058）

禽腺病毒（fowl adenovirus, FAdV）是腺病毒科腺病毒屬的一員。目前，F(xiàn)AdV可分為5類（A～E）共12種血清型（1～7、8a、8b、9～11）[1-2]。血清4型禽腺病毒（FAdV4）感染引起包涵體肝炎-心包積液綜合征（hydropericardium hepatitis syndrome, HHS）。該病于1987年在巴基斯坦的安卡拉地區(qū)被首次報道，因此，又被稱為安卡拉病[3]。2010年以前，F(xiàn)AdV4在我國沒有形成較大的流行趨勢，但自2015年夏季開始在我國東南沿海地區(qū)大肆爆發(fā)[4]，加拿大、日本、印度、波蘭等一些國家也陸續(xù)爆發(fā)該病[5-6]。其典型致病特征是心臟腫脹、出血，心包腔內有大量淡黃色透明液體，肝腫大、出血，且呈淺褐色[7-8]；該病潛伏期短，發(fā)病快，死亡率高，給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經濟損失，已成為威脅我國養(yǎng)禽業(yè)的重大疫病之一。

目前，國內外對血清4 型禽腺病毒的研究主要集中在分離鑒定[9-10]、基因序列分析、疫苗研制[11-12]和致病性[13-14]分析等方面。楊曉偉等分離出一株FAdV4山東株，并制備出對FAdV4感染具有良好防治效果的卵黃抗體[15]。梁廣成對FAdV4 分離株的全基因組及致病性進行了研究，并初步建立了抗體間接免疫熒光方法[16]。劉延珂等研究發(fā)現(xiàn)，近年來在中國流行的高致病性FAdV4 毒株能夠在雞肝癌細胞系LMH 中很好增殖，并且不同時間點的病毒滴度與病毒基因組拷貝數(shù)呈正相關[17]。WANG 等制備出具有良好中和活性的Fiber-2 蛋白的單克隆抗體[18]。另有報道稱，基于Fiber-2蛋白的亞單位疫苗可提供比滅活油乳劑疫苗更快更強的免疫保護能力[19]。GUAN 等對FAdV4 四川分離株的全基因組及hexon 基因進行了遺傳分析，揭示了其ORF29開放閱讀框的缺失，為近年來FAdV4毒力的增強提供了一定的理論猜想[20]。本實驗從2015 年浙江省某雞場爆發(fā)的出現(xiàn)HHS 典型癥狀的肝組織中成功分離到FAdV4 浙江株，并對其全基因組、hexon 和fiber-2 基因進行遺傳進化分析，為進一步研究FAdV4的流行特點及毒力變異機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

UNIQ-10 柱式病毒基因組抽提試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，TRI201 LS 購自上海普飛生物技術有限公司，KOD-Plus-Neo 高保真DNA 聚合酶購自上海碩盟生物科技有限公司，Taq酶、100 bp DNA梯狀標志物和1 kb DNA分子標志物購自寶生物工程（大連）有限公司，反轉錄試劑盒購自Thermo公司，2×Taq Plus 反應混合物購自南京諾唯贊生物科技有限公司，DNA清潔回收試劑盒和DNA 凝膠回收試劑盒購自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，pMD18-T載體購自寶生物工程（大連）有限公司，SPF 雞胚購自浙江寧波純派農業(yè)科技有限公司，達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自以色列BI公司，β-actin 單抗購自美國Thermo 公司，辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG、異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠IgG 均購自美國KPL 公司，NDV-Lasota 疫苗毒株購自青島易邦生物工程有限公司，禽腺病毒Hexon和Fiber-2鼠多抗血清由本實驗室制備、保存。

1.2 病料采集與處理

將2015 年浙江某雞場疑似HHS 的病死雞肝剪碎后充分研磨，用滅菌生理鹽水按體積比1∶3稀釋，加入終濃度為1 000 U/mL 的青鏈霉素，反復凍融3次，于4 ℃、1.2×104r/min條件下離心10 min，取上清液，并進行過濾除菌，分裝后置于-80 ℃冰箱凍存。

1.3 病毒懸液的核酸提取和檢測

按照UNIQ-10 柱式病毒基因組抽提試劑盒說明書進行病毒DNA的抽提，利用Trizol法提取病毒懸液中的RNA，使用反轉錄試劑盒將RNA 反轉錄為cDNA。反轉錄程序為：25 ℃變性5 min，42 ℃延伸60 min，72 ℃失活10 min。根據(jù)GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）發(fā)表的FAdV4的hexon基因保守區(qū)序列設計1 對FAdV4 的檢測引物，同時根據(jù)其他常見禽病病原相關基因的保守序列（AIV/M、IBDV/VP2、NDV/NP、IBV/S1、MDV/132 bp 重復區(qū)域、EDSV/100 kDa）設計用于多種禽病病原排除檢測的引物對（表1）。以提取的DNA 或反轉錄合成的cDNA 為模板，利用表1 所示的檢測引物，以2×Taq Plus 反應混合物擴增目的基因。聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction, PCR）體系為：2×Taq Plus反應混合物12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR/反轉錄-PCR反應程序為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。取PCR擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 雞常見病原的鑒別檢測引物Table 1 Detection primers for common pathogens in chickens

1.4 病毒在雞胚及雞胚腎細胞中的傳代培養(yǎng)

將經研磨處理的肝上清液通過尿囊腔注射法接種于10 日齡SPF 雞胚中，0.2 mL/枚，然后置于37 ℃環(huán)境下孵育，每日觀察，收集接種后5 d內雞胚尿囊液和胚體，剖檢并觀察胚體的病理變化，對收集的雞胚尿囊液進行病毒核酸的檢測鑒定。取17～20 日齡SPF 雞胚腎組織，參照繆從容等[21]的方法制備新鮮的原代雞胚腎（chicken embryo kidney,CEK）細胞，并根據(jù)CEK細胞的貼壁生長、細胞形態(tài)多呈上皮樣等特性，在接毒前多次換液以去除不貼壁的細胞，獲得純度較高的CEK細胞。將雞胚上傳至第3 代的尿囊液接種CEK 細胞后進一步進行細胞連續(xù)傳代，傳至11 代后，收集細胞毒進行病毒檢測和鑒定。

1.5 血凝實驗

在常溫下，將收集到的尿囊液及細胞適應病毒的懸液用生理鹽水進行2的倍比稀釋，然后加入1%的雞、小鼠、大鼠、綿羊等多種動物的紅細胞懸液進行血凝（hemagglutination,HA）實驗，以NDV-Lasota疫苗株作為陽性對照，觀察尿囊液和細胞毒能否對各種動物紅細胞產生凝集現(xiàn)象。

1.6 病毒半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量測定

在半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（50% tissue culture infective dose,TCID50）測定前一天制備CEK 細胞，并鋪于96 孔細胞培養(yǎng)板中，100 μL/孔；在進行TCID50測定當天換液。將病毒用DMEM 培養(yǎng)基進行10倍梯度稀釋（從10-1稀釋到10-11），將稀釋后的病毒接種CEK 細胞，每孔50μL，每個稀釋度重復8孔。在接毒后48 h，用細胞固定液將細胞固定，以Fiber-2 蛋白的多抗血清作為一抗，以FITC 標記的羊抗鼠IgG 作為二抗，對感染細胞進行間接免疫熒光實驗，通過倒置熒光顯微鏡觀察Fiber-2 陽性細胞，按Reed-Muench法[22]計算病毒的TCID50。

1.7 雞胚致病性實驗及接毒雞胚肝組織中Fiber-2蛋白的檢測

將60枚10日齡SPF雞胚平均分成6組，第1-5組分別以尿囊腔注射法接種FAdV4-ZJ2015的第3、7、8、9、11代細胞毒，接種劑量為0.2 mL/枚，第6組不接種病毒，為空白對照組。將雞胚置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育，棄去24 h內非正常死亡雞胚。逐日觀察接毒、未接毒雞胚有無死胚、弱胚現(xiàn)象，計算各組雞胚孵化率與死亡率，剖檢死亡雞胚和對照雞胚，觀察其肝、心等組織病變情況。每組取1 g雞胚肝組織，剪碎、研磨，取等量組織研磨液，以實驗室前期制備的Fiber-2多抗血清（體積比1∶1 000）作為一抗，HRP標記的羊抗鼠IgG（體積比1∶3 000）作為二抗，利用蛋白質印跡法（Western blotting）特異性檢測肝組織中病毒蛋白Fiber-2的表達，以β-actin作為內參對照。

1.8 病毒全基因組測序及序列分析

參照FAdV4-JSJ13（KM096544.1）毒株的全基因組測序引物[23]，并避開FAdV4 流行毒株可能存在的大段缺失位置，本文設計了分段PCR法擴增FAdV4全基因組的11 對引物（表2），并確保相鄰的2 對引物擴增產物之間有部分重疊區(qū)域。引物由擎科生物（杭州）股份有限公司合成。以抽提的病毒基因組DNA 為模板，利用表2 所列11 對擴增引物，采用KOD-Plus-Neo 熱啟動高保真DNA 聚合酶，參照產品說明書上的PCR 擴增體系分別擴增跨越FAdV4全基因組的11個目的基因片段，經Taq酶加A尾后，將其連接到pMD18-T載體上，經鑒定為陽性的重組菌液送至鉑尚生物技術（上海）有限公司測序。將測得的11 個片段序列用NCBI 在線軟件BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對其同源性，再用DNAman軟件的Multiple Sequence Assembly功能對片段進行拼接，并對結果進行人工校正。利用MegAlign 軟件的View/Sequence distance 功能對ZJ2015 與FAdV4 其他毒株的全基因組同源性進行比對分析，利用Mega 6.06 軟件中的Clustal W 程序分別完成ZJ2015 全基因組及hexon、fiber-2 基因序列的完全比對，并采用鄰接法構建遺傳進化樹，用最大似然復合（maximum composite likelihood）模型進行比對，自舉值（bootstrap value）設置為1 000。

表2 跨越FAdV4-ZJ2015株全基因組的11個片段的擴增引物Table 2 Primers to amplify 11 fragments covering the whole genome of FAdV4-ZJ2015 strain

2 結果與分析

2.1 HHS 發(fā)病雞的病原鑒定

將2015 年浙江省某雞場出現(xiàn)典型HHS 的發(fā)病雞肝組織研磨處理后，取上清懸液接種于雞胚并進行連續(xù)傳代。以表1列出的檢測引物，采用PCR/反轉錄-PCR方法對肝組織處理上清液和第1—3代雞胚尿囊液進行常見禽病病毒鑒定。1%瓊脂糖凝膠電泳分析結果顯示，F(xiàn)AdV 引物擴增獲得一條大小約900 bp 的條帶，與預期的FAdV 目的條帶大小相符（圖1A～B），但沒有檢測到傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus,IBV）、禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）、新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）、減蛋綜合征病毒（egg drop syndrome virus, EDSV）、馬立克病毒（Marek’s disease virus,MDV）及傳染性法氏囊病病毒（infectious bursal disease virus, IBDV）等常見禽病病原的擴增條帶（圖1C～D）。將擴增到的FAdV 片段測序分析顯示，該序列與FAdV4 的hexon 基因同源性高達100%，初步證明該浙江雞場感染的病原是FAdV4型，命名為ZJ2015。

2.2 FAdV4 的分離和細胞適應性分析

圖1 肝組織及雞胚尿囊液中病毒核酸的鑒別檢測Fig.1 Identification of viral nucleic acids in liver tissues and allantoic fluid of chicken embryos

將PCR檢測為腺病毒陽性的雞胚尿囊液第3代毒接種CEK細胞，細胞未出現(xiàn)明顯的病變效應。為了進一步分析病毒是否在CEK細胞中復制增殖，利用本實驗室制備的Fiber-2 和Hexon 蛋白的陽性血清對FAdV4-ZJ2015感染細胞進行間接免疫熒光檢測。結果顯示，F(xiàn)iber-2 和Hexon 蛋白陽性血清在FAdV4-ZJ2015感染的CEK細胞中均檢測到陽性細胞（圖2），說明FAdV4-ZJ2015 已適應在CEK 細胞上復制。將ZJ2015在CEK細胞上連續(xù)傳代至11代（P11），進一步經PCR/反轉錄-PCR對病毒核酸進行鑒定。結果顯示，F(xiàn)AdV4 核酸穩(wěn)定存在，沒有檢測到IBV、AIV、NDV、EDSV、MDV 及IBDV 的病毒核酸。

圖2 FAdV4-ZJ2015感染CEK細胞的間接免疫熒光檢測Fig.2 Indirect immunofluorescence assay of CEK cells infected with FAdV4-ZJ2015 strain

2.3 血凝實驗結果

將雞胚傳至3 代的尿囊液和在CEK 細胞上傳至11代的細胞上清液分別與雞、小鼠、大鼠、綿羊的紅細胞進行血凝實驗，以NDV-Lasota 疫苗毒株作為血凝實驗的陽性對照。結果顯示，分離的FAdV4-ZJ2015 毒株不具有凝集雞、小鼠、大鼠、綿羊紅細胞的能力。

2.4 病毒滴度TCID50測定結果

將ZJ2015 株第11 代細胞適應毒倍比（10-1、10-2、10-3……）稀釋后，接種到原代CEK細胞上，在感染后48 h固定細胞，利用Fiber-2鼠多抗血清進行間接免疫熒光法檢測，通過熒光顯微鏡觀察陽性細胞，根據(jù)Reed-Muench 公式計算ZJ2015 毒株第11代細胞適應毒的TCID50為2.0×106mL-1。

2.5 FAdV4-ZJ2015 的雞胚致病性

為了進一步分析FAdV4-ZJ2015毒株的雞胚致病性，將第3、7、8、9、11 代的ZJ2015 分離毒接種于10 日齡SPF 雞胚（0.2 mL/枚）中，每天觀察死胚、弱胚現(xiàn)象。結果表明：接種7 d內，無死胚現(xiàn)象；第8天血管明顯減弱，開始出現(xiàn)雞胚死亡；統(tǒng)計至第21天，陰性雞胚孵化率為90%，死亡率10%，接毒雞胚孵化率為0，死亡率為100%。對死亡雞胚剖檢發(fā)現(xiàn)，接毒組雞胚較陰性組雞胚個頭明顯偏?。▓D3A-a、3A-b），且接毒組雞胚心臟腫大、出血，但心包積液現(xiàn)象不明顯，肝腫脹、出血（圖3A-c、圖3A-d）。將ZJ2015的不同代次（P3、P7、P8、P9和P11）分離毒接種雞胚后的肝組織研磨，用Fiber-2多抗檢測肝中病毒蛋白Fiber-2的表達。結果顯示，不同代次分離毒均能成功感染雞胚的肝組織，而未接毒雞胚的肝研磨液無Fiber-2蛋白的表達（圖3B）。

2.6 FAdV4 全基因組的分段擴增和序列測定

抽提FAdV4-ZJ2015接種雞胚尿囊液中的病毒基因組DNA，以設計合成的11 對引物（表2），采用分段擴增法成功擴增到跨越ZJ2015 毒株FAdV4 的全基因組的11個片段（圖4），擴增的目的基因大小范圍為3.6～5.9 kb。將測得的11個片段連接pMD18-T載體后測序，獲得的序列信息經比對后進行序列拼接，并對結果進行多次校正，最終得到全長43 717 bp的禽腺病毒4型分離株（ZJ2015）的全基因組序列（GenBank登錄號：MF521611.1）。

2.7 FAdV4 全基因組遺傳進化分析

圖3 FAdV4-ZJ2015株的雞胚致病性實驗和肝組織中Fiber-2蛋白的表達Fig.3 Pathogenicity of FAdV4-ZJ2015 strain on chicken embryo and expression of Fiber-2 protein in the liver tissues

圖4 分段PCR 擴增法對FAdV4-ZJ2015 全基因組的擴增結果Fig.4 Amplification result of the whole genome of FAdV4-ZJ2015 by segmented PCR amplification

利用Mega 6.06 將ZJ2015 全基因組（全長43 717 bp，GC 含量54.87%）與不同血清型FAdV 毒株進行遺傳進化分析。結果顯示：ZJ2015毒株處于C型FAdV分支上；在這個分支內，ZJ2015與近年來我國分離到的FAdV4型毒株親緣關系更近，而與加拿大ON1（GU188428.1）、日本KR5（HE608152.1）、墨西哥MX-SHP95（KP295475.1）毒株親緣關系較遠（圖5）。用MegAlign 比對ZJ2015 與FAdV4 國外經典毒株及國內流行毒株的同源性顯示，ZJ2015株與2015 年以來國內流行的高致病力毒株的同源性在99.87%以上，與國外經典毒株略有差異，同源性在98.2%～99.0%之間（表3）。核酸序列分析顯示，與國外毒株相比，ZJ2015及近年流行的FAdV4毒株的GA和TC重復區(qū)出現(xiàn)不同程度的缺失，且在基因組3.5×104～4.0×104bp 位置處有一段長1 966 bp 的基因片段缺失突變，這導致基因組中ORF19、ORF27、ORF48這3個編碼蛋白的缺失。

2.8 基于Hexon 和Fiber-2 蛋白的遺傳進化分析

hexon基因高度保守，能很好地顯示禽腺病毒的分型特征。ZJ2015毒株的hexon基因全長2 814 bp，編碼937個氨基酸?；诎被崴降倪z傳進化分析顯示：ZJ2015毒株與國內流行毒株同屬FAdV4型；與墨西哥、日本、加拿大毒株有一定差異，屬于2個不同的分支（圖6A）。ZJ2015毒株的hexon編碼937個氨基酸，與國內多數(shù)毒株相同；而韓國株Kr-Yeoju（ADV35558.1）的hexon 編碼936 個氨基酸，表現(xiàn)在第196 位氨基酸缺失。中國毒株與印度B1-7（ANG08820.1）、日本KR5（CCE39367.1）和加拿大ON1（ADQ39061.1）毒株相比，第189 位氨基酸由Ⅰ突變成R，第196位氨基酸由E突變成Q，而這一現(xiàn)象在我國近年來流行的FAdV4毒株中均可發(fā)現(xiàn)。

圖5 基于ZJ2015全基因組核苷酸水平的系統(tǒng)進化分析Fig.5 Phylogenetic analysis based on the whole genome of ZJ2015 strain

表3 基于ZJ2015全基因組核苷酸水平的同源性比對Table 3 Homology alignment based on the whole genome of ZJ2015 strain

圖6 基于Hexon（A）和Fiber-2（B）蛋白的氨基酸水平系統(tǒng)進化分析Fig.6 Phylogenetic analysis based on amino acid levels of Hexon(A)and Fiber-2(B)proteins

fiber-2基因位于病毒粒子的五鄰體上，存在型和亞屬特異性抗原表位，能夠刺激機體產生較強的免疫應答。ZJ2015 毒株的fiber-2 基因全長1 440 bp，編碼479 個氨基酸。氨基酸水平的遺傳進化分析（圖6B）顯示：包括ZJ2015 株在內的國內流行毒株與巴基斯坦、科威特和印度毒株親緣關系較近；另外，韓國、澳大利亞和墨西哥毒株親緣關系較近，秘魯、厄瓜多爾和智利毒株親緣關系較近，分屬于同一大簇，早期日本、加拿大和德國毒株則處在另一簇，與近年出現(xiàn)的毒株親緣關系較遠?；趂iber-2基因氨基酸水平突變位點分析發(fā)現(xiàn)，ZJ2015毒株的11～16 位為ENGKPE，與國內毒株相同，但與ON1（GU188428）、KR5（FR872912）和MXSHP95（KP295475）毒株相比則出現(xiàn)了不同程度的插入和突變；同時，比對發(fā)現(xiàn)ZJ2015毒株在219位由G突變?yōu)镈，在232位由E突變?yōu)镼，在319位由V突變?yōu)镮，這些突變在國內流行毒株中均有發(fā)生，且這些突變毒株均為高致病性毒株。此外，ZJ2015毒株也發(fā)生了一些在其他位置上的突變（附表1，http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2019.03.041）。

3 討論

自2015 年以來，在中國多個地區(qū)爆發(fā)以HHS為典型特征的FAdV4感染。隨后，有多個研究機構采用雞胚接種、原代雞胚肝細胞（CEL）、原代CEK細胞或雞肝癌細胞系LMH 培養(yǎng)等途徑，從山東[16]、河南[13]、北京[24]、廣西[25]、江蘇[23]、陜西[26]、四川[14]、遼寧[27]等地成功分離到FAdV4的流行毒株，但尚未有浙江省FAdV4 毒株分離鑒定的研究報道。本研究對2015 年浙江省某雞場剖檢可見明顯的膠凍樣心包積液、肝壞死等病理變化的病死雞肝進行病毒檢測，因其在雞胚傳至第1、2、3 代時雖然均能檢測到目的基因的表達，但傳至第4 代時就檢測不到目的基因的表達，后優(yōu)化方法改用雞胚傳至第3 代的尿囊液接種原代CEK 細胞至11 代，發(fā)現(xiàn)接種CEK 細胞后的每一代均能檢測到目的基因的表達，因此我們采用雞胚接種結合原代CEK 細胞連續(xù)傳代的方法，成功分離到一株FAdV4 浙江株ZJ2015，該毒株的基因組序列與近年流行的毒力增強的FAdV4 毒株序列很相近。該毒株可以在CEK 細胞上穩(wěn)定培養(yǎng)，TCID50達到2.0×106mL-1以上，雖然沒有呈現(xiàn)典型的細胞病變效應，但可以通過本實驗室制備的Fiber-2 和Hexon 多抗血清進行間接免疫熒光和蛋白質印跡反應來檢測病毒蛋白的表達情況。這一毒株的分離，為后續(xù)開展FAdV4 的診斷和防控技術、疫苗開發(fā)及毒力變異機制研究奠定了基礎。

FAdV基因組全長大于43 kb，自2015年全國各地爆發(fā)FAdV4 以來，雖然有較多的毒株分離出來，但只有部分毒株如HLJFAD15（KU991797.1）、JSJ13（KM096544.1）、HB1510（KU587519.1）等（附表2 http://www.zjujournals.com/agr/CN/10.3785/j.issn.1008-9209.2019.03.041）獲得了全基因組序列信息。這些全基因組序列大多采用小片段擴增結合正反向測序的方法[16,23]。本研究擴增ZJ2015毒株全基因組片段時，采用高保真酶結合長距離PCR 擴增法，分11段擴增獲得跨越全基因組的片段，每個片段都有3.6～6.0 kb。雖然連接到pMD18-T 載體的效率相對低一些，但與39 段擴增法[23]相比，顯著減少了pMD18-T 載體連接的后續(xù)鑒定和序列拼接的工作量，為之后反向遺傳系統(tǒng)構建奠定了基礎。

與國外FAdV4 毒株如加拿大分離株ON1（GU188428.1）、日本分離株KR5（HE608152.1）和墨西哥分離株MX-SHP95（KP295475.1）相比，ZJ2015毒株和國內流行的FAdV4毒株中均有一段長為1 966 bp的缺失，LI等推測該段缺失可能與近年國內流行毒株的毒力增強有關[28]，而進一步研究發(fā)現(xiàn)，近年國內流行毒株的毒力增強與這段缺失沒有關系[29]，而是與Hexon和Fiber-2蛋白有關[30]。Hexon蛋白是腺病毒最主要的結構蛋白，與國外ON1（ADQ39061.1）、KR5（CCE39367.1）和MX-SHP95（AKN35186.1）毒株相比，中國株的JSJ13（AIS19793.1）和HB1503（KX421402.1）的hexon 基因編碼701 個氨基酸，ZJ2015 編碼937 個氨基酸，且第189、196 位氨基酸發(fā)生突變，這些突變均發(fā)生在高致病性毒株中，也可能與近年來國內流行毒株的毒力增強有關[30]。Fiber蛋白位于病毒粒子表面，對病毒感染宿主具有重要作用。FAdV-A和FAdV-C的fiber基因能夠編碼Fiber-1和Fiber-2這2個蛋白，其他型的FAdV只編碼一個Fiber蛋白。Fiber-2蛋白因其位于五鄰體頭節(jié)區(qū)，易發(fā)生突變（附表1），目前這些突變位點自2015 年以來在FAdV4 流行毒株毒力變異中的分子機制有待進一步研究。因此，有必要建立有效的反向遺傳系統(tǒng)，并制備特異的Hexon和Fiber-2單克隆抗體，為后續(xù)的毒力變異的分子機制研究奠定基礎。